БИОПРЕПАРАТ ДЛЯ ОЧИСТКИ ОБЪЕКТОВ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ ОТ УГЕВОДОРОДНОГО ЗАГРЯЗНЕНИЯ, СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ И ПРИМЕНЕНИЯ Российский патент 2014 года по МПК C12N1/20 C02F3/34 B09C1/10 C12R1/01 

Изобретение относится к биотехнологии и экологии. Оно может быть использовано для защиты окружающей среды при биоремедиации промышленных и природных объектов техногенно загрязненных нефтяными и полициклическими ароматическими углеводородами (ПАУ).

Кроме нефтяных углеводородов широко распространенными, высоко токсичными загрязнителями окружающей среды являются полиароматические углеводороды и, особенно, самый токсичный из них бенз(а)пирен, являющийся по данным ВОЗ (Всемирной организации здравоохранения) провокатором онкологических заболеваний. Бенз(а)пирен и другие ПАУ образуются при неполном сгорании твердых и жидких топлив в энергетических установках, в двигателях внутреннего сгорания и концентрируются в поверхностном почвенном слое. С вдыхаемой пылью, с водой, с пищевыми продуктами, источником которых были загрязненные ПАУ почвы, по трофическим цепям техногенные токсиканты проникают в организм человека, что приводит к разрушительным последствиям для здоровья. Поэтому в санитарных правилах, регламентирующих содержание токсикантов в почвах населенных мест, сельхозугодий, бенз(а)пирен причислен к токсикантам первого класса опасности, концентрация которого в почве ограничена ПДК 20 мкг/кг почвы (предельно допустимой концентрацией).

Кроме гигиенического значения загрязнения ПАУ имеет и негативный экологический аспект - под действием ПАУ происходит угнетение почвенной биоты, что регистрируется подавлением биохимической активности почв, например дегидрогеназной, каталазной активностью.

В значительной степени подвергнуты техногенному загрязнению ПАУ городские, в большой степени, придорожные территории и промышленные зоны, особенно связанные со стоянками автотранспорта, с хранением и использованием нефтепродуктов - базы топлив различных производственных предприятий, парки железнодорожного и автотранспорта. В настоящее время, в связи с насыщением городской среды автотранспортом, поток загрязнений этими высокотоксичными веществами значительно возрастает. Поведение ПАУ в почвах зависит от климатических условий и взаимодействия их с органическими и минеральными компонентами почвы. В отсутствии сильных окислителей и УФ-излучения ведущая роль в процессах деструкции ПАУ принадлежит биологическим системам. Способность микроорганизмов утилизировать ПАУ путем включения их в свой метаболизм отмечена у многих видов аэробных бактерий, использующих ПАУ в качестве углеродсодержащего субстрата для обеспечения себя энергией.

Биопрепарат для очистки объектов окружающей среды от нефтезагрязнений и ПАУ содержит биомассу следующих штаммов бактерий: Rhodococcus qingshengii БАК-ПАУ-1 ВКПМ АС-1946, Pusillimonas ginsegisoli БАК-ПАУ-2 ВКПМ В-11370, Shinella granuli БАК-ПАУ-3 ВКПМ В-11371 в равных соотношениях.

Биопрепарат применяется в форме жидкой стабилизированной суспензии, для получения иммобилизованной формы биопрепарата проводится иммобилизация биомассы бактериальных клеток на минеральном или органическом носителе.

Известен консорциум нефтеокисляющих микроорганизмов Pseudomonas putida ПИ Ко-1, Pseudomonas fluorescens ПИ-896, Micrococcus sp. ПИ Ку-1, Burkholderia caryophylli Jap-3, Serratia odorifera Jap-1, осуществляющих наряду с деструкцией нефти и нефтепродуктов утилизацию полициклических ароматических углеводородов, а именно антрацена, фенантрена и производных пирена, в почвах, имеющих высокое содержание растворимых форм солей марганца и меди (RU №2191643 В09С 1/10, 2001.07/09).

Недостатком указанного способа является то, что деструкция полиароматических соединений ограничивается трех- и четырехъядерными полиароматическими соединениями, сведения о биодеструкции бенз(а)пирена (5-ядерный ПАУ), самого высокотоксичного соединения, первого класса опасности, отсутствуют.

Известен способ очистки почвы от нефти и полициклических ароматических углеводородов в условиях повышенной минерализации среды, представляющий собой консорциум бактерий

Rhodococcus sp.SMB37, Rhodococcus sp.SMB38, Arthrobacter sp.SMB32, Microbacterium sp.SMB33, Thalassospira sp.SMB34, Halomonas sp.SMB31, Salinicola socius SMB3 (RU №2388816 C12R1/00, 2008.04/07).

