Способ поддержания маточной культуры энтомофага Trichogramma dendrolimi Российский патент 2024 года по МПК A01K67/33 

Изобретение относится к области лесного хозяйства, в частности способ применим для поддержания маточной культуры Trichogramma dendrolimi (Matsumura, 1926) направленного на сохранение нативных биологических показателей энтомофага, определяющих его качество и сохранение специфичности по отношению к естественному хозяину – сибирскому шелкопряду (Dendrolimus sibiricus Tschetv., 1908), для последующего эффективного применения в целях биологической борьбы с сибирским шелкопрядом.

Известны способы массового разведения и поддержания маточной культуры энтомофага рода Trichogramma, где в основе лежит использование различных суррогатных хозяев: Мельничной огневки (Ephestia kuehniella Zeller, 1879), Китайского дубового шелкопряда (Antheraea pernyi Guerin-Meneville, 1855), Рисовой моли (Corcyra cephalonica Stainton, 1866) и Зерновой моли (Sitotroga cerealella Oliv.), обеспечивающих как экономическую целесообразность массового производства энтомофага, так и возможность поддержания в поколениях определенных ее качественных показателей обеспечивающих сохранение маточной культуры.

Чаще всего, при производстве трихограммы применяется технология, предусматривающая использование единственного суррогатного хозяина, за счет которого обеспечивается массовая наработка биопрепарата с одновременным поддержанием маточной культуры. Наибольшую применимость получил способ, основанный на использовании, в качестве суррогатного хозяина, зерновой моли (S. cerealella).

Например, известна технология массового производства трихограммы [1], применение которой позволяет эффективно накапливать необходимое

количество энтомофагов в качестве уже готового средства биологической защиты, а для цели поддержания маточной культуры предлагается проводить омоложение за счет систематических сборов особей энтомофага из природной популяции и вливания их в культурную популяцию.

Однако этот подход требует значительных усилий, направленных на таксономический контроль вносимой из природы трихограммы, и применим только для условий агроценозов.

Также известен способ массового разведения трихограммы [2], где для цели повышения продуктивности трихограммы предлагается совместное содержание энтомофага и яиц зерновой моли в полной темноте с момента заражения с последующим выращиванием преимагинальной стадии трихограммы в контролируемых условиях. Данный способ может обеспечить увеличение доли выхода энтомофага в качестве готового средства биоконтроля.

Недостатком этого способа заключается в том, что способ не применим для цели поддержания у лабораторной культуры T. dendrolimi его природных качественных характеристик и специфичности по отношению к естественному хозяину в силу того, что по сравнению с яйцами естественного хозяина (сибирского шелкопряда), размер яиц зерновой моли значительно меньше и в них развиваются одиночные некрупные особи энтомофага, что в свою очередь отрицательно сказывается на последующей плодовитости и продолжительности жизни имаго приводящие к постепенному вырождению маточной культуры.

Другой альтернативой являются известные способы выращивания энтомофага на хозяевах, откладывающих крупные яйца, что позволяет выращивать в них более крупных особей трихограммы. Например, для целей биологической защиты лесных насаждений от Dendrolimus punctatus, Walker, известен способ выращивания T. dendrolimi на яйцах дубового шелкопряда (A. pernyi), использование которых позволяет получать порядка 70 особей нормально развитых крупных имаго с одного яйца [3], что обеспечивает сохранение биологических показателей энтомофага. В этом случае, главным недостатком является то, что данный вид суррогатного хозяина распространен в Юго-Восточной Азии и для разведения трихограммы их массово изымают из естественных условий, либо в искусственных условиях воспитывают на естественных кормовых породах, что в общем технологически не является приемлемым для разведения трихограммы в природноклиматических условиях Северной Азии.

Аналогичным недостатком, для условий Северной Азии, обладает способ выращивание лабораторных популяций видов рода Trichogramma [4], предусматривающий использование в качестве суррогатного хозяина дубового шелкопряда породы Полесский тассар, массовое выращивание которого осуществляют на зеленой фитомассе дуба.

Все приведенные выше способы дают возможность осуществлять массовую наработку энтомофага в качестве готового биопрепарата и при определенных условиях поддерживать маточную культуру трихограммы, но только в тех природно-климатических зонах, где планируется ее применение.

Из приведенных, наиболее близким аналогом является способ выращивания T. dendrolimi на яйцах дубового шелкопряда (A. pernyi) [3]. Учитывая то, что сибирский шелкопряд является семивольтийным видом имеющий облигатную диапаузу в личиночной фазе развития и не может быть применим для круглогодичного выращивания T. dendrolimi, для цели поддержания маточной культуры энтомофага T. dendrolimi – специализирующегося на естественном хозяине в условиях Северной Азии, необходим такой технологический подход, который обеспечивал бы полноценное развитие особей трихограммы с сохранением нативных биологических показателей качества энтомофага и его специфичности по отношению к естественному хозяину.

