СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МЕМБРАННОГО БЕЛКА Российский патент 2024 года по МПК C07K1/36 C07K14/705 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение касается способа получения мембранного белка. Способ по изобретению подходит для промышленного применения, при котором должно производиться большое количество мембранных белков. Так, способ направлен на применение технологических операций, подходящих по крайней мере для пилотного производства. В частности, настоящее изобретение направлено на исключение устройства для ультрацентрифугирования.

Уровень техники

Примерно одна треть генов в геноме человека кодирует мембранные белки. Мембранные белки играют роль во многих важных клеточных действиях, включая преобразование энергии, клеточную сигнализацию, межклеточные взаимодействия, клеточную адгезию, миграцию клеток, перенос белков, слияние вирусов, синаптическую активность нейронов и транспорт ионов и метаболитов. Мембранные белки встроены в липидный бислой клеточной мембраны и состоят как из гидрофобных, так и гидрофильных частей.

Недавно мембранные белки были успешно встроены в тонкопленочный композитный слой, посаженный на пористую структурную подложку. Более того, мембранные белки представляют собой важные фармацевтические мишени и интересные объекты для изучения клеточной биологии и биохимии белков. Следовательно, существует потребность в пилотном или крупномасштабном получении мембранных белков.

В WO 2017/137361 (A1) раскрыты самособирающиеся наноструктуры, образующиеся между трансмембранными белками типа водных каналов аквапорина (AQP) и полиалкилениминами (PAI). Самособирающиеся наноструктуры впоследствии включаются в тонкопленочные композитные (TFC) мембраны, посаженные на пористую несущую мембрану. Пористая несущая мембрана может представлять собой полое волокно, плоский лист, спирально-навитую мембрану и т.п. для обратного осмоса или прямого осмоса.

В WO 2013/043118 раскрыты тонкопленочные композитные (TFC) мембраны, в которых водные каналы аквапорина (AQP) встроены в активный слой мембраны. Кроме того, там же раскрыт способ получения тонкопленочных композитных мембран и их применение в процессах фильтрации типа нанофильтрации и осмотической фильтрации. TFC-мембраны содержат везикулы липид-AQP/сополимер-AQP, которые встроены в активный слой TFC. В WO 2010/146365 описано получение фильтрующих мембран TFC-аквапорин-Z (AqpZ), в которых используется амфифильный триблок-сополимер в качестве везикулообразующего вещества для включения иммобилизованного AQP.

В WO 2014/108827 раскрыты модули из полых волокон (HF), содержащие волокна, модифицированные тонкопленочным композитным (TFC) слоем, содержащим водные каналы аквапорина, в которых водные каналы аквапорина встроены в пузырьки перед заключением в слой TFC.

Промышленные способы выделения больших количеств мембранных белков из клеток обычно недоступны специалистам в данной области. На предшествующем уровне техники основное внимание уделялось производству относительно небольших количеств мембранных белков для исследовательских целей. При этом были допустимы сравнительно громоздкие и трудоемкие методы получения. Однако с недавним повышением спроса на мембранные белки в промышленных мембранах для обратного осмоса и прямого осмоса стала очевидной потребность в более эффективном способе получения. Целью настоящего изобретения является обеспечение способа получения мембранных белков, при котором можно получать сравнительно большие количества мембранных белков эффективно и без ухудшения качества конечного продукта.

Cущность изобретения

Настоящим изобретением предусмотрен способ получения мембранного белка, включающий следующие стадии:

a. экспрессирование мембранного белка в организме хозяина, присутствующем в водной среде,

b. высвобождение мембранного белка из организма-хозяина,

c. добавление раствора детергента для солюбилизации мембранного белка,

d. выделение жидкой фракции солюбилизированного мембранного белка в виде супернатанта при центрифугировании,

e. проведение хроматографии жидкой фракции для связывания или удержания мембранного белка на неподвижной фазе, и

f. элюирование мембранного белка из неподвижной фазы элюирующим буфером,

причем центрифугирование на стадии d проводится при от 500 g до 30000 g.

Представленный способ имеет то преимущество, что он позволяет обрабатывать большое количество водной среды, содержащей организм хозяина. Так, способ позволяет обрабатывать количества от 50 л и более типа 100 л и более с применением технологических операций, подходящих для пилотной установки или полномасштабного производства. Более того, процесс является масштабируемым и может быть легко адаптирован к большим количествам водной среды, содержащей организм хозяина.

Неожиданно, авторы изобретения обнаружили, что мембранные белки, экспрессируемые организмом хозяина, солюбилизируются в большей степени, чем другие белки при добавлении раствора детергента. Оказалось, что по меньшей мере 60% белков в везикулах, образованных раствором детергента, являются мембранными белками, представляющими интерес. Кроме того, оказалось, что везикулы, образованные из детергента, имеют большие размеры, чем обычно, примерно 0,5 мкм, что свидетельствует о том, что мембранный белок образует более стабильную суперформу с детергентом, чем с фосфолипидами, используемыми в природе.

В способе может непосредственно использоваться водная среда, содержащая организм хозяина. Однако для получения более чистого продукта и чтобы избежать обращения с избыточным количеством водной среды, как правило, водную среду, содержащую организм хозяина из стадии a, фильтруют перед высвобождением мембранного белка на стадии b.

Как правило, водную среду, содержащую организм хозяина, концентрируют путем фильтрования через фильтр с достаточно мелкими порами, пропускающими клеточные осколки и среду, тогда как клетки остаются. В соответствующем воплощении водную среду, содержащую организм хозяина из стадии a, фильтруют через микрофильтрационную мембрану с диаметром пор 0,5 мкм или меньше. Предпочтительно диаметр пор составляет 0,1 мкм или меньше.

После стадии фильтрования, обычно посредством микрофильтрации, можно отделить организм хозяина от оставшейся водной среды. Хотя возможны несколько способов разделения, однако предпочтительно организм хозяина после фильтрования выделяют путем центрифугирования водной среды, содержащей организм хозяина. Процесс центрифугирования обычно проводят при таком значении g, при котором за соответствующий период времени образуется осадок. Поэтому центрифугирование обычно проводят при 500 g и более, как-то 1000 g и более, а предпочтительно 2000 g и более. Плотность осадка не должна быть слишком большой, чтобы избежать трудностей на последующих стадиях. Поэтому центрифугирование обычно проводят при не выше чем 30000 g, как-то не выше 20000 g, обычно не выше 15000 g и предпочтительно не больше 8000 g.

