Биопрепарат для деградации тетрахлорметана Российский патент 2024 года по МПК B09C1/10 C12N1/20 

Область техники

Изобретение относится к биопрепаратам-деструкторам токсичных хлорорганических соединений и, в частности, тетрахлорметана, и может быть применено в очистке окружающей среды, а также как биопрепарат для устранения загрязнений, вызванных промышленным комплексом.

Уровень техники

Известен штамм бактерий Rhodococcus qingshengii Ас-2143 -деструктор гербицида имазетапира и стимулятор роста растений (патент РФ на изобретение №2764119, кл. МПК C12N 1/20, В09С 1/10, C12R 1/01, опубл. 13.01.2022), который обладает способностью к деградации гербицида имазетапира, депонирован под номером ВКПМ Ас-2143.

Основным недостатком вышеуказанного штамма бактерий является его неспособность к деградации хлорорганических соединений, и, в частности, тетрахлорметана. Кроме того, у данного штамма отсутствует способность к использованию тетрахлорметана в качестве единственного источника энергии и углерода. Кроме того, отличается скорость роста и температурный минимум. В случае нашего изобретение биомассу штамма можно получить уже через 24 часа, тогда как в вышеуказанном изобретении культура нарабатывается в течении 2 суток, что влечет за собой дополнительный расход энергии.

Известен штамм бактерий Microbacterium paraoxydans ВКМ Ac-2619D - деструктор нефти и нефтепродуктов (патент РФ на изобретение №2687155, кл. МПК C12N 1/20, C02F 3/34, В09С 1/10, C12R 1/10, опубл. 07.05.2019), обладающий способностью осуществлять деградацию нефти и нефтепродуктов в широком диапазоне температур от +8 до +37°С, депонирован под регистрационным номером ВКМ Ac-2619D. Штамм бактерий Microbacterium paraoxydans ВКМ Ac-2619D может быть использован для очистки почв и воды от загрязнений нефтью и нефтепродуктами (дизельное топливо, масло моторное, газовый конденсат, масло гидравлическое, керосин авиационный, бензин).

Основным недостатком штамма бактерии Microbacterium paraoxydans ВКМ Ac-2619D является то, что он не может быть использован в качестве деструктора тетрахлорметана, ввиду строгой специфичности к субстратам, а именно к нефти и нефтепродуктам.

Известен биопрепарат для очистки объектов окружающей среды от углеводородного загрязнения, способ его получения и применения (патент РФ на изобретение №2535978, кл. МПК C12N 1/20, C02F 3/34, В09С 1/10, C12R 1/01, опубл. 20.12.2014), представляет собой консорциум микроорганизмов, состоящий из следующих штаммов бактерий: Rhodococcus qingshengii БАК-ПАУ-1 ВКПМ АС-1946, Pusillimonas ginsegisoli БАК-ПАУ-2 ВКПМ В-11370, Shinella granuli БАК-ПАУ-3 ВКПМ В-11371, взятых в равных соотношениях. Биопрепарат применяется в жидкой форме или в форме иммобилизованной клеточной биомассы. Для получения жидкой формы осуществляют глубинное культивирование штаммов бактерий, входящих в консорциум, с получением клеточной суспензии с дальнейшей обработкой ее в защитной среде. Для получения иммобилизованной формы биопрепарата проводится глубинное культивирование консорциума на питательной среде с получением биомассы и дальнейшей иммобилизацией биомассы клеток на минеральном или органическом носителях или стабилизацией клеточной суспензии.

Основным недостатком данного биопрепарата является недостаточная изученность деградативной активности бактерий, входящих в его состав, что не позволяет оценить их способность к деградации хлорорганических соединений и в частности тетрахлорметана. Также существенным недостатком препарата является то, что указанный биопрепарат эффективно работает при температурах не ниже +22°С. Кроме того, процесс получения одной из форм биопрепарата требует иммобилизации клеток на минеральные и органические носители, что влечет за собой увеличение энергетических и временных ресурсов.

