СПОСОБ НЕИНВАЗИВНОЙ ЭКСПРЕСС-ДИАГНОСТИКИ ПАТОЛОГИЧЕСКИХ ИЗМЕНЕНИЙ В ТКАНЯХ В РЕЖИМЕ РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ IN VIVO Российский патент 2024 года по МПК A61B5/00 A61B1/05 G01N23/46 

Изобретение относится к медицине, а именно к диагностическим неинвазивным методам исследования, в частности в области оториноларингологии, гинекологии, проктологии, онкологии, урологии, андрологии, гастроэнтерологии, и может быть использовано для экспресс-диагностики патологических изменений в тканях в режиме реального времени in vivo.

Согласно Международной Патентной Классификации изобретение относится к классу G01.

Рутинные методы исследования (визуальный осмотр, пальпация, стандартное эндоскопическое исследование) не дают информации об изменениях ткани на клеточном уровне: диспластические изменения (предрак) имеют стадийность, на ранних стадиях видимые глазом изменения могут не определяться; дисплазия эпителия иногда может носить обратимый характер, но ее своевременное выявление позволяет взять под динамическое наблюдение пациента и отслеживать течение патологического процесса. Патоморфологические методы диагностики требуют определенных временных затрат с учетом забора материала, транспортировки, подготовки и собственно исследования, что приводит к потере времени для постановки окончательного диагноза и определения лечебной тактики. При наличии видимого образования, как правило, проводится только биопсия измененного участка, при этом остаются без внимания окружающие ткани, в которых также могут быть изменения на клеточном уровне. В результате, создается неверное представление о площади поражения, стадийности процесса.

Современные стандарты диагностики включают эндоскопическое исследование, при котором объект или участок ткани визуализируется в натуральную величину, состояние клеточного монослоя и подслизистых структур не определяется. Цитологическое и гистологическое исследования (соскоб, биопсия, пункция участков ткани, подозрительных на опухоль) - требует временных затрат, а также травматизации тканей. Однако выполнение биопсии или эндоскопической резекции с целью проведения расширенного гистологического исследования сопряжено с риском развития осложнений (кровотечение, перфорация), что особенно важно для пациентов, постоянно принимающих дезагреганты и антикоагулянты, а также для больных с различными формами патологии свертывающей системы, так как вероятность кровотечения возрастает многократно. Кроме того, биопсийный материал может оказаться неинформативным, что

обусловливает необходимость выполнения повторных исследований, которые сопряжены в свою очередь с увеличением материальных и временных затрат.

Рост заболеваемости различными формами патологии, в том числе онкологическими процессами, в различных нозологических группах, независимо от пола и возраста пациента, требует создания высокотехнологичной экспертной системы диагностики патологических состояний в живом организме, минуя длительный этап патоморфологического исследования. Важным требованием к подобной системе является оценка состояния подлежащих тканей.

Таким образом, задачей современных диагностических методик является неинвазивная атравматичная экспресс-диагностика патологических изменений тканей с помощью высокотехнологичных диагностических пособий.

Известен метод хромоскопии. В настоящее время в качестве витальных красителей применяются следующие вещества: раствор йода (раствор Люголя), метиленовый синий, индигокармин, конго-красный и нейтральный красный. При эзофагогстродуоденоскопии для оценки распространенности опухолевого процесса применяют растворы Люголя и метиленового синего. Водный раствор йода стали применять при эзофагоскопии для уточняющей диагностики воспалительных и неопластических заболеваний пищевода. Впервые методика была применена R. Voegeli, который в 1966 г. применил методику хромоэзофагоскопии с водным раствором йода. Нормальный эпителий пищевода окрашивается в коричневый цвет, а участки лейкоплакии, воспаления и злокачественные поражения слизистой оболочки пищевода и желудка не окрашиваются. В 1980 г. А. Mandardetal установил, что участки слизистой оболочки пищевода, пораженные карциномой in situ, а также при дисплазиях тяжелой степени и в зоне пептического эзофагита, при хромоэзофагоскопии с раствором Люголя остаются неокрашенными [Сорокина Т.С. История медицины. Учебник для студ. высш. мед. учеб. заведений. 3-е изд. - М.: Академия. - 2004. - 560 с. 6. Суровцев И.Ю., Королев В.Н. Хромоэндоскопия в оценке распространенности опухолевого процесса желудка и пищевода // Сиб. онкол. журнал. - 2007. - Приложение №2. - С. 105-106]. При проведении подобной диагностики состояние и характеристики клеточного монослоя, подслизистых структур не идентифицируется. Также не определяются характеристики сосудистого рисунка. Не представляется возможным идентифицировать предраковые состояния на начальных стадиях.