Консорциум может быть использован для очистки от нефти, нефтепродуктов и полициклических ароматических углеводородов, а именно нафталина, бифенила, аценафтена, фенантрена, антрацена в условиях засоления.

Недостатком указанного способа является узкий спектр биодеградируемых полициклических ароматических углеводородов, в котором не представлены самые токсичные 5-ядерные ароматические углеводороды, в том числе бенз(а)пирен.

Наиболее близким к предлагаемому изобретению является штамм бактерий Pseudomonas alcaligenes MEV, который утилизирует нефть, мазут, дизельное топливо, полициклические ароматические углеводороды, содержащие от 2 до 4 бензольных колец - нафталин, фенантрен, антрацен, флуорантен, фенол, также он устойчив к ионам тяжелых металлов - Pb, Zn, Mo, Fe, Cr (RU 2228953, C12N 1/20, C02F 3/34, B09C 1/10).

Недостатком этого способа очистки является то, что он осуществляет деструкцию ПАУ, содержащих только 2, 3 и 4 ароматические кольца, и также содержит только один штамм бактерий рода Псевдомонас, хотя известно, что биопрепараты, состоящие из микроорганизмов разных таксономических групп, более эффективно утилизируют органические токсиканты.

Задача данного изобретения состоит в создании эффективного способа очистки объектов окружающей среды от загрязнения нефтяными и полициклическими ароматическими углеводородами с использованием нового биопрепарата, состоящего из консорциума микроорганизмов-деструкторов, способных к глубокой деструкции нефтяных и полициклических углеводородов.

Технический результат, который может быть достигнут при использовании предлагаемого изобретения, заключается в повышении эффективности очистки объектов окружающей среды от загрязнения нефтяными и полициклическими ароматическими углеводородами за счет того, что консорциум микроорганизмов, входящий в состав биопрепарата, способен к деградации нефтяных и полициклических углеводородов в широком диапазоне температур окружающей среды, а также в условиях загрязнения почв ионами тяжелых металлов и при высоком солевом фоне.

Поставленная задача решается за счет того, что в биопрепарате для очистки объектов окружающей среды от загрязнений нефтью, нефтепродуктами, полициклическими ароматическими углеводородами (ПАУ), включающем консорциум штаммов микроорганизмов и защитную среду для жидкой формы или инертный носитель для сухой формы, предлагается использовать в качестве консорциума штаммов микроорганизмов штаммы бактерий: Rhodococcus qingshengii БАК-ПАУ-1 ВКПМ АС-1946, Pusillimonas ginsegisoli БАК-ПАУ-2 ВКПМ В-11370, Shinella granuli БАК-ПАУ-3 ВКПМ В-11371 в равных соотношениях. Дополнительными отличиями предлагаемого биопрепарата являются:

- жидкая форма содержит в качестве защитной среды раствор 5% хлорида натрия,

- сухая форма содержит в качестве инертного носителя минеральный или органический носитель, на котором иммобилизован консорциум штаммов бактерий: Rhodococcus qingshengii БАК-ПАУ-1 ВКПМ АС-1946, Pusillimonas ginsegisoli БАК-ПАУ-2 ВКПМ В-11370, Shinella granuli БАК-ПАУ-3 ВКПМ В-11371 в соотношении 1:20,

- в качестве минерального или органического носителя может быть, например, верховой торф, вспученный перлит, вермикулит, шелуха гречихи, полипропиленовое волокно и т.д.

Поставленная задача решается также за счет того, что в способе получения биопрепарата для очистки объектов окружающей среды от загрязнений нефтью, нефтепродуктами, полициклическими ароматическими углеводородами (ПАУ), включающем глубинное культивирование консорциума микроорганизмов на питательной среде с получением клеточной суспензии и дальнейшую ее обработку в защитной среде для получения жидкой формы, предлагается в качестве консорциума штаммов микроорганизмов использовать штаммы бактерий: Rhodococcus qingshengii БАК-ПАУ-1 ВКПМ АС-1946, Pusillimonas ginsegisoli БАК-ПАУ-2 ВКПМ В-11370, Shinella granuli БАК-ПАУ-3 ВКПМ В-11371 в равных соотношениях.

Дополнительным отличием предлагаемого способа явялтся то, что в качестве защитной среды вносят раствор 5% хлорид натрия.