В традиционной технологии очистки окружающей среды чаще всего используют технологию, при которой деструкция тетрахлорметана проводится в диэлектрическом барьерном разряде при атмосферном давлении в среде кислорода. Но такой метод применим для очистки газовых выбросов и непригоден для очистки почвы и водоемов. Кроме того, применение вышеуказанного способа является дорогостоящим.

Известен также способ удаления из воды четыреххлористого углерода (тетрахлорметана) с предварительной аэрацией исходной воды в вакуумно-эжекционном аппарате с последующей фильтрацией на фильтрах с загрузкой гранулированными активированными углями. Но данный способ влечет за собой образование отходов очистки воды, а именно гранул активированного угля, которые в последующем необходимо подвергнуть озонированию, что влечет дополнительные временные и финансовые затраты.

Тогда как применение заявленного биопрепарата не требует внесения дополнительных манипуляций с очищаемым объектом, а ввиду использования тетрахлорметана почвенными бактериями, входящими в состав препарата в качестве единственного источника энергии и углерода, также отсутствует необходимость во внесении дополнительных питательных элементов при очистке объекта.

На данный момент описано свойство одного штамма к трансформации тетрахлорметана путем замещения серы и кислорода, Pseudomonas sp. штамм КС. Штамм КС (= АТСС 55595 = DSM 7136) представляет собой денитрифицирующий изолят из водоносного горизонта, который продуцирует и секретирует пиридин-2,6-бис (тиокарбоксилат) (PDTC), хелатирующий агент, который преобразует четыреххлористый углерод без образования хлороформа. Несмотря на то, что данный штамм успешно использовался для биоремедиации объектов окружающей среды его таксономию оказалось трудно определить, поскольку он сохраняет свойства как Pseudomonas stutzeri, так и Pseudomonas putida. На основе полифазного подхода был сделан вывод о том, что штамм КС представляет собой новый геномовар внутри вида P. stutzeri.

Также известен штамм Escherichia coli также способный к трансформации тетрахлорметана, но представители данного микроорганизма способны вызывать коли-инфекции, что значительно затрудняет их применение в качестве штамма-деструктора тетрахлорметана.

Однако до настоящего времени не описано ни одного микробного сообщества или отдельного штамма, способного использовать тетрахлорметан в качестве единственного источника энергии и углерода. Тогда как вследствие биологических особенностей входящих в состав представленного биопрепарата почвенных бактерий, именно тетрахлорметан используется в качестве единственного источника энергии и углерода.

Указанные выше бактериальные штаммы выделены из почвы.

Раскрытие изобретения

Техническим результатом изобретения является повышение эффективности и деградативной активности препарата в отношении токсичного хлорорганического соединения, а также расширение диапазона pH среды и температуры, при которых происходит эффективная деградация тетрахлорметана. Применение данного биопрепарата не требует дополнительных манипуляций с очищаемым объектом.

Указанный технический результат достигается тем, что биопрепарат для деградации тетрахлорметана содержит консорциум аэробных почвенных бактерий Rhodococcus qingshengii R1 ВКМ Ас-3014Д, Microbacterium paraoxydans Ml ВКМ Ас-3015Д и Pseudomonas stutzeri S1 ВКМв-3747Д, полученных при раздельном культивировании на жидкой питательной среде при температуре 28-30°С, pH 6,0-6,5 в течение 24-48 часов в аэробных условиях, и дальнейшем смешивании их в объемном соотношении 1:1:1, также компоненты питательной среды, при следующем соотношении компонентов, мас.%: компоненты питательной среды - 0,03-0,04; вода - 97-98; консорциум аэробных почвенных бактерий - остальное.

Для оптимального роста бактерий Rhodococcus qingshengii их культивирование осуществляют при температуре 28°С и pH 6,5; бактерий Microbacterium paraoxydans - при температуре 30°С; бактерий Pseudomonas stutzeri - при температуре 30°С и pH 6,5.

Осуществление изобретения

Идентификацию штаммов на уровне видов была проведена на основе секвенирования гена 16S рРНК.