Известен способ эндоскопического рассеивания метиленового синего в желудке, который описал Tsuda в 1967 г. Одновременно методику фиброэзофагогастродуоденоскопии с использованием метиленового синего в качестве

красителя применяли K. Ida в 1973 г., Sh. Suzuki в 1973 г. для диагностики заболеваний двенадцатиперстной кишки и желудка. Авторы установили, что после интрагастрального введения водного раствора метиленового синего и последующего смывания его водой обнаруживаются участки избирательного окрашивания слизистой оболочки в синий цвет. При гистологическом исследовании биоптатов из окрашенных участков были выявлены рак и кишечная метаплазия. Методику хромоэндоскопии с метиленовым синим в дальнейшем применяли Н.М. Gidoe 1976 г., Ch. Can в 1983 г., Л.Н. Иншаков, Д.Д. Курманов в 1983 г., М.С. Струве в 1968 г., K. Kawal в 1979 г., которые установили, что метиленовый синий избирательно проникает через мембрану в цитоплазму опухолевых и метаплазированых эпителиальных клеток и вызывает их окрашивание. М. Hashimoto в 1980 г. подтвердил мнение указанных авторов данными экспериментальной работы и сообщил, что окрашивание измененных участков слизистой оболочки желудка отражает ранний период дисрегенераторных изменений [Суровцев И.Ю., Королев В.Н. Хромоэндоскопия в оценке распространенности опухолевого процесса желудка и пищевода // Сиб. онкол. журнал. - 2007. - Приложение №2. - С. 105-106]. При проведении подобной диагностики состояние и характеристики клеточного монослоя, подслизистых структур не идентифицируется. Также не определяются характеристики сосудистого рисунка.

Известен способ узкоспектральной эндоскопии NBI (Narrow Band Imaging), при котором световые фильтры позволяют получить детальное изображение сосудистого рисунка тканей, его изменений, характерных для патологических участков воспалительного генеза, а также для предраковых заболеваний и ранних форм рака. Кроме того, такая эндоскопическая система повышает контрастность изображения, что создает эффект виртуальной хромоскопии [Малихова О.А., Поддубный Б.К., Кашин С.В., Погорелов Н.Н., Круглова И.И., Поддубная И.В. Современное эндоскопическое исследование желудка с использованием методик узкоспектральной и увеличительной эндоскопии: техника проведения и алгоритмы диагностики // Доказательная гастроэнтерология, 2, 2016. С. 3-12]. При проведении подобной диагностики состояние и характеристики клеточного монослоя, подслизистых структур не идентифицируется, не определяются признаки атипии в том числе на ранних стадиях.