Поставленная задача решается также за счет того, что в способе получения биопрепарата для очистки объектов окружающей среды от загрязнений нефтью, нефтепродуктами, полициклическими ароматическими углеводородами (ПАУ), включающем глубинное культивирование консорциума микроорганизмов на питательной среде с получением клеточной суспензии и дальнейшую ее иммобилизацию на инертном носителе для получения сухой формы, предлагается в качестве консорциума штаммов микроорганизмов использовать штаммы бактерий: Rhodococcus qingshengii БАК-ПАУ-1 ВКПМ АС-1946, Pusillimonas ginsegisoli БАК-ПАУ-2 ВКПМ В-11370, Shinella granuli БАК-ПАУ-3 ВКПМ В-11371 в равных соотношениях.

Дополнительными отличиями предлагаемого способа являются:

- в качестве защитной среды вносят раствор 5% хлорида натрия,

- консорциум штаммов бактерий: Rhodococcus qingshengii БАК-ПАУ-1 ВКПМ АС-1946, Pusillimonas ginsegisoli БАК-ПАУ-2 ВКПМ В-11370, Shinella granuli БАК-ПАУ-3 ВКПМ В-11371 иммобилизуют на инертном носителе в соотношении 1:20,

- в качестве инертного носителя используют минеральный или

органический носитель, например верховой торф, вспученный перлит, вермикулит, шелуху гречихи, полипропиленовое волокно и т.д.

Поставленная задача решается также за счет того, что в способе очистки объектов окружающей среды от загрязнений нефтью, нефтепродуктами, полициклическими ароматическими углеводородами (ПАУ), включающем внесение в загрязненную среду биопрепарата, состоящего из консорциума микроорганизмов и защитной среды для жидкой формы или инертного носителя для твердой формы, предлагается использовать в качестве консорциума микроорганизмов следующие штаммы бактерий: Rhodococcus qingshengii БАК-ПАУ-1 ВКПМ АС-1946, Pusillimonas ginsegisoli БАК-ПАУ-2 ВКПМ В-11370, Shinella granuli БАК-ПАУ-3 ВКПМ В-11371 в равных соотношениях. Внесение биопрепарата предлагается производить из расчета 0,5-1 л/м кв. в концентрации 1×10⁶-1×10⁷ КОЕ/г биопрепарата совместно с комплексным минеральным удобрением - азофоска, в концентрации 20-200 г/м².

Дополнительными отличиями предлагаемого способа являются:

- жидкая форма биопрепарата содержит в качестве защитной среды раствор 5% хлорида натрия,

Сухая форма биопрепарата содержит в качестве инертного носителя минеральный или органический носитель, на котором иммобилизован консорциум штаммов бактерий: Rhodococcus qingshengii БАК-ПАУ-1 ВКПМ АС-1946, Pusillimonas ginsegisoli БАК-ПАУ-2 ВКПМ В-11370, Shinella granuli БАК-ПАУ-3 ВКПМ В-11371 в соотношении 1:20,

- в качестве минерального или органического носителя может быть, например, верховой торф, вспученный перлит, вермикулит, шелуха гречихи, полипропиленовое волокно и т.д.

Предлагаемое микробное сообщество является естественной природной ассоциацией, выделенной из почвы, загрязненной креозотом и нефтепродуктами. Состав консорциума стабилен во времени, соотношение штаммов может варьироваться в зависимости от условий культивирования микробного сообщества.

Бактериальный консорциум непатогенен (невирулентен, нетоксичен, токсигенностью не обладает), его преимуществом является высокая скорость деструкции полициклических углеводородов.

В состав биопрепарата входит консорциум бактерий-деструкторов нефтяных и полиароматических углеводородов: штаммы бактерий: Rhodococcus qingshengii БАК-ПАУ-1 ВКПМ АС-1946, Pusillimonas ginsegisoli БАК-ПАУ-2 ВКПМ В-11370, Shinella granuli БАК-ПАУ-3 ВКПМ В-11371, которые идентифицированы до вида с помощью анализа генов, кодирующих 16S рРНК ВКМП, ФГУП ГосНИИГенетика, и депонированы во Всероссийскую коллекцию промышленных штаммов микроорганизмов (ВКПМ).

Штамм бактерий Rhodococcus qingshengii БАК-ПАУ-1 ВКПМ АС-1946, выделен из почвы, загрязненной креозотом.

Культурально-морфологические признаки: грамположительные неправильные палочки с заостренными концами 0.5×2.0-4.0 мкм. Кустистые, первичное ветвление и мицелий не характерны, цикл палочка-кокк отсутствует. Колонии довольно крупные - 4-7 мм в диаметре, округлые, выпуклые, кремовые, матовые (не блестящие), на 7-10 сутки колонии грязно-оранжевые с более плотным центром, суховатые.