Клетки собирают в виде осадка, а супернатант можно отбросить. Предпочтительно выделенный организм хозяина промывают изотоническим солевым раствором для растворения примесных солей, а затем центрифугируют, как описано выше, для выделения промытого организма хозяина. Отработанный промывочный раствор, появляющийся в супернатанте, можно отбросить.

Осадок, содержащий промытые клетки, можно хранить путем замораживания при -20°C или использовать непосредственно на следующей стадии. Соответственно, перед стадией b добавляют буфер для разведения. Буфер для разведения может содержать ингибиторы протеаз для предотвращения расщепления мембранного белка, регулирующие pH вещества типа тригидроксиметиламинометана (TRIS) и фосфата для поддержания значения pH в требуемом диапазоне и/или хелаторы ионов типа EDTA.

Мембранный белок можно высвобождать из организма хозяина различными способами, предпочтительно путем химического или механического лизиса клеток. При проведении химического лизиса клеток обычно добавляют водный лизирующий раствор для высвобождения мембранного белка из организма хозяина. В предпочтительном аспекте изобретения водный лизирующий буфер представляет собой раствор детергента, который одновременно солюбилизирует мембранный белок.

Для того, чтобы произошел лизис клеток и солюбилизация мембранного белка, как правило, клетки хозяина подвергают воздействию детергента с перемешиванием. Обычно клеткам хозяина дают возможность реагировать с детергентом в течение по меньшей мере одного часа типа 2 часов, а предпочтительно по меньшей мере 6 часов.

При использовании механического лизиса клеток, как правило, высвобождение мембранного белка из клеток хозяина осуществляется при помощи гомогенизатора. Удобно использовать гомогенизатор того же типа, что применяется в молочной промышленности для гомогенизации молока. Подходящий пример – гомогенизатор Stansted 7575. После обработки в гомогенизаторе клетки разрушаются, высвобождая мембранный белок.

После высвобождения мембранного белка можно добавить катионный флокулянт. Считается, что катионный флокулянт взаимодействует, среди прочего, с отрицательно заряженными клеточными остатками, тем самым образуя хлопья. В предпочтительном аспекте изобретения катионным флокулянтом является полиаминное соединение типа Superfloc C581.

Образование хлопьев обычно происходит не мгновенно. Поэтому предпочтительно, чтобы катионный флокулянт реагировал с клеточным содержимым суспензии с осторожным перемешиванием для образования хлопьев. Обычно катионный флокулянт и остатки клеток оставляют для взаимодействия на время от 10 минут до 2 часов с перемешиванием при комнатной температуре.

При использовании химического лизиса клеток жидкую фракцию из стадии e извлекают в виде супернатанта от центрифугирования суспензии, содержащей хлопья. Мембранный белок появляется в супернатанте по мере его солюбилизации раствором детергента.

При использовании механического лизиса клеток жидкую фракцию из стадии e извлекают из ресуспендированной твердой фракции, причем твердую фракцию ресуспендируют в растворе детергента для солюбилизации мембранного белка. В одном воплощении изобретения твердая фракция образуется вследствие того, что фрагменты клеток, содержащие мембранный белок, взаимодействуют с флокулянтом и образуют хлопья, которые можно отделить от жидкости при центрифугировании. В другом воплощении изобретения неожиданно оказалось, что при использовании механического лизиса клеток можно собрать мембранный белок в осадок без использования флокулянта. Осадок, полученный при центрифугировании, можно ресуспендировать в растворе детергента для солюбилизации мембранного белка. На этой стадии жидкую фракцию из стадии e собирают в виде супернатанта при центрифугировании.

Процесс центрифугирования обычно проводят при таком значении g, при котором за соответствующий период времени образуется осадок. Поэтому центрифугирование обычно проводят при 500 g и более, как-то 1000 g и более, а предпочтительно 2000 g и более. Плотность осадка не должна быть слишком большой, чтобы избежать трудностей на последующих стадиях. Поэтому центрифугирование обычно проводят при не выше чем 30000 g, как-то не выше 20000 g, обычно не выше 10000 g и предпочтительно не больше 8000 g. Применение ускорения менее 30000 g позволяет использовать осветлители, которые обычно используются на молочных предприятиях, как-то центрифуги для удаления спор от GEA, Tetra Pak, Alfa Laval и SPX Flow Seital Separation Technology. Осветлители, используемые в настоящем изобретении, некоторые производители также могут называть бактофугами. Таким образом, настоящим изобретением устраняется применение ультрацентрифуг, которые годятся только для периодического центрифугирования и обработки небольших количеств.

Детергенты, используемые в настоящем изобретении, включают такие алкилмальтопиранозиды, как н-додецил-β-D-мальтопиранозид (DDM), н-децил-β-D-мальтопиранозид (DM) или 5-циклогексилпентил-β-D-мальтозид (Cymal-5); такие алкилглюкопиранозиды, как н-октил-β-D-глюкопиранозид (OG); оксиды аминов типа N-оксида н-лаурилдиметиламина (LDAO); такие фосфохолины, как н-додецилфосфохолин (FC-12), н-тетрадецилфосфохолин (FC-14) или н-гексадецилфосфохолин (FC-16); либо полиоксиэтиленгликоли. В соответствующем воплощении изобретения детергент выбирается из группы, состоящей из N-оксида лаурилдиметиламина (LDAO), октилглюкозида (OG), додецилмальтозида (DDM) либо их комбинаций. Предпочтительным детергентом является LDAO, так как он образует большие и стабильные везикулы, свидетельствующие о том, что этот детергент способен вытеснять природные фосфолипиды.

Жидкую фракцию подвергают процессу хроматографии, при которой мембранный белок связывается с неподвижной фазой или удерживается на ней. Можно выбрать такой тип хроматографии, как аффинная хроматография, ионообменная хроматография, эксклюзионная хроматография, вытеснительная хроматография, жидкостная хроматография, высокоэффективная жидкостная хроматография, обратнофазовая хроматография, хроматография гидрофобных взаимодействий и т.п. Обычно процесс хроматографии является методом препаративной хроматографии, в отличие от аналитической хроматографии, для проведения очистки мембранного белка.

В текущем предпочтительном воплощении в качестве метода хроматографии выбрана аффинная хроматография, при которой первая часть аффинной пары связывается с мембранным белком, а вторая часть аффинной пары связывается с неподвижной фазой. Примеры неподвижной фазы включают шарики и колоночные материалы. В предпочтительном воплощении изобретения неподвижная фаза, связанная со второй частью аффинной пары, находится в колонке. Обычно части аффинных пар связаны ковалентными связями с мембранным белком или с неподвижной фазой. Однако возможны и другие типы ассоциации, как-то гибридизация, аффинное связывание посредством взаимодействия антитело-антиген и т.п.