Задача данного изобретения заключается в поддержании маточной культуры трихограммы вида T. dendrolimi специализирующегося на сибирском шелкопряде.

Технический результат заключается в поддержании маточной культуры трихограммы вида T. dendrolim, за счет расширения спектра суррогатных хозяев включением в него такого вида хозяина и схемы пассажа, что позволяет обеспечить сохранение нативных биологических показателей качества энтомофага, а также специфичности его по отношению к естественному хозяину.

Предлагаемый способ по совокупности существенных признаков обеспечивает достижение технического результата, направленного на поддержание маточной культуры энтомофага T. dendrolimi с сохранением нативных биологических показателей энтомофага, определяющих его качество и видоспецифичность по отношению к естественному хозяину D. sibiricus за счет последовательного пассажа на суррогатном хозяине и заключительном пассаже на естественном хозяине.

Технический результат достигается тем, что в способе поддержания маточной культуры энтомофага T. dendrolimi, включающий выращивание энтомофага на суррогатном хозяине, согласно изобретению, в качестве суррогатного хозяина, используют неоплодотворенные яйца табачного бражника (Manduca sexta), последовательно проводя 2-5-кратный пассаж с заключительным пассажем на яйцах естественного хозяина.

Способ поддержания маточной культуры энтомофага Trichogramma dendrolimi осуществляется следующим образом.

В период отсутствия возможности поддерживать маточную культуру энтомофага на естественном хозяине, в качестве суррогатного хозяина предлагается использовать вид, адаптированный к содержанию в лабораторных условиях на искусственной питательной среде – табачный бражник (Manduca sexta Linnaeus, 1763), яйца которого подходят для заражения и развития энтомофага T. dendrolimi, имеющие схожие морфометрические характеристики яйца (форма и размер яйца), что обеспечивает формирование нормально развитых, крупных особей имаго. При этом осуществляется последовательный 2-5-кратный пассаж на суррогатном хозяине с завершающим пассажем на естественном.

Для этого, в лабораторных условиях (температурный режим + 22±2 °С; влажность воздуха 60-70 %; световой режим – 16:8) нативное поколение энтомофага или уже имеющееся лабораторное поколение, выращенное в период доступности естественного хозяина, подготавливают к пассажу на яйцах суррогатного хозяина, процедура которая заключается в обеспечении имаго дополнительным питанием (50 % раствор меда) и прохождением самками периода спаривания. После подготовки, к трихограмме помещают свежие неоплодотворенные яйца табачного бражника из расчета 6 яиц на 1 самку энтомофага. Период экспонирования яиц для заражения 24 часа. По истечению суток, яйца изымают и оставляют при тех же условиях до момента изменения цвета хориона со светло-зеленного на темно-серый. Далее зараженные яйца помещают на хранение в холодильник при температуре +10°С сроком до 1,5 месяцев. Последовательные 2-5-кратные пассажи на суррогатном хозяине повторяют до момента появления возможности проведения заключительного пассажа на естественном хозяине.

Таким образом, предлагаемый нами способ позволяет сохранить нативные биологические показатели энтомофага, определяющие его качество, а также сохранить его специфичность по отношению к естественному хозяину.

Краткое описание чертежей.

Фиг. 1 – Схема последовательных пассажей энтомофага.

Фиг. 2 – График статистических результатов обработки данных биологических показателей энтомофага из природной популяции (D.s.F0), последовательно прошедшего кратный пассаж на суррогатном хозяине (M.s.F1, M.s.F2) с завершительным пассажем на естественном (D.s.F3) (показатели: EI – доля зараженных яиц; LEF – продолжительность жизни самок, ND – доля нормально развитых имаго, EH – доля яиц, из которых отродились имаго; IS - размер тела имаго в сагиттальном направлении; TIE - количество особей в яйце, включая не развившихся; DP - срок развития особи энтомофага в скрытой фазе; SR - половое соотношение самок к самцам). Представлены средние значения (круг) с стандартной ошибкой среднего («усы»). Буквенными символами обозначены результаты процедуры множественного сравнения методом Tukey HSD test (одинаковые буквенные символы указывают на то, что существенных различий между вариантами не наблюдается, и наоборот, различные символы указывают на наличие различий между сравниваемыми вариантами).

Способ поддержания маточной культуры энтомофага Trichogramma dendrolimi поясняется примером выполнения изобретения.

В примере приводятся данные двух пассажей на суррогатном хозяине и окончательный пассаж на естественном хозяине. Отсутствие изменений качественных показателей у двух поколений трихограммы на суррогатном хозяине позволяет утверждать, что последующие 1-2 поколения сохранят эти качества.