Известен способ магнификационной эндоскопии (Zoom-эндоскопия), который позволяет оценить строение эпителия, выявить ее неоднородность, возникающую при патологических процессах. Метод основан на изменении фокусного расстояния между линзами на дистальном конце эндоскопа. Специализированное программное обеспечение позволяет на экране монитора получить изображение увеличенного объекта без

искажений и артефактов. Для описания изменений слизистой на поверхности полиповидных образований была использована классификация, предложенная N. Sakaki в 2005 г., которая основана на изменении формы желудочной ямки (Pitpattern), представляющей собой щелевидные вдавления покровного эпителия в собственную пластинку глубиной 0,1-0,2 мм, в которые открываются железы желудка и данных патогистологических исследований. Согласно данной классификации, выделено 6 типов структур ямочного эпителия [Т.В. Бочкова, Д.Р. Мухамадеева. Современные тренды эндоскопической и лабораторной диагностики при раннем раке желудка. // Креативная хирургия и онкология. С. 61-68.].

Известен способ аутофлюоресцентной эндоскопии AFI (Auto Fluorescence Imaging), основанной на феномене аутофлюоресценции эндогенных флюорофоров слизистой оболочки пищеварительной системы. Организм человека содержит большое число молекул, обладающих феноменом аутофлюоресценции. В аспекте применения этого феномена в эндоскопической диагностике опухолей пищеварительного тракта наиболее важным представляются такие соединения, как восстановленная форма никотинамидинуклеотидфосфата, флавинадениндинуклеатид-рибофлавин-51-аденозиндифосфат, коллаген, эластин, порфирины. Известно, что концентрация именно этих субстанций значительно повышается в опухолевой ткани. В результате подобного исследования можно наблюдать усиленную аутофлюоресценцию в тканях новообразований [Кашин С.В. Современные аспекты выполнения колоноскопии с целью скрининга полипов и колоректального рака. Доказательная гастроэнтерология. 2012;(2):89-99].

Принципиально новым направлением эндоскопической диагностики, позволяющим осуществить постановку точного диагноза во время проведения исследования, является конфокальная лазерная эндомикроскопия. Основным преимуществом конфокальной перед традиционной световой микроскопией является возможность исследования препарата различной толщины (в зависимости от используемого источника света) без приготовления микротомных срезов и фиксации. Методика дает две уникальные возможности - исследование тканей на клеточном уровне в состоянии физиологической жизнедеятельности и демонстрации результатов (т.е. структур клетки и ее активности) в четырех измерениях - высота, ширина, глубина и время, позволяет выявить изменения ткани, в частности патологические изменения эпителия, его морфологические особенности, состояние внутриклеточных структур, межклеточных контактов, особенности клеточного функционирования, сосудистую морфологию, наличие новообразований в режиме реального времени in vivo.

Еще одним принципиально новым направлением является оптическая когерентная томография (ОКТ) - это метод диагностики, который позволяет с высокой разрешающей способностью получать томографические срезы внутренних биологических систем. Преимущество и диагностическая ценность эндоскопической кросс-поляризационной оптической когерентной томографии заключается в том, что методы традиционной эндоскопической визуализации, применяемой в стандартах оказания медицинской помощи, обеспечивают диагностику только поверхностей слизистых оболочек органов, а методы оптической когерентной томографии позволяют получать структурные изображения слизистого слоя толщиной до 3,2 миллиметров с высоким пространственным разрешением, т.е. визуализировать не только слизистую оболочку, но и подлежащие структуры, такие как собственная пластинка слизистой оболочки, подслизистую основу и подлежащие структуры в режиме физиологического функционирования in vivo. Таким образом, эндоскопическая кросс-поляризационная оптическая когерентная томография позволяет не только обнаружить патологию (патологические изменения слизистой оболочки различной этиологии, в том числе неопластические процессы), но и оценить ее границы и глубину инвазии.

Задачей изобретения является создание объективного, неинвазивного способа диагностики патологических изменений в тканях в режиме реального времени in vivo с помощью сочетания современных методов визуализации: конфокальной лазерной эндомикроскопии и кросс-поляризационной оптической когерентной томографии. Способ, основанный на получении микроскопического изображения с 380-1150-кратным увеличением с поверхности исследуемой области при использовании датчика конфокальной лазерной эндомикроскопии и одномоментным получением ОКТ-изображений в прямой поляризации при использовании датчика кросс-поляризационной оптической когерентной томографии, позволяет выявить патологические изменения эпителия, его морфологические особенности, состояние внутриклеточных структур, межклеточных контактов, особенности клеточного функционирования, сосудистую морфологию, наличие новообразований, состояние подслизистых структур в режиме реального времени in vivo.