Специалистам в данной области известен целый ряд аффинных пар, применимых в настоящем изобретении, включая пару биотин-стрептавидин, пары антитело-антиген, пары антитело-гаптен, пары аффинных аптамеров, пары захватывающих белков, пары Fc-рецептор-IgG, пары металл-хелатирующий липид, пары типа хелатирующий металлы липид-белок с гистидиновой меткой (HIS) либо их комбинации. В текущем предпочтительном воплощении аффинная пара представляет собой пару типа хелатирующий металлы липид-белок с гистидиновой меткой (HIS).

Металл обычно иммобилизируют на колоночном материале по технологии, называемой аффинной хроматографией с иммобилизованным металлом (IMAC). Металл обычно выбирают типа Cu(II) или Ni(II), предпочтительно Ni(II). С помощью смолы Ni-NTA можно очищать белки с His-меткой автоматически или вручную. Подходящей неподвижной фазой является ”Capto Chelating” от GE Healthcare или же гель-фильтрующий материал HisTrap (Ni Sepharose 6 Fast Flow) от GE Healthcare.

Первая часть аффинной пары типа гистидиновой метки обычно присоединяется к C-концу мембранного белка. Хотя гистидиновая метка обычно содержит 6 последовательных аминокислот гистидина, однако в настоящем изобретении предпочтительно гистидиновая метка содержит 8 и более молекул гистидина. Большое количество аминокислоты гистидина в гистидиновой метке позволяет эффективно разделять специфически и неспецифически связывающиеся белки.

После нанесения на колонку жидкой фракции, содержащей мембранный белок, жидкость под действием силы тяжести или давления проникает в смолу. Обычно элюирующий буфер содержит имидазол. Имидазол обладает способностью взаимодействовать со связыванием His-метки с ионами металла, иммобилизованными на смоле. При определенной концентрации имидазола будет высвобождаться мембранный белок с His-меткой.

Для отделения неспецифически связывающихся мембранных белков от представляющего интерес мембранного белка обычно колонку перед пропусканием элюирующего буфера промывают промывочным буфером, содержащим имидазол в концентрации, составляющей 40% и менее от его концентрации в элюирующем буфере. Концентрация имидазола в элюирующем буфере обычно составляет от 200 мМ до 2000 мМ. В предпочтительных воплощениях изобретения концентрация имидазола в элюирующем буфере составляет 400 мМ и более. Для более эффективного элюирования мембранного белка с His-меткой концентрация имидазола в буферах обычно составляет 600 мМ или 800 мМ или еще больше.

Для большей части применений His-метка обычно оказывает незначительное влияние на структуру, функцию и иммуногенность белка. Однако для некоторых применений может потребоваться удалить His-метку после того, как она выполнила свою функцию связывания мембранной молекулы с колонкой. His-метку можно удалить путем введения расщепляемой связи между мембранным белком и His-меткой. Подходящие расщепляемые связи включают рН-чувствительные линкеры, дисульфидные линкеры, чувствительные к протеазам линкеры и бета-глюкуронидные линкеры.

Мембранные белки в своем естественном окружении пронизывают всю бислойную мембрану, то есть от внутренней части клетки до внеклеточного пространства. Многие трансмембранные белки функционируют как пропускные ворота для определенных веществ, тем самым обеспечивая обмен этих веществ между внутренней частью клетки и внеклеточной жидкостью. Характерной особенностью трансмембранных белков является наличие гидрофобной зоны, которая обеспечивает встраивание трансмембранного белка в мембрану. Трансмембранный белок также имеет гидрофильные сегменты по обе стороны области полых волокон, причем такие гидрофильные сегменты направлены внутрь клетки и к внеклеточной жидкости, соответственно.

Хотя считается, что можно получить любой мембранный белок в соответствии с настоящим изобретением, но обычно требуется использовать этот процесс для получения таких мембранных белков, которые переносят ионы (ионных каналов) и воду (водных каналов аквапорина). Ионные каналы включают хлорные каналы и переносчики ионов металлов. Некоторые хлорные каналы, помимо иона хлорида, также проводят HCO₃^–, I^–, SCN^– и NO₃^–. Переносчики ионов металлов включают переносчики магния, калиевые каналы, натриевые каналы, кальциевые каналы, протонные каналы и т.д. В определенном воплощении изобретения мембранный белок представлен белком A внешней мембраны (OmpA).

В предпочтительном воплощении изобретения мембранный белок представлен водным каналом аквапорина. Водные каналы аквапорина облегчают транспорт воды в клетку или из клетки. В промышленных мембранах водные каналы аквапорина обеспечивают потоки воды за счет осмоса, тогда как другие компоненты в растворе отклоняются. Мембранный белок типа водного канала аквапорина может происходить из различных источников, включая прокариотические и эукариотические организмы. Прокариотические источники аквапорина включают E. coli, Kyrpidia spormannii, Methanothermobacter sp., Novibacillus thermophilus, Saccharomyces cerevisiae и Halomonas sp. Эукариотические источники аквапорина включают Oryza sativa Japonica (японский рис), Eucalyptus grandis, Solanum tuberosum (картофель) и Milnesium tardigradum (тихоходка “водяной медведь”).

Нуклеотидную последовательность мембранного белка исходного организма обычно оптимизируют по кодонам с помощью Geneart (дочерняя компания Thermo Fischer Scientific) для улучшения экспрессии в организме хозяина. Полученный ген обычно синтезируют с добавлением кодирующих гистидин кодонов на C-конце вместе с фланкирующими рестрикционными сайтами на N-конце и C-конце. Синтетический фрагмент гена можно расщепить рестрикционным ферментом и лигировать с фрагментом вектора. Полученной смесью от лигирования предпочтительно трансформируют организм типа Escherichia coli DH10B. Отбирают трансформанты, устойчивые к антибиотикам, обычно на среде с антибиотиком. Трансформанты проверяют путем секвенирования генетической конструкции. Выделенную из вектора ДНК впоследствии переносят в организм продуцента. Продуцента можно выбрать из числа подходящих прокариотических или эукариотических организмов типа Escherichia coli и Saccharomyces cerevisiae.