Физиолого-биохимические признаки: аэроб, хемоорганотроф, каталазоположительный. Галотолерантность (8% NaCl) не характерна, сероводород не образует.

Штамм бактерий Pusillimonas ginsegisoli БАК-ПАУ-2 ВКПМ В-11370 выделен из почвы, загрязненной креозотом.

Культурально-морфологические признаки: грамотрицательные мелкие тонкие правильные палочки 0.3 х 1.0-3.0 мкм, подвижные. Колонии блестящие 4-7 мм в диаметре, округлые оранжево-бежевые, слегка выпуклые, с более светлым полупрозрачным краем.

Физиолого-биохимические признаки: аэроб, О/F - тест - «+/-», внеклеточные пигменты не характерны, оксидазо- и каталазоположительные. Способны использовать глюкозу, валин и аргинин в качестве единственного источника углерода.

Штамм бактерий Shinella granuli БАК-ПАУ-3 ВКПМ В-11371 выделен из почвы, загрязненной креозотом.

Культурально-морфологические признаки: грамотрицательные, мелкие тонкие правильные палочки, 0.3 ч 1.0-3.0 мкм, подвижные. Колонии блестящие, 5-8 мм в диаметре, округлые, грязно-белые, слегка выпуклые, полупрозрачные, с более светлым тонким краем.

Физиолого-биохимические признаки: аэроб, O/F - тест - «+/-», внутри- и внеклеточные пигменты не характерны, оксидазо- и каталазоположительные. Способны использовать глюкозу, но не валин и аргинин в качестве единственного источника углерода.

Для получения иммобилизованных форм биопрепарата суспензию биомассы бактериального консорциума наносят на минеральный или органический инертный носитель типа вспученный вермикулит, вспученный перлит, верховой торф с последующей сушкой.

Бактериальный консорциум хранится на агаризованном ферментативном гидролизате рыбной муки, содержащей 50 мкг креазота на чашку Петри, при +4°C, с регулярным пересевом.

Биопрепарат, полученный на основе этого консорциума, предложен для очистки почвы от углеводородов впервые, в связи с чем можно сделать вывод о соответствии предлагаемого консорциума критериям изобретения «новизна» и «изобретательский уровень».

Изобретение подтверждается следующими примерами.

Пример 1: Получение жидкой формы.

Предлагаемый бактериальный консорциум был выделен из техногенно загрязненной почвы. Для получения биомассы препарата проводится совместное культивирование штаммов, входящих в состав биопрепарата. Для культивирования микроорганизмов деструкторов Rhodococcus qingshengii, Pusillimonas ginsegisoli, Shinella granuli используют ферментаторы вместительностью 100-250 литров - с коэффициентом заполнения 0,6-0,7. Ферментаторы оснащены фильтрами тонкой очистки воздуха, датчиками температуры, рН, скорости перемешивания и расхода воздуха на аэрацию. Внесение посевного материала в ферментатор производится из соотношения 3 л микробной суспензии с концентрацией 109 клеток/мл на 60 л питательной среды. Выращивание культур микроорганизмов осуществляется в ферментаторе на питательной среде следующего состава (г/л):

- Кислотный гидролизат казеина или пептон - 10

- Дрожжевой автолизат - 0,08 л

- K₂HPO₄ - 2

- MqSO₄ - 0,3

- MnSO₄ - 0,05

- (NH₄)₂SO₄ - 6

- NaCl - 0,5

- Глюкоза - 20

- Дизельное топливо - 0,5

- Софексил - 1 мл

- Вода водопроводная до 60 л

pH среды - 6,8-7,2

Поддерживаем следующие значения технологических параметров процесса культивирования:

- Температура 28±1 C°

- Перемешивание - 200 об/мин

- Аэрация - 1 об/об/мин

- pH - 6,9±0,1 ед. рН

Величину pH поддерживают автоматическим путем подачи 15%-ного раствора NH₄OH, при непрерывном перемешивании.

Продолжительность процесса культивирования до 22-26 часов. Полученная суспензия имеет высокий клеточный титр 10¹⁰ КОЕ/мл. Биопрепарат получают стабилизацией полученной суспензии подходящим протектором. Биопрепарат хранят в виде суспензии при температуре 4-6°C до 60 суток.

Пример 2: Получение иммобилизованной (сухой) формы.

В качестве носителя для иммобилизованной формы могут быть использованы следующие носители:

- органические (торф, опилки, отходы зерновых сельскохозяйственных производств: шелухи гречихи и ячменя, лузги риса, полимерные волокна),

- минеральные (вспученный вермикулит, перлит, каолин, глауконит).