При этом срезами являются срезы внутренних объектов и их структур, визуализация состояния не только слизистой оболочки, но и подлежащих тканей, таких как собственная пластинка слизистой оболочки, подслизистая основа и подлежащие структуры в глубину до 3,2 мм в режиме физиологического функционирования in vivo.

Техническим результатом изобретения является повышение информативности и достоверности способа диагностики патологических изменений тканей, также снижение трудоемкости диагностики и времени обследования, получение результата в режиме экспресс и in vivo.

Технический результат согласно изобретению достигается тем, что проводят исследование с помощью датчика конфокальной лазерной эндомикроскопии и получают

микроскопическое изображение с 380-1150-кратным увеличением с поверхности слизистой оболочки визуально доступных отделов ротоглотки, полости носа, уретры, влагалища, прямой кишки, что позволит производить прижизненный морфологический анализ на клеточном уровне в режиме реального времени in vivo. Для каждой анатомо-физиологической области предполагается использование специализированной насадки. Визуальную оценку ткани при использовании конфокальной лазерной эндомикроскопии осуществляют после внутривенного введения 5 мл флуоресцеин натрия 10% (стерильный раствор), эффект от которого сохраняется в течение 30-60 минут (в среднем 45 минут) либо поверхностного нанесения флуоресцентных красителей, имеющих флуоресцентное свечение в диапазоне длин волн 505-550 нм с экспозицией 3 мин, после чего датчик конфокальной лазерной эндомикроскопии устанавливают непосредственно на поверхности исследуемого участка слизистой оболочки, формируют монохромное изображение тканевых и клеточных элементов слизистой оболочки дыхательных путей, поступающее с видеоэндоскопической системы с увеличением в 1000 раз в режиме реального времени in vivo, записывают и архивируют с использованием внешних записывающих устройств, получаемое изображение анализируют и оценивают с использованием автоматической обработки эндомикрофотограмм. Затем проводят исследование слизистой оболочки дыхательных путей с помощью датчика кросс-поляризационной оптической когерентной томографии. Регистрацию состояния слизистой оболочки дыхательных путей проводят методом кросс-поляризационной оптической когерентной томографии с одномоментным получением ОКТ-изображений в прямой поляризации. ОКТ-сканирование проводят с помощью микрозонда, который вводится в исследуемую область и соприкасается со слизистой оболочкой дыхательных путей, в результате чего получают ОКТ-изображение тканей в продольном сечении. Каждое ОКТ изображение имеет следующие характеристики: размер 2x2 мм, 200x200 пикселей, разрешение по глубине 15 мкм в свободном пространстве, продольное разрешение 25 мкм. Изображение регистрируется в течение 2 секунд. При получении изображений в ходе исследования датчиков конфокальной лазерной эндомикроскопии и кросс-поляризационной оптической когерентной томографии на экране прибора формируются изображения, которые архивируют с последующим компьютерным анализом изображения. Специальные прикладные программы могут быть использованы для первичной диагностики, проведения телеконсультации и динамического наблюдения.

Пример осуществления способа.

Пациент А., 1969 г.р., клинический диагноз: Рак правой небной миндалины, стадия I, (pT1N0M0).

На первом этапе была выполнена биопсия правой небной миндалины, в которой был подтверждено наличии атипичных клеток. При выполнении магнитно-резонансной томографии головы, шеи. органов грудной клетки метастазов и поражения лимфатических узлов выявлено не было. При проведении конфокальной лазерной эндомикроскопии с поверхности опухоли после орошения слизистой оболочки дыхательных путей и окружающей неизменной слизистой раствором флуорофора с экспозицией 3 мин на экране прибора оценивали полученное изображение. Неизменная слизистая была представлена ровными округлыми клетками небольших размеров, расположенных равномерно.