Организм хозяина обычно подвергают манипуляциям для экспрессии нативного мембранного белка в большем количестве, чем обычно, или для экспрессии ненативного мембранного белка. Один из способов экспрессии мембранного белка может заключаться в трансформировании организма-хозяина вектором, содержащим ДНК, кодирующую мембранный белок, как обсуждалось выше. Другая возможность получения гиперэкспрессии мембранного белка – повышающая регуляция экспрессии нативного мембранного белка, напр., путем ослабления репрессора или вставки подходящего участка промотора. Еще одна возможность получения экспрессии ненативного белка – трансфекция организма-хозяина вирусом или бактериофагом, содержащим нуклеиновую кислоту, кодирующую мембранный белок.

ПРИМЕРЫ

Пример 1

Получали штамм E. coli BL21, содержащий вектор, продуцирующий белки аквапорина, связанные с His-меткой на C-конце. His-метка содержит 10 последовательных молекул гистидина, прикрепленных к первичной последовательности мембранного белка аквапорина.

Штамм E. coli культивировали в стандартной среде для получения ферментационного бульона общим объемом 150 л. Клетки E. coli собирали путем фильтрования ферментационного бульона через микрофильтрационную мембрану с диаметром пор 0,05 мкм. Фильтрат, содержащий клетки E. coli, доводили примерно до 50 л, а затем подвергали центрифугированию при 5300 g в течение 20 минут. Таким образом, клетки E. coli концентрируются при микрофильтрации, а оставшаяся среда впоследствии удаляется при центрифугировании в виде супернатанта.

Полученные при центрифугировании осадок собирали и добавляли 0,9% хлорид натрия в соотношении 1:1 для промывки клеток и растворения примесных солей. Затем промывочный раствор удаляли на центрифуге при 5300 g в течение 20 минут. Супернатант отбрасывали, а промытые клетки собирали в виде осадка. Осадок можно хранить замороженным при –20°C или использовать непосредственно на следующей стадии.

Осадок, содержащий клетки E. coli, солюбилизировали примерно в 47 л буфера TRIS, используемого в качестве связывающего буфера. После перемешивания в течение примерно 1 часа добавляли 6,4 л детергента (5% LDAO) для солюбилизации до конечной концентрации 0,6%. Смесь инкубировали в течение ночи при комнатной температуре с осторожным перемешиванием. При ресуспендировании клеток в буфере, содержащем детергент, происходит лизис клеток. При лизисе клеток высвобождаются мембранные белки из внутренних мембран клеток и солюбилизируются детергентом.

Для удаления отрицательно заряженного клеточного материала добавляли полиамин (Superfloc C581) в объеме 427 мл. Смесь инкубировали 30 минут с перемешиванием при комнатной температуре для коагуляции отрицательно заряженных молекул типа обломков клеток, ДНК, РНК и, в некоторой степени, белков. Мембранные белки, солюбилизированные детергентом, остаются в водной фазе. Смесь центрифугировали при максимальной скорости в 5300 g в течение 15 мин. Осадок, содержащий клеточный дебрис, ДНК, РНК и солюбилизованные белки, отбрасывали, а супернатант собирали. Супернатант переносили в ёмкость, содержащую 107 л буфера для разведения, получая конечный объем 160 л при конечной концентрации лаурилдиметиламин N-оксида (LDAO) 0,2%.

Устанавливали колонку, содержащую аффинную смолу “Capto Chelating” от GE Healthcare. Смола заряжена Ni²⁺, который связывается с меткой His10. На колонку наносили разбавленный супернатант, а затем промывали 10 колоночными объемами промывочного буфера, содержащего 200 мМ имидазола, чтобы смыть компоненты неспецифического связывания. После этого использовали 2,5 колоночных объема элюирующего буфера с 1000 мМ имидазола для высвобождения мембранного белка из колонки. Элюированный из колонки белок проверяли методом электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE), который проявлял главным образом одну полосу, что означает чистоту более 80%.

Пример 2

Получали штамм E. coli BL21, содержащий вектор, продуцирующий белки аквапорина, связанные с His-меткой на C-конце. His-метка содержит 10 последовательных молекул гистидина, прикрепленных к первичной последовательности мембранного белка аквапорина.

Штамм E. coli культивировали в стандартной среде для получения ферментационного бульона общим объемом 250 л. Клетки E. coli собирали путем фильтрования ферментационного бульона через плоскую пластинчатую мембрану из PES с диаметром пор 0,05 мкм. Фильтрат, содержащий клетки E. coli, доводили примерно до 50 л, а затем подвергали центрифугированию при 5300 g в центрифуге Sorvall 16 L в течение 20 минут. Таким образом, клетки E. coli концентрируют при микрофильтрации, а оставшуюся среду впоследствии удаляют при центрифугировании в виде супернатанта. Осадок можно хранить замороженным при –20°C или использовать непосредственно на следующей стадии.

Осадок, содержащий клетки E. coli, ресуспендировали примерно в 50 л буфера (водный раствор с ингибитором протеаз PMSF и EDTA) и гомогенизировали при 1000 бар в гомогенизаторе Stansted nm-GEN 7575. Для выделения представляющего интерес клеточного материала добавляли полиамин (Superfloc C581) в соотношении 12 мл/л. Поддерживали температуру на уровне 10-15°C. Смесь инкубировали 30 мин с перемешиванием при комнатной температуре. Смесь центрифугировали при максимальной скорости 5300 g в течение 30 мин. Осадок содержит мембранный белок, а супернатант отбрасывали.

Осадок ресуспендировали в 0,9% растворе хлорида натрия до общей концентрации белка примерно 50 мг/мл. Солюбилизацию мембранного белка проводили путем добавления 28 л связывающего буфера TRIS и 4,5 л 5% LDAO к 5 л ресуспендированного материала осадка. Смеси инкубировали от 2 до 24 часов при комнатной температуре с осторожным перемешиванием.

После процесса солюбилизации смесь центрифугировали в ёмкостях на 2 л при 5300 g в течение 90 мин. Собирали супернатант и доводили концентрацию LDAO до 0,2% добавлением буфера для разведения.

Устанавливали колонку, содержащую аффинную смолу “Capto Chelating” от GE Healthcare. Смола заряжена Ni²⁺, который связывается с меткой His10. Колонку уравновешивали пропусканием связывающего буфера, содержащего 0,2% LDAO. После этого на колонку наносили разбавленный супернатант и промывали 10 колоночными объемами промывочного буфера, содержащего 200 мМ имидазола, чтобы смыть компоненты неспецифического связывания. После этого использовали 2,5 колоночных объема элюирующего буфера с 1000 мМ имидазола для высвобождения мембранного белка из колонки. Элюированный из колонки белок проверяли методом электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE), который проявлял только одну полосу, что означает чистоту более 95%.