Для идентификации штаммы выращивали аэробно при 28-30°С в течение 24-48 ч на твердой питательной среде следующего состава, г/л:

ГРМ-бульон (панкреатический гидролизат рыбной муки - 12 г/л,

пептон ферментативный - 12 г/л,

натрия хлорид - 6 г/л, pH - 6,0-7,5.

Стерилизация при 1 атм. (121°С) - 20 мин.

Клетки штамма Rhodococcus qingshengii R1 (ВКМ Ас-3014Д) представляют собой палочки, на последней стадии развития палочки и кокки. Окраска по Граму положительная. Через 24 часа роста на ГРМ-агаре образуют шероховатые колонии кремового цвета с оранжевым оттенком.

Оптимальный рост происходит при 28°С и pH 6,5. Максимальная температура, при которой данные бактерии могут расти и проявлять свою деградативную активность (температурный оптимум) - 48°С.Способен к росту при повышенной солености до 7%.

Клетки штамма Microbacterium paraoxydans Ml (ВКМ Ас-3015Д) представляют собой короткие, грамположительные, неподвижные, палочки. Спор не образуют. Через 24 часа роста на ГРМ-агаре образуют гладкие, блестящие колонии желтого цвета с ровным краем (1-4 мм), пигмент в среду не диффундируют.

Оптимальный рост происходит при 30°С и pH 6,0-6,5. Температурный оптимум 44°С. Растет в диапазоне pH от 5,0-9,0.

Клетки штамма Pseudomonas stutzeri S1 (ВКМ В-3747Д) представляют собой мелкие подвижные палочки правильной формы, расположенные одиночно, иногда образуют скопления клеток. Окраска по Граму отрицательная. Через 24 часа роста на ГРМ-агаре образуют слегка морщинистые колонии светло-бежевого цвета.

Оптимальный рост происходит при 30°С и pH 6,5. Температурный оптимум 42°С.

Для выращивания указанных микроорганизмов использована питательная среда следующего состава, г/л:

Панкреатический гидролизат казеина - 12 г/л

Пептон ферментативный - 12 г/л

Натрия хлорид - 6 г/л

Процесс культивирования проводился в ферментерах при 28-30°С, pH 6,0-6,5 в течение 24-36 ч в аэробных условиях.

Титр биопрепарата 1*10⁹ жизнеспособных клеток в 1 мл препарата.

Для определения способности вышеуказанных штаммов к использованию тетрахлорметана в качестве единственного источника энергии и углерода был проведен ряд экспериментов. В стерильную минеральную среду вносили испытуемые клетки путем смыва с чашек Петри содержащих минеральную среду и тетрахлорметан в качестве единственного источника углерода и энергии в концентрации 0,5%, из расчета 250 мкл тетрахлорметана на каждые 50 мл минеральной среды следующего состава, г/л:

Na₂HPO₄ - 0,7;

KH₂PO₄-0,5;

NH₄NO₃-0,75;

MgSO₄x7H₂O-0,2;

MnSO₄-0,001;

FeSO₄-0,02.

Далее в качестве единственного источника углерода и энергии вносили тетрахлорметан в концентрации от 0,5 до 7%. После этого колбу тщательно перемешивали и отбирали «нулевую» пробу. Далее пробы отбирались каждые 24 часа. Отобранная культуральная жидкость промерялась спектрофотометрически при длине волны 590 нм (данные приведены в таблицах 1, 2, 3). Кроме того, была также измерена концентрация ДНК (дезоксирибонуклеиновая кислота) сразу после внесения растворителя, которым и является тетрахлорметан и на вторые сутки культивирования. Концентрацию ДНК измеряли спектрофотометрически при длине волны 280 нм в предварительно центрифугированной над осадочной культуральной жидкости, данные, свидетельствующие о жизнеспособности клеток и сохранении исходной их концентрации подтверждаются сохранением концентрации ДНК в культуральных жидкостях испытуемых бактерий практически на одном уровне, без последующего увеличения через 24 часа эксперимента (таблица 4).