Для получения иммобилизованной формы микробный препарат суспензию клеток, полученную, как указано в примере 1, наносят на поверхность носителя в соотношении 1:20. Получившийся после иммобилизации препарат имеет стабильную устойчивую форму с высоким титром нефтеокисляющих культур 10⁶ КОЕ/г препарата. Срок хранения биопрепарата в иммобилизованной форме без потери активности - 1 год.

Поверхность или часть поверхности удерживаемой носителем клетки свободно "омывается" внешней средой (жидкой или газообразной); при этом потребление субстратов и выделение продуктов жизнедеятельности микроорганизма определяются преимущественно биологическими факторами.

Преимущество сухой формы иммобилизованного препарата заключается в том, что он поставляется в виде, готовом к внесению в нефтезагрязненную почву, без предварительной подготовки на месте использования.

Иммобилизованные клетки препарата устойчивее к неблагоприятному воздействию окружающей среды и более эффективно окисляют углеводородные загрязнения при высоких концентрациях.

Пример 3:

Консорциум микроорганизмов выращивали на минеральной среде Раймонда. Нефть, мазут, дизельное топливо добавляли в питательную среду в количестве 1% от массы питательной среды в качестве единственного источника углерода. Опыт производился в трех повторностях. В колбы объемом 750 см³ вносили по 200 см³ минеральной среды и по 2000 мг нефти, мазута и дизельного топлива. Колбы засевали клетками Rhodococcus qingshengii, Pusillimonas ginsegisoli, Shinella granuli в равных соотношениях до концентрации 10⁶ КОЕ/см. В качестве контролей использовали колбы с минеральной средой с нефтепродуктами. Колбы культивировали на качалке при 200 об/мин и 22°C в течение 14 суток. Измерение концентрации нефтепродуктов выполнено флуориметрическим методом по ПНД Ф 16.1.21-98. Полученные результаты показали, что в течение 14 суток при 22°C данный консорциум утилизирует нефть, мазут и дизельное топливо на: 76,3; 54,2 и 96,6% соответственно.

Пример 4:

Консорциум штаммов бактерий: Rhodococcus qingshengii, Pusillimonas ginsegisoli, Shinella granuli выращивали на минеральной среде Раймонда, в качестве единственного источника углерода использовали 1% нефть. Выращенную суспензию клеток вносили в колбы с минеральной средой объемом 200 см³, содержащей 1% нефть и различной степени солености (3%, 5% и 7% NaCl). В качестве контролей использовали колбы с минеральной средой различной солености с нефтью. Колбы культивировали на качалке при 200 об/мин и 22°C в течение 14 суток. Измерение концентрации нефтепродуктов выполнено флуориметрическим методом по ПНД Ф 16.1.21-98. Полученные результаты показали, что в течение 14 суток при 22°C данный консорциум утилизирует нефть в присутствии высокой солености.

Степень солености минеральной среды NaCl 3% NaCl 5% NaCl 7% Степень деструкции, % с внесением консорциума 74,6 71,6 66,8 без внесения консорциума 0 0 0

Пример 5:

Консорциум бактерий: Rhodococcus qingshengii, Pusillimonas ginsegisoli, Shinella granuli, которые выращивали на минеральной среде Раймонда с добавлением дизельного топлива в количестве 1%. Выращенную суспензию клеток вносили в загрязненную сырой нефтью почву (3% содержание углеводородов в почве) разной степени засоления (3%, 5% и 7% NaCL) из расчета 10⁷ клеток на 1 г почвы. Через 21 день исследований методом ИКС-спектрометрии оценивали содержание нефтепродуктов в почве. В почве после обработки консорциумом микроорганизмов отмечается снижение концентрации нефтепродуктов. Существенное ингибирование процесса деструкции углеводородов наблюдается при минерализации 7%, концентрация нефтепродуктов в вариантах без внесения микроорганизмов осталось на прежнем уровне, в опытных вариантах снизилась на 28,2%, 20,5% и 15,4% соответственно

Таким образом, предлагаемый консорциум может использоваться для очистки почвы от нефти в условиях засоления.

Пример 6:

Одним из наиболее токсичных загрязнителей окружающей среды, оказывающих по данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) значительное влияние на состояние здоровья человека, является группа полициклических ароматических углеводородов (ПАУ), в которую входят такие соединения как нафталин, антрацен, фенантрен, 3,4-бенз(а)пирен, (бенз(а)пирен) и другие.