Пример 3

Получали штамм E. coli BL21, содержащий вектор, продуцирующий белки аквапорина, связанные с His-меткой на C-конце. His-метка содержит 10 последовательных молекул гистидина, прикрепленных к первичной последовательности мембранного белка аквапорина.

Штамм E. coli культивировали в стандартной среде для получения ферментационного бульона общим объемом 250 л. Ферментационный бульон собирали при OD₆₀₀ = 13 после индукции в течение 42,5 часов. Материал гомогенизировали дважды при 100 МПа в гомогенизаторе Stansted nm-GEN 7575. Из лизированного материала отбирали по 10 мл и вносили в пробирки Falcon на 15 мл.

Затем проводили центрифугирование в течение 1 часа при 5300 g и отделяли осадок от супернатанта. Затем осадок ресуспендировали в 10 мл 0,9% NaCl. Для определения концентрации (общего белка в мг/мл) в ресуспендированном осадке и выделенном после первого центрифугирования супернатанте использовали метод с использованием набора реагентов для определения белка с помощью бицинхониновой кислоты (BCA).

Наконец, ресуспендированный осадок и выделенный супернатант солюбилизировали (1 мл) в течение 2 часов в 0,6% LDAO (120 мкл исходного 5% LDAO от Carbosynth на 1 мл материала) и снова центрифугировали при 5300 g в течение 15 мин. Опять же отделяли супернатант от осадка. Осадок ресуспендировали (опять до 1 мл) в связывающем буфере без LDAO.

Все образцы анализировали на SDS-геле, который показал, что около 60% белков в супернатанте представляют мембранный белок аквапорин.

Пример 4

После очистки аквапорина Z в примере 2 измеряли распределение по размерам солюбилизированного белка в LDAO.

Проводили сравнение одного и того же элюирующего буфера с белком и без него, чтобы оценить, влияют ли компоненты буфера (включая детергент) или мембранный белок на распределение частиц по размерам.

Белок аквапорин Z элюировали из колонки IMAC, используя элюирующий буфер с 1000 мМ имидазола и 0,2% вес/об LDAO. В очищенном белке измеряли концентрацию белка методом аминокислотного анализа. Прозрачный солюбилизированный белок при 6,44 мг/мл в элюирующем буфере вносили в 3 отдельные кюветы (Sarstedt, 4 мл, PMMA, кат. № 67.755, Nümbrecht, Германия) и анализировали распределение по размерам на Malvern Zetasizer Nano-ZS (Malvern Instruments Ltd., Malvern, UK) с помощью программы Malvern Zetasizer v.7.02. Результаты приведены в табл. 1 и представляют средние значения для образцов по трем повторам.

Таблица 1

Образец Концентрация AqpZ (мг/мл) Размер, диаметр (d в нм) Интенсивность популяции (%) Population intensity Поп. 1 Поп. 2 Поп. 3 Очищенный AqpZ в элюир. буфере (средн.) 6,44 315,6 ± 116,8 нм
45,9% 108 ± 32,3 нм
35,5% 17,1 ± 2,5 нм
14,9% Элюирующий буфер 0 0,85 ± 0,16 нм
56,8% 8,6 ± 1,2 нм
41,1% 103 ± 5,5 нм
2,1%

Образец элюирующего буфера (без белка) содержал популяцию частиц, в которой 97,9% составляли частицы размером 8,6 нм и меньше, что указывает на отсутствие в растворе крупных мицелл детергента, которые могли бы удерживаться при микрофильтрации. В образце с белком 81,4% частиц проявляли размеры 108 нм и больше, что указывает на то, что в присутствии белка вместе с детергентом образуются крупные растворимые частицы, которые удерживаются при микрофильтрации. Неожиданно эксперимент показал, что образуются большие стабильные частицы, состоящие из мицелл LDAO и мембранного белка.

Пример 5. Экспрессия аквапорина с гистидиновой меткой из Oryza sativa Japonica (японского риса) в Escherichia coli и его очистка с помощью IMAC

Ген, кодирующий аквапорин из Oryza sativa Japonica (UNIPROT: A3C132), оптимизировали по кодонам с помощью Geneart (дочерняя компания Thermo Fischer Scientific) для улучшения экспрессии в E. coli. Полученный ген синтезировали с добавлением 10 кодирующих гистидин кодонов на C-конце вместе с фланкирующими рестрикционными сайтами NdeI/XhoI на N-конце и C-конце, соответственно (идентификатор гена: aquaporin_Oryza_sativa_Japonica). Синтетические фрагменты гена расщепляли рестрикционными ферментами NdeI/XhoI и лигировали с расщепленным NdeI/XhoI очищенным фрагментом вектора pUP1909. Полученной смесью от лигирования трансформировали Escherichia coli DH10B и отбирали устойчивые к канамицину трансформанты на чашках с LB-агаром и канамицином. Трансформанты проверяли путем секвенирования генетической конструкции. Выделенную из вектора ДНК впоследствии переносили в организм продуцента, Escherichia coli BL21.

Для гетерологической экспрессии аквапорина в E. coli организм-продуцент культивировали в минимальной среде, состоящей из 30 г/л глицерина, 6 г/л (NH₄)₂HPO₄, 3 г/л KH₂PO₄, 5 г/л NaCl, 0,25 г/л MgSO₄⋅7H₂O, 0,4 г/л цитрата Fe(III) и 1 мл/л стерилизованно-го фильтрованием раствора микроэлементов. Раствор микроэлементов состоял из 1 г/л EDTA, 0,8 г/л CoCl₂⋅6H₂O, 1,5 г/л MnCl₂⋅4H₂O, 0,4 г/л CuCl₂⋅2H₂O, 0,4 г/л H₃BO₃, 0,8 г/л Na₂MoO₄⋅2H₂O, 1,3 г/л Zn(CH₃COO)₂⋅2H₂O. После инокуляции и роста в течение ночи добавляли еще 0,25 г/л MgSO₄⋅7H₂O.

E. coli культивировали в 3-литровых биореакторах Applikon с ez-Control в режиме периодической ферментации. Продукцию белка индуцировали добавлением IPTG до конечной концентрации 0,5 мМ при оптической плотности (OD 600 нм) примерно 30. Культуры индуцировали в течение примерно 24 часов и собирали бактериальные клетки центрифугированием при 5300 g в течение 20 мин.