В результате проведенных опытов можно заключить, что заявленный биопрепарат способен использовать тетрахлорметан в качестве единственного источника энергии и углерода, активно наращивая биомассу. Следовательно, почвенные бактерии, составляющие его основу обладают высокой деградативной активности в отношении данного токсичного хлорорганического соединения. При этом препарат эффективен в широком диапазоне pH (диапазон pH 5-9) и температуры очищаемой среды (от +8°С до +48°С), а также при повышенной солености до 7%.

Биопрепарат может быть изготовлен промышленным способом с использованием стандартного биотехнологического оборудования с применением доступных сырьевых компонентов.

Сопоставительный анализ заявленного биопрепарата показывает, что совокупность его существенных признаков неизвестна из уровня техники, а значит соответствует условию патентоспособности «Новизна».

В уровне техники не было выявлено признаков, совпадающих с отличительными признаками заявленного биопрепарата и влияющих на достижение заявленного технического результата, поэтому заявленное изобретение соответствует условию патентоспособности «Изобретательский уровень».

Приведенные сведения подтверждают возможность применения заявленного биопрепарата в биотехнологии для очистки окружающей среды от токсичных хлорорганических соединений, и поэтому соответствует условию патентоспособности «Промышленная применимость».

Изобретение относится к биопрепаратам-деструкторам токсичных хлорорганических соединений. Биопрепарат для деградации тетрахлорметана характеризуется тем, что содержит консорциум аэробных почвенных бактерий Rhodococcus qingshengii R1 ВКМ Ас-3014Д, Microbacterium paraoxydans M1 ВКМ Ac-3015Д и Pseudomonas stutzeri S1 ВКМв-3747Д, полученных при раздельном культивировании на жидкой питательной среде при температуре 28-30^oC, pH 6,0-6,5 в течение 24-48 часов в аэробных условиях, и дальнейшем смешивании их в объемном соотношении 1:1:1, также компоненты питательной среды, при следующем соотношении компонентов, мас.%: компоненты питательной среды – 0,03-0,04; вода – 97-98; консорциум аэробных почвенных бактерий – остальное, при этом жидкая питательная среда имеет следующий состав, г/л: панкреатический гидролизат казеина – 12г/л, пептон ферментативный – 12 г/л, натрия хлорид – 6 г/л. Изобретение позволяет повысить эффективность и деградативную активность препарата в отношении токсичного хлорорганического соединения, а также расширить диапазон pH среды и температуры, при которых происходит эффективная деградация тетрахлорметана. 3 з.п. ф-лы, 4 табл.

1. Биопрепарат для деградации тетрахлорметана, характеризующийся тем, что содержит консорциум аэробных почвенных бактерий Rhodococcus qingshengii R1 ВКМ Ас-3014Д, Microbacterium paraoxydans M1 ВКМ Ac-3015Д и Pseudomonas stutzeri S1 ВКМв-3747Д, полученных при раздельном культивировании на жидкой питательной среде при температуре 28-30°C, pH 6,0-6,5 в течение 24-48 часов в аэробных условиях, и дальнейшем смешивании их в объемном соотношении 1:1:1, также компоненты питательной среды, при следующем соотношении компонентов, мас.%:

- компоненты питательной среды – 0,03-0,04;

- вода – 97-98;

- консорциум аэробных почвенных бактерий – остальное, при этом жидкая питательная среда имеет следующий состав, г/л: панкреатический гидролизат казеина – 12г/л, пептон ферментативный – 12 г/л, натрия хлорид – 6 г/л.

2. Биопрепарат по п. 1, отличающийся тем, что для роста бактерий Rhodococcus qingshengii их культивирование осуществляют при температуре 28°C и pH 6,5.

3. Биопрепарат по п. 1, отличающийся тем, что для роста бактерий Microbacterium paraoxydans их культивирование осуществляют при температуре 30°C.

4. Биопрепарат по п. 1, отличающийся тем, что для роста бактерий Pseudomonas stutzeri их культивирование осуществляют при температуре 30°C и pH 6,5.