Пример. Для подтверждения достижения технического результата в затухающих очагах сибирского шелкопряда, где в течение 3 лет отмечался высокий уровень паразитизма яиц, собраны зараженные яйца вредителя. В лабораторных условия (температурный режим + 24°С; влажность воздуха 60-70%; световой режим – 16:8) выведены яйцееды T. dendrolimi (поколение F0), в течение двух дней отродившимся имаго предоставлена возможность прохождение дополнительного питания (предложен 50 % водный раствор меда) и спаривание. Далее, для проведения процедуры пассажа, в пробирки экспонируются свежие яйца суррогатного хозяина (M. sexta) из расчета 1 самка энтомофага на 6 яиц хозяина. Период заражения – 24 часа. В последующем, при тех же условиях, яйца выдерживаются сначала до момента изменения цвета хориона со светло-зеленного на темно-серый, что свидетельствует об успешном заражении, далее помещаются на хранение в холодильник при температуре +10°С сроком 1,5 месяца. После отрождения нового поколения энтомофага (поколение F1), процедура пассажа повторяется с новой партией яиц суррогатного хозяина (поколение F2). Заключительный пассаж выполняется на яйцах естественного хозяина D. sibiricus (поколение F3) (фиг.1).

В ходе процесса последовательных пассажей учтены следующие параметры: доля зараженных яиц (EI); продолжительность жизни самок (LEF); доля нормально развитых имаго (ND); доля яиц, из которых отродились имаго (EH); размер тела имаго в сагиттальном направлении (IS); количество особей в яйце, включая не развившихся (TIE); срок развития особи в скрытой фазе (DP); половое соотношение (SR).

Полученные данный обработаны статистическими методами: проверены на однородность и нормальность распределения, применяя дисперсионный анализ установлено наличие существенной разницы между группами в целом (p < 0,05), а в результате применения метода множественных сравнений - критерий достоверно значимой разности Тьюки, выявлены различия или отсутствие такового показателей в сравниваемых группах (фиг. 2).

Средние значения определяемых качественных показателей между исходным поколением (D.s.F0) и заключительным поколением цикла (D.s.F3) статистически не имели существенных различий, что свидетельствует о сохранении в маточной культуре энтомофага нативных биологических показателей и специфичности его по отношению к естественному хозяину, тем самым обеспечено достижение требуемого технического эффекта.

Предложенный способ позволяет обеспечить сохранение нативных биологических показателей качества маточной культуры энтомофага вида T. dendrolimi, а также способствует сохранению его специфичности по отношению к естественному хозяину – сибирскому шелкопряду, что обеспечивается расширением спектра суррогатных хозяев за счет включением в него табачного бражника (Manduca sexta) и выполнением 2-5-кратных пассажей на нем с заключительным пассажем на естественном хозяине.

Данное изобретение позволяет поддерживать эффективность маточной культуры энтомофага в период отсутствия яиц основного хозяина - сибирского шелкопряда.

Сравнительный анализ предлагаемого технического результата показывает, что заявляемый способ обеспечивает стабильность биологических показателей энтомофага, на уровне природных, что может гарантировать высокий уровень производительности разведения популяции T. Dendrolimi.

Ценность изобретения заключается в обеспечении эффективного получения биологического средства для организации профилактических мер борьбы с сибирским шелкопрядом, локализации очагов массового размножения сибирского шелкопряда на ранней стадии развития вспышки, в том числе на лесных участках особо ценных и защитных лесов.

Источники информации

1. Нормативы биологической эффективности биоагентов (энтомофагов), стандарты и методики определения их качества. - Алматы, 2012. - https://pandia.ru/text/78/068/21250.php.

2. Способ массового разведения трихограммы: пат. 1655419/В.Б. Чернышев и др.; заявл. 05.05.1989; опубл. 16.06.1991, 1-2 с.

3. Wang Z.Y., He K.L., Zhang F., Lu X., Babendreier D. Mass rearing and release of Trichogramma for biological control of insect pests of corn in China // Biological Control, 2014, Т. 68, C. 136-144.

4. Спосіб вирощування лабораторних популяцій видів роду Trichogramma (Hymenoptera, Trichogrammatidae): пат. 40371 / М.О. Кочерга; заявл. 18.09.2008; опубл. 10.04.2009, 1-3 с.

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ поддержания маточной культуры энтомофага Trichogramma dendrolimi включает выращивание энтомофага на суррогатном хозяине, причем в качестве суррогатного хозяина используют неоплодотворенные яйца табачного бражника (Manduca sexta), последовательно проводя 2-5-кратный пассаж с заключительным пассажем на яйцах естественного хозяина. Изобретение позволяет обеспечить эффективное поддержание маточной культуры энтомофага в период отсутствия яиц основного хозяина - сибирского шелкопряда. 2 ил., 1 пр.

Способ поддержания маточной культуры энтомофага Trichogramma dendrolimi, предусматривающий выращивание энтомофага на суррогатном хозяине, отличающийся тем, что в качестве суррогатного хозяина используют неоплодотворенные яйца табачного бражника (Manduca sexta), последовательно проводя 2-кратный пассаж с заключительным пассажем на яйцах естественного хозяина.