Осадок, содержащий клетки E. coli, ресуспендировали в буфере (водный раствор с ингибитором протеаз фенилметилсульфонил фторидом (PMSF) и ЭДТК) и гомогенизировали при 1000 бар в гомогенизаторе Stansted nm-GEN 7575. Поддерживали температуру на уровне 10-15°C. Смесь центрифугировали при максимальной скорости 5300 g в течение 30 мин. Осадок содержит мембранный белок, а супернатант отбрасывали.

Осадок ресуспендировали в 0,9% растворе хлорида натрия до общей концентрации белка примерно 50 мг/мл. Солюбилизацию мембранного белка проводили путем добавления 28 л связывающего буфера TRIS и 4,5 л 5% LDAO к 5 л ресуспендированного материала осадка. Смеси инкубировали от 2 до 24 часов при комнатной температуре с осторожным перемешиванием.

После процесса солюбилизации смесь центрифугировали в ёмкостях на 2 л при 5300 g в течение 90 мин. Собирали супернатант и доводили концентрацию LDAO до 0,2% добавлением буфера для разведения.

После солюбилизации и осветления белок захватывали на IMAC и элюировали элюирующим буфером, содержащим 1000 мМ имидазола и 0,2% вес/об LDAO. Элюированные фракции анализировали методом SDS-PAGE, который проявлял только одну главную полосу, которая мигрировала при 27 кДа, что соответствует размеру аквапорина из японского риса. Кроме того, результат проверяли путем сравнения с очисткой отрицательного контроля из E. coli, трансформированных пустым вектором. Отрицательный контроль не давал очищенного белка. Анализ методом вестерн-блот с помощью антител (TaKaRa Bio), специфичных к гистидиновой метке, давал, как и ожидалось, четкий сигнал от очищенного белка и никакого сигнала от отрицательного контроля, что подтверждает происхождение очищенного белка как мембранного белка с гистидиновой меткой.

Пример 6. Экспрессия аквапорина с гистидиновой меткой из Eucalyptus grandis в Escherichia coli и его очистка с помощью IMAC

Ген, кодирующий аквапорин из Eucalyptus grandis (UNIPROT: A0A059C9Z4), оптимизировали по кодонам с помощью Geneart (дочерняя компания Thermo Fischer Scientific) для улучшения экспрессии в E. coli. Полученный ген синтезировали с добавлением 10 кодирующих гистидин кодонов на C-конце вместе с фланкирующими рестрикционными сайтами NdeI/XhoI на N-конце и C-конце, соответственно (идентификатор гена: aquaporin_Eucalyptus_grandis). Ген клонировали и экспрессировали, как описано в Примере 5. Белок был успешно очищен и проверен, как описано в Примере 5.

Пример 7. Экспрессия аквапорина с гистидиновой меткой из Solanum tuberosum (датского картофеля) в Escherichia coli и его очистка с помощью IMAC

Ген, кодирующий аквапорин из Solanum tuberosum (UNIPROT: Q38HT6), оптимизировали по кодонам с помощью Geneart (дочерняя компания Thermo Fischer Scientific) для улучшения экспрессии в E. coli. Полученный ген синтезировали с добавлением 10 кодирующих гистидин кодонов на C-конце вместе с фланкирующими рестрикционными сайтами NdeI/XhoI на N-конце и C-конце, соответственно (идентификатор гена: aquaporin_Solanum_tuberosum). Ген клонировали и экспрессировали, как описано в Примере 5. Белок был успешно очищен и проверен, как описано в Примере 5.

Пример 8. Экспрессия аквапорина с гистидиновой меткой из Milnesium tardigradum (тихоходки) в Escherichia coli и его очистка с помощью IMAC

Ген, кодирующий аквапорин из Milnesium tardigradum (UNIPROT: G5CTG2), оптимизировали по кодонам с помощью Geneart (дочерняя компания Thermo Fischer Scientific) для улучшения экспрессии в E. coli. Полученный ген синтезировали с добавлением 10 кодирующих гистидин кодонов на C-конце вместе с фланкирующими рестрикционными сайтами NdeI/XhoI на N-конце и C-конце, соответственно (идентификатор гена: aquaporin_Milnesium_tardigradum). Ген клонировали и экспрессировали, как описано в Примере 5. Белок был успешно очищен и проверен, как описано в Примере 5.

Пример 9. Экспрессия аквапорина с гистидиновой меткой из Halomonas sp. в Escherichia coli и его очистка с помощью IMAC

Ген, кодирующий аквапорин из Halomonas sp. (UNIPROT: A0A2N0G6U6), оптимизировали по кодонам с помощью Geneart (дочерняя компания Thermo Fischer Scientific) для улучшения экспрессии в E. coli. Полученный ген синтезировали с добавлением 10 кодирующих гистидин кодонов на C-конце вместе с фланкирующими рестрикционными сайтами NdeI/XhoI на N-конце и C-конце, соответственно (идентификатор гена: aquaporin_Halomonas_sp). Ген клонировали и экспрессировали, как описано в Примере 5. Белок был успешно очищен и проверен, как описано в Примере 5.

Пример 10. Экспрессия аквапорина с гистидиновой меткой из Kyrpidia spormannii в Escherichia coli и его очистка с помощью IMAC

Ген, кодирующий аквапорин из Kyrpidia sp. (UNIPROT: A0A2K8N5Z5), оптимизировали по кодонам с помощью Geneart (дочерняя компания Thermo Fischer Scientific) для улучшения экспрессии в E. coli. Полученный ген синтезировали с добавлением 10 кодирующих гистидин кодонов на C-конце вместе с фланкирующими рестрикционными сайтами NdeI/XhoI на N-конце и C-конце, соответственно (идентификатор гена: aquaporin_Kyrpidia_spormannii). Ген клонировали и экспрессировали, как описано в Примере 5. Белок был успешно очищен и проверен, как описано в Примере 5.

Пример 11. Экспрессия аквапорина с гистидиновой меткой из Methanothermobacter sp. в Escherichia coli и его очистка с помощью IMAC

Ген, кодирующий аквапорин из Methanothermobacter sp. (UNIPROT: A0A223ZC Q2), оптимизировали по кодонам с помощью Geneart (дочерняя компания Thermo Fischer Scientific) для улучшения экспрессии в E. coli. Полученный ген синтезировали с добавлением 10 кодирующих гистидин кодонов на C-конце вместе с фланкирующими рестрикционными сайтами NdeI/XhoI на N-конце и C-конце, соответственно (идентификатор гена: aquaporin_Methanothermobacter_sp). Ген клонировали и экспрессировали, как описано в Примере 5. Белок был успешно очищен и проверен, как описано в Примере 5.