Выращенной суспензией клеток Rhodococcus qingshengii, Pusillimonas ginsegisoli, Shinella granuli (смотри пример 1) обрабатывали почву, загрязненную полициклическими ароматическими углеводородами (ПАУ). В течение 3 месяцев исследований оценивали содержание ПАУ методом КХА (МУК 4.1.1062-01). Результаты обезвреживания загрязненной ПАУ почвы предлагаемым консорциумом представлены в таблице. В почве после обработки биопрепаратом отмечается снижение концентрации ПАУ на протяжении всего периода исследования. Через 3 месяца после внесения биопрепарата суммарная концентрации ПАУ снизилась в 31,6 раз и составила 67,6 мкг/кг почвы. Концентрация самого токсичного бенз[а]пирена (1-й класс опасности) снизилась в 24 раза и составила 3,31 мкг/кг.

Наименование ПАУ исходный 1 месяц 2 месяца 3 месяца   мкг/кг мкг/кг мкг/кг мкг/кг Нафталин 166,4 29,2 11,7 1,69 Аценафтилен 77,9 54,2 16,9 8,04 Аценафтен 11,4 <0,01 <0,01 <0,01 Флуорен 131,2 10,1 2,27 2,01 Фенантрен 474,3 38,8 12,8 7,51 Антрацен 40 12,2 4,58 1,68 Флуорантен 416,2 34,3 12,1 8,31 Пирен 466,1 40,6 17,4 14,96 Бенз[а]антрацен 93,7 10,9 3,14 2,76 Хризен 47,4 26,2 8,96 5,78 Бенз[b]флуорантен 83,7 29,9 7,75 3,55 Бенз[k]флуорантен 15,6 12,8 3,18 1,49 Бенз[а]пирен 79,6 42,1 10,5 3,31 Дибенз[a,h]антрацен 8,8 7,4 1,63 2,61 Бенз[g,h,i]перилен 5,2 3,1 0,98 0,47 Индено[1,2,3-cod]пирен 21 11,8 2,71 3,43 Сумма, мкг/кг 2138,5 363,6 116,6 67,6

Предлагаемый консорциум может быть использован для очистки почв от нефти, а также полициклических ароматических углеводородов.

Пример 7: Полевые испытания биопрепарата в жидкой форме.

Испытание углеводород окисляющей способности консорциума клеток Rhodococcus qingshengii, Pusillimonas ginsegisoli, Shinella granuli на нефтешламе и водной поверхности, загрязненной нефтью.

Биоремедиацию (очистку) нефтезагрязненной почвы поводили в сочетании с агротехническими мероприятиями - рыхление почвы, внесение комплексного минерального удобрения «азофоска» из расчета 20-200 г/м², периодическое увлажнение.

1. Место проведения эксперимента: Ленинградская область, Волосовский район, площадка обезвреживания почв и грунтов, 2011 год. Загрязнитель: нефтешлам, время обезвреживания - 50 дней, количество обработок - 2 биообработки. Исходная концентрация нефтепродуктов - 110,33 г/кг, степень очистки -78,58%, снижение класса опасности с III до IV класса опасности.

2. Место проведения эксперимента: г.Бологое, локомотивное депо, 2012 год. Загрязнитель: нефтешлам, время обезвреживания - 30 дней, количество обработок - 2 биообработки. Исходная концентрация нефтепродуктов - 92,33 г/кг, степень очистки - 62,23%. Исходная концентрация бенз(а)пирена 0,061 мг/кг, степень очистки - 60,6%, снижение класса опасности с III до IV класса опасности.

3. Место проведения эксперимента: Ленинградская область, Всеволожский район, территория котельной, 2011 год. Загрязнитель: нефтешлам, время обезвреживания - 90 дней, количество обработок - 4 биообработки. Исходная концентрация нефтепродуктов - 86,4 г/кг, степень очистки - 81,6%. Исходная концентрация бенз(а)пирена 0,068 мг/кг, степень очистки - 82,4%, снижение класса опасности с III до IV класса опасности.

Во всех вариантах наблюдалось снижение численности микроорганизмов в первые сутки, которое может быть обусловлено токсическим влиянием нефтепродуктов и адаптацией микроорганизмов к условиям среды, отмечается общая тенденция к резкому увеличению численности углеводородокисляющих микроорганизмов в последующий период окисления.

4. Место проведения эксперимента: Ленинградская область, Всеволожский район, ливневые стоки, 2012 год. Загрязнитель: нефтепродукты, количество обработок - 5 биообработок. Исходная концентрация нефтепродуктов - 0,35 г/л, степень очистки - 85%.

Пример 8: Полевые испытания сухой формы биопрепарата.