Пример 12. Экспрессия аквапорина с гистидиновой меткой из Novibacillus thermophilus sp. в Escherichia coli и его очистка с помощью IMAC

Ген, кодирующий аквапорин из Novibacillus thermophilus (UNIPROT: A0A1U9K5 R2), оптимизировали по кодонам с помощью Geneart (дочерняя компания Thermo Fischer Scientific) для улучшения экспрессии в E. coli. Полученный ген синтезировали с добавлением 10 кодирующих гистидин кодонов на C-конце вместе с фланкирующими рестрикционными сайтами NdeI/XhoI на N-конце и C-конце, соответственно (идентификатор гена: aquaporin_Novibacillus_thermophilus). Ген клонировали и экспрессировали, как описано в Примере 5. Белок был успешно очищен и проверен, как описано в Примере 5.

Пример 13. Экспрессия белка A внешней мембраны (OmpA) из Escherichia coli в E. coli

Экспрессию и очистку OmpA (UNIPROT: P0A910) в E. coli проводили в основном, как описано в Примере 5, за исключением того, что E. coli трансформировали пустым вектором, а солюбилизацию продлевали до 24 часов. Полученный солюбилизированный белок имел чистоту примерно 30-50% по SDS-PAGE, что четко означает, что OmpA был успешно выделен в мембранной фракции после стандартной процедуры очистки. OmpA можно было бы дополнительно очистить на дополнительной стадии эксклюзионной хроматографии (SEC).

Пример 14. Конструирование штамма Saccharomyces cerevisiae, экспрессирующего аквапорин-Z (AqpZ) из Escherichia coli, слитый с yEGFP с N-концевой гистидиновой меткой и разделенный сайтом расщепления протеазы вируса гравировки табака (TEV)

AqpZ (UNIPROT ID: P60844) из E. coli оптимизировали по кодонам для экспрессии в S. cerevisiae с помощью сервиса Geneart для улучшения экспрессии в S. cerevisiae. Для экспрессии в S. cerevisiae AqpZ сливали с дрожжевым усиленным зеленым флуоресцентным белком (yEGFP) на N-конце (Brendan P. Cormack et al., Microbiology (1997), 143, 303-311), чтобы обеспечить визуальное обнаружение и измерение экспрессии мембранного белка. Кроме того, добавляли 8 гистидинов (His8) на N-конец yEGFP в качестве метки-тега для очистки по IMAC. His8-yEGFP и AqpZ были генетически разделены сайтом расщепления для протеазы TEV, включенным с помощью ПЦР-праймеров при конструировании.

Быстрое и эффективное конструирование плазмиды, кодирующей слитый белок His8-yEGFP-TEV-AqpZ, проводили путем гомологической рекомбинации in vivo перекрывающихся участков, включенных при помощи праймеров в S. cerevisiae между ПЦР-фрагментом His8-yEGFP-TEV, ПЦР-фрагментом TEV-AqpZ и линеаризованной экспрессионной плазмидой, полученной при расщеплении с помощью SalI, HindIII и BamHI плазмиды pEMBLyex4, как описано в (Scientific Reports 7: 16899). Сайт расщепления для TEV обеспечивает последующее удаление белка His8-yEGFP при помощи протеазы TEV.

Отбор трансформантов S. cerevisiae проводили на чашках с минимальной средой, дефицитной по урацилу, но с добавлением лейцина и лизина для обеспечения выживания бактериальных клеток с правильно рекомбинированными фрагментами ДНК. Состав среды и концентрации аминокислот, используемые в этом примере, были идентичны тем, которые приведены в Примере 15.

Пример 15. Экспрессия His8-yEGFP-TEV-AqpZ в Saccharomyces cerevisiae

Одиночные колонии трансформированных дрожжевых клеток избирательно размножали до насыщения в 5 мл минимальной среды с глюкозой и с добавлением 60 мг/л лейцина и 30 мг/л лизина. По 200 мкл этих культур впоследствии размножали в 5 мл минимальной среды с глюкозой и с добавлением 30 мг/л лизина для отбора на высокое число копий плазмиды. Готовили замороженные исходные образцы клеток с высоким числом копий плазмиды.

Вносили 200 мкл размороженного исходного раствора в 10 мл минимальной среды с добавлением лизина и культивировали до насыщения. Переносили 1 мл этой культуры в 100 мл такой же среды. После роста в течение ночи переносили аликвоту, соответствующую конечному OD₆₀₀ = 0,05, в 1,5 литра минимальной среды с начальной концентрацией 20 г/л глюкозы в качестве источника углерода и 30 г/л глицерина с добавлением дополнительных аминокислот. Культуру выращивали в 3-литровом биореакторе Applikon^®, снабженном системой ez-Control, подключенной к ПК с рабочей программой Lucullus^® (Applikon, Голландия, и SecureCell, Швейцария).

Начальную часть ферментации проводили при 20°C в минимальной среде. В биореактор подавали глюкозу до конечной концентрации 3% вес/об, когда израсходовалось исходное количество глюкозы. Значение pH среды роста поддерживали на уровне 6,0 добавлением 1 М NH₄OH под контролем компьютера. Когда выделение CO₂ выровнялось вследствие ограниченного поступления глюкозы, биореактор охлаждали до 15°C перед индукцией вырабатывания рекомбинантного AQP. Экспрессию рекомбинантного белка запускали добавлением 50 мл/л экспрессионной среды, состоящей из 400 мл/л ASD-10, 400 мл/л дополнительных аминокислот, 200 г/л глицерина и 20 г/л галактозы. Дрожжевые клетки собирали через ~96 ч.

Минимальная среда состояла из 20 г/л глюкозы, 100 мл/л ASD-10, 5 мл/л V-200, 30 г/л глицерина, 0,1 г/л CaCl₂. Смесь ASD-10 состояла из 50 г/л (NH₄)₂SO₄, 8,75 г/л KH₂PO₄, 1,25 г/л K₂HPO₄, 5 г/л MgSO₄⋅7H₂O, 1 г/л NaCl, 5 мг/л H₃BO₃, 1 мг/л KI, 4 мг/л MnSO₄⋅1H₂O, 4,2 мг/л ZnSO₄⋅7H₂O, 0,4 мг/л CuSO₄⋅5H₂O, 2 мг/л FeCl₃ и 2 мг/л Na₂MoO₄⋅2H₂O. Смесь V-200 состояла из 4 мг/л биотина, 400 мг/л D-пантотеновой кислоты, 0,4 мг/л фолиевой кислоты, 2000 мг/л мио-инозитола, 80 мг/л ниацина, 40 мг/л п-аминобензоата, 80 мг/л пиридоксина, 40 мг/л рибофлавина и 80 мг/л тиамина. Если указано, среда содержала дополнительные аминокислоты, которые состояли из 600 мг/л аланина, 600 мг/л аргинина, 600 мг/л цистеина, 3000 мг/л глутаминовой кислоты, 2000 мг/л лизина, 600 мг/л метионина, 1500 мг/л фенилаланина, 600 мг/л пролина, 10000 мг/л серина, 900 мг/л тирозина, 4500 мг/л валина, 2000 мг/л аспарагиновой кислоты, 4000 мг/л треонина, 600 мг/л гистидина и 600 мг/л триптофана.