Испытание биопрепарата на нефтешламе и водной поверхности, загрязненной нефтью (иммобилизованная форма). Биоремедиацию (очистку) нефтезагрязненной почвы поводили в сочетании с агротехническими мероприятиями - рыхление почвы, внесение комплексного минерального удобрения «азофоска» из расчета 20-200 г/м², периодическое увлажнение.

1. Биопрепарат на органическом носителе /торф/. Место проведения эксперимента: Ленинградская область, Волосовский район, площадка обезвреживания, 2012 год. Загрязнитель: нефтешлам, время обезвреживания - 90 дней, количество обработок - 4 биообработки. Исходная концентрация нефтепродуктов - 138 г/кг, степень очистки - 82,36%, снижение класса опасности с III до IV класса опасности.

2. Биопрепарат на минеральном носителе /вермикулит/. Место проведения эксперимента: г.Петрозаводск, локомотивное депо, 2012 год. Загрязнитель: нефтешлам, время обезвреживания - 30 дней, количество обработок - 2 биообработки. Исходная концентрация нефтепродуктов - 68,5 г/кг, степень очистки - 71,64%. Исходная концентрация бенз(а)пирена 0,091 мг/кг, степень очистки - 72,4%.

Во всех вариантах после внесения иммобилизованного препарата сразу наблюдался активный рост, как гетеротрофов, так и нефтедеструкторов. Иммобилизованные клетки препарата устойчивее к неблагоприятному воздействию окружающей среды и не требуют периода адаптации.

3. Биопрепарат на растительном носителе /шелуха гречихи/. Место проведения эксперимента: Ленинградская область, Тосненский район, ливневые стоки, 2012 год. Загрязнитель: нефтепродукты, количество обработок - 8 биообработок. Исходная концентрация нефтепродуктов - 0,15 г/л, степень очистки - 60%.

4. Биопрепарат на полипропиленовом волокне. Санкт-Петербургский метрополитен, локальные очистные сооружения ливневого стока, выходной колодец. Установлена загрузка из полипропиленового волокна с иммобилизованным консорциумом Концентрация нефтепродуктов в воде до загрузки 0.37 мг/л, после загрузки 0.01 мг/л.

Изобретение относится к биотехнологии и экологии, а именно к защите окружающей среды. Биопрепарат для очистки объектов окружающей среды от нефтезагрязнений и ПАУ представляет собой консорциум микроорганизмов, состоящий из следующих штаммов бактерий: Rhodococcus qingshengii БАК-ПАУ-1 ВКПМ АС-1946, Pusillimonas ginsegisoli БАК-ПАУ-2 ВКПМ В-11370, Shinella granuli БАК-ПАУ-3 ВКПМ В-11371, взятых в равных соотношениях. Биопрепарат применяется в жидкой форме или в форме иммобилизованной клеточной биомассы. Для получения жидкой формы осуществляют глубинное культивирование штаммов бактерий, входящих в консорциум, с получением клеточной суспензии с дальнейшей обработкой ее в защитной среде. Для получения иммобилизованной формы биопрепарата проводится глубинное культивирование консорциума на питательной среде с получением биомассы и дальнейшей иммобилизацией биомассы клеток на минеральном или органическом носителях или стабилизацией клеточной суспензии. При этом биопрепарат вносят из расчета 0,5-1 л/м кв. в концентрации 1×10⁶ - 1×10⁷ КОЕ/г биопрепарата и комплексного минерального удобрения - азофоски, в концентрации 20-200 г/м². Изобретение позволяет повысить эффективность очистки почвы от загрязнений нефтью, нефтепродуктами и полициклическими ароматическими углеводородами. 4 н. и 9 з.п. ф-лы, 2 табл., 8 пр.

1. Биопрепарат для очистки объектов окружающей среды от загрязнений нефтью, нефтепродуктами, полициклическими ароматическими углеводородами (ПАУ), включающий консорциум штаммов микроорганизмов и защитную среду для жидкой формы или инертный носитель для сухой формы, отличающийся тем, что консорциум штаммов микроорганизмов состоит из следующих штаммов бактерий: Rhodococcus qingshengii БАК-ПАУ-1 ВКПМ АС-1946, Pusillimonas ginsegisoli БАК-ПАУ-2 ВКПМ В-11370, Shinella granuli БАК-ПАУ-3 ВКПМ В-11371 в равных соотношениях.

2. Биопрепарт по п.1, отличающийся тем, что жидкая форма содержит в качестве защитной среды раствор 5% хлорида натрия.

3. Биопрепарат по п.1, отличающийся тем, что сухая форма содержит в качестве инертного носителя минеральный или органический носитель, на котором иммобилизован консорциум штаммов бактерий: Rhodococcus qingshengii БАК-ПАУ-1 ВКПМ АС-1946, Pusillimonas ginsegisoli БАК-ПАУ-2 ВКПМ В-11370, Shinella granuli БАК-ПАУ-3 ВКПМ В-11371 в соотношении 1:20.

4. Биопрепарат по п.3, отличающийся тем, что в качестве минерального или органического носителя может быть, например, верховой торф, вспученный перлит, вермикулит, шелуха гречихи, полипропиленовое волокно.

5. Способ получения биопрепарата для очистки объектов окружающей среды от загрязнений нефтью, нефтепродуктами, полициклическими ароматическими углеводородами (ПАУ), включающий глубинное культивирование консорциума микроорганизмов на питательной среде с получением клеточной суспензии и дальнейшую ее обработку в защитной среде для получения жидкой формы, отличающийся тем, что консорциум штаммов микроорганизмов состоит из следующих штаммов бактерий: Rhodococcus qingshengii БАК-ПАУ-1 ВКПМ АС-1946, Pusillimonas ginsegisoli БАК-ПАУ-2 ВКПМ В-11370, Shinella granuli БАК-ПАУ-3 ВКПМ В-11371 в равных соотношениях.

6. Способ по п.5, отличающийся тем, что в качестве защитной среды вносят раствор 5% хлорида натрия.

7. Способ получения биопрепарата для очистки объектов окружающей среды от загрязнений нефтью, нефтепродуктами, полициклическими ароматическими углеводородами (ПАУ), включающий глубинное культивирование консорциума микроорганизмов на питательной среде с получением клеточной суспензии и дальнейшую ее иммобилизацию клеточной суспензии на инертном носителе для получения твердой формы, отличающийся тем, что консорциум штаммов микроорганизмов состоит из следующих штаммов бактерий: Rhodococcus qingshengii БАК-ПАУ-1 ВКПМ АС-1946, Pusillimonas ginsegisoli БАК-ПАУ-2 ВКПМ В-11370, Shinella granuli БАК-ПАУ-3 ВКПМ В-11371 в равных соотношениях.

8. Способ по п.7, отличающийся тем, что консорциум штаммов бактерий: Rhodococcus qingshengii БАК-ПАУ-1 ВКПМ АС-1946, Pusillimonas ginsegisoli БАК-ПАУ-2 ВКПМ В-11370, Shinella granuli БАК-ПАУ-1 ВКПМ В-11371 иммобилизуют на инертном носителе в соотношении 1:20.

9. Способ по п.8, отличающийся тем, что в качестве инертного носителя используют минеральный или органический носитель, например верховой торф, вспученный перлит, вермикулит, шелуху гречихи, полипропиленовое волокно.

10. Способ очистки объектов окружающей среды от загрязнений нефтью, нефтепродуктами, полициклическими ароматическими углеводородами (ПАУ), включающий внесение в загрязненную среду биопрепарата, состоящего из консорциума микроорганизмов и защитной среды для жидкой формы или инертного носителя для твердой формы, отличающийся тем, что биопрепарат состоит из следующих штаммов бактерий: Rhodococcus qingshengii БАК-ПАУ-1 ВКПМ АС-1946, Pusillimonas ginsegisoli БАК-ПАУ-2 ВКПМ В-11370, Shinella granuli БАК-ПАУ-3 ВКПМ В-11371 в равных соотношениях, внесение биопрепарата производят из расчета 0,5-1 л/м кв. в концентрации 1×10⁶ - 1×10⁷ КОЕ/г биопрепарата совместно с комплексным минеральным удобрением - азофоска, в концентрации 20-200 г/м².

11. Способ по п.10, отличающийся тем, что жидкая форма биопрепарата содержит в качестве защитной среды раствор 5% хлорида натрия.

12. Способ по п.10, отличающийся тем, что твердая форма биопрепарата содержит в качестве инертного носителя минеральный или органический носитель, на котором иммобилизован консорциум штаммов бактерий: Rhodococcus qingshengii БАК-ПАУ-1 ВКПМ АС-1946, Pusillimonas ginsegisoli БАК-ПАУ-2 ВКПМ В-11370, Shinella granuli БАК-ПАУ-3 ВКПМ В-11371 в соотношении 1:20.

13. Способ по п.12, отличающийся тем, что в качестве минерального или органического носителя может быть, например, верховой торф, вспученный перлит, вермикулит, шелуха гречихи, полипропиленовое волокно.