Пример 16. Клонирование His8-yEGFP-TEV-AQP5 из Milnesium tardigradum в биореакторе с Saccharomyces cerevisiae

Получали конструкцию His8-yEGFP-TEV-AQP5 по методике, изложенной в Примере 14. Белок AQP5 из M. tardigradum (UNIPROT: G5CTG2) оптимизировали по кодонам для экспрессии в E. coli, несмотря на то, что требовалась экспрессия в дрожжах.

Пример 17. Очистка His8-yEGFP-TEV-AqpZ и His8-yEGFP-TEV-AQP5 из S. cerevisiae

Очистку экспрессированного гетерологически мембранного белка из S. cerevisiae проводили, как описано в Примере 2, за исключением того, что применяемые объемы буфера уменьшали так, чтобы они соответствовали снижению объема культуры, а лизис проводили при 1800 бар. Продукция и чистота белка была успешно подтверждена для обоих слитых белков методами SDS-PAGE и вестерн-блоттинга и не было обнаружено никаких примесных белков.

Изобретение относится к способу получения мембранного белка в пилотном или промышленном масштабе, включающему следующие стадии: a) экспрессия этого мембранного белка в организме-хозяине, присутствующем в водной среде, b) i) высвобождение мембранного белка из организма-хозяина путем механического лизиса клеток организма-хозяина с образованием фрагментов лизированных клеток, включающих этот мембранный белок и ii) выделение фрагментов лизированных клеток, включающих этот мембранный белок, в виде твердой фракции путем центрифугирования, c) добавление раствора детергента к ресуспендированной твердой фракции, полученной в b) для солюбилизации мембранного белка, d) выделение жидкой фракции солюбилизированного мембранного белка, полученного в c), в виде супернатанта центрифугированием, e) проведение хроматографии жидкой фракции для связывания или удержания мембранного белка на неподвижной фазе и f) элюирование мембранного белка из неподвижной фазы элюирующим буфером, чтобы получить указанный мембранный белок, причем центрифугирование на стадии d) проводится при от 500 до 30000 g, и указанный способ не включает ультрацентрифугирования жидкой фракции, полученной в d). Способ позволяет эффективно получать сравнительно большие количества мембранных белков без ухудшения качества конечного продукта. 17 з.п. ф-лы, 17 пр.

1. Способ получения мембранного белка в пилотном или промышленном масштабе, включающий следующие стадии:

a) экспрессия этого мембранного белка в организме-хозяине, присутствующем в водной среде,

b) i) высвобождение мембранного белка из организма-хозяина путем механического лизиса клеток организма-хозяина с образованием фрагментов лизированных клеток, включающих этот мембранный белок, и

ii) выделение фрагментов лизированных клеток, включающих этот мембранный белок, в виде твердой фракции путем центрифугирования,

c) добавление раствора детергента к ресуспендированной твердой фракции, полученной в b) для солюбилизации мембранного белка,

d) выделение жидкой фракции солюбилизированного мембранного белка, полученного в c), в виде супернатанта центрифугированием,

e) проведение хроматографии жидкой фракции для связывания или удержания мембранного белка на неподвижной фазе и

f) элюирование мембранного белка из неподвижной фазы элюирующим буфером, чтобы получить указанный мембранный белок,

причем центрифугирование на стадии d) проводится при от 500 до 30000 g, и указанный способ не включает ультрацентрифугирования жидкой фракции, полученной в d).

2. Способ по п. 1, при этом водная среда, содержащая организм-хозяин из стадии a), фильтруется перед высвобождением мембранного белка из организма хозяина на стадии b).

3. Способ по п. 2, при этом водная среда, содержащая организм-хозяин из стадии a), фильтруется через микрофильтрационную мембрану с диаметром пор 0,5 мкм или меньше.

4. Способ по п. 2, при этом организм-хозяин выделяют путем центрифугирования водной среды, содержащей организм-хозяин.

5. Способ по любому из пп. 1-4, при этом центрифугирование проводится при от 1000 до 10000 g.

6. Способ по любому из пп. 1-5, при этом перед стадией b) добавляют буфер для разведения.

7. Способ по любому из пп. 1-6, при этом высвобождение мембранного белка из клеток-хозяев проводится при помощи гомогенизатора.

8. Способ по любому из пп. 1-7, при этом к солюбилизированному мембранному белку в жидкой фракции из d) добавляют катионный флокулянт для образования суспензии перед центрифугированием.

9. Способ по п. 8, при этом катионным флокулянтом является полиаминное соединение.

10. Способ по п. 8 или 9, при этом катионный флокулянт оставляют реагировать с клеточным содержимым ресуспензии с осторожным перемешиванием для образования хлопьев.

11. Способ по п. 10, при этом жидкую фракцию со стадии d) извлекают в виде супернатанта от центрифугирования суспензии, содержащей хлопья.

12. Способ по любому из пп. 1-11, при этом раствор детергента, добавленный в c), выбран из группы, состоящей из N-оксида лаурилдиметиламина (LDAO), октилглюкозида (OG), додецилмальтозида (DDM) либо их комбинаций.

13. Способ по любому из пп. 1-12, при этом мембранный белок связывается с первой частью аффинной пары, а неподвижная фаза связывается со второй частью аффинной пары.

14. Способ по п. 13, при этом первая часть аффинной пары представляет собой гистидиновую метку.

15. Способ по п. 14, при этом гистидиновая метка содержит 8 или больше молекул гистидина.

16. Способ по любому из пп. 1-15, при этом элюирующий буфер содержит имидазол.

17. Способ по п. 16, при этом неподвижная фаза, способная связывать или удерживать мембранный белок, находится в колонке, и эту колонку промывают перед пропусканием элюирующего буфера промывочным буфером, содержащим имидазол в концентрации, составляющей 40% или менее, в элюирующем буфере.

18. Способ по п. 16 или 17, при этом концентрация имидазола в элюирующем буфере составляет 400 мМ или более.