При дальнейшем осмотре в области опухоли были выявлены мономорфные клетки небольших размеров с центральными гиперхромными ядрами, иногда встречались полигональные клетки с ободком цитоплазмы но периферии. Также определялся клеточный плеоморфизм, наиболее выраженный в области визуализируемой опухоли и менее выраженный в области визуально не затронутой опухолевым процессом ткани.

При проведении исследования датчиком кросс-поляризационной оптической когерентной томографии изменения в области опухолевого процесса на ОКТ-изображениях определялись в виде снижения контраста слоев, на некоторых участках граница между слизистой оболочкой дыхательных путей и подслизистыми тканями полностью отсутствовала. Также в области визуально на затронутых опухолевым процессом участков определялось снижение четкости границ слоев, что соответствовало выявленным в ходе конфокальной лазерной эндомикроскопии участкам клеточного плеоморфизма. Отмечался петлевидный характер сосудов опухоли с многочисленными изгибами и переплетениями.

Использование предлагаемого способа в клинике позволило в экспресс-режиме реально времени in vivo проводить морфологическое исследование доступных для визуального осмотра областей слизистой оболочки орофарингеальной области, полости носа, влагалища, шейки матки, прямой кишки, пищевода, желудка, по средствам выявления патологических изменений эпителия, его морфологических особенностей, определения состояния внутриклеточных структур, межклеточных контактов, особенностей клеточного функционирования, сосудистой морфологии, состояния подслизистых структур, определить истинные границы опухолевого поражения, оценить степень инвазии процесса, получить данные о состоянии визуально неизмененных тканей и выявить в них патологические процессы на клеточном уровне, а также получить возможность интраоперационного использования с целью определения объема резекции.

Таким образом, заявленный способ диагностики позволяет:

- проводить экспресс-диагностику состояния тканей, аналогичную гистологическому исследованию, в живом организме в режиме реального времени in vivo, в том числе рамках задачи скрининга;

- улучшить эффективность диагностики скрытых ранних форм опухолевых процессов, снизить количество ложно-положительных результатов;

- определить истинные границы опухолевого поражения;

- разработать дифференциально-диагностические критерии для различных форм патологии неопухолевого характера, а также предраковых и неопластических процессов на основе оценки тканевой и клеточной архитектоники слизистой оболочки, подслизистых слоев, характеристики микрососудов.

Изобретение относится к медицинской технике, а именно к способу неинвазивной экспресс-диагностики патологических изменений в слизистой оболочке дыхательных путей. В способе, в котором проводят исследование с помощью датчика конфокальной лазерной эндомикроскопии и получают изображение с 380-1150-кратным увеличением с поверхности слизистой оболочки дыхательных путей, визуальную оценку слизистой оболочки дыхательных путей при использовании конфокальной лазерной эндомикроскопии осуществляют после внутривенного введения 5 мл флуоресцеина натрия 10% либо поверхностного нанесения флуоресцентных красителей, имеющих флуоресцентное свечение в диапазоне длин волн 505-550 нм с экспозицией 3 мин, после чего датчик конфокальной лазерной эндомикроскопии устанавливают непосредственно на поверхности исследуемого участка слизистой оболочки дыхательных путей. Формируют монохромное изображение тканевых и клеточных элементов слизистой оболочки дыхательных путей, поступающее с видеоэндоскопической системы с увеличением в 1000 раз в режиме реального времени in vivo, записывают и архивируют с использованием внешних записывающих устройств. Получаемое изображение анализируют и оценивают с использованием автоматической обработки эндомикрофотограмм. Затем проводят исследование слизистой оболочки дыхательных путей с помощью датчика кроссполяризационной оптической когерентной томографии. Регистрацию состояния слизистой оболочки дыхательных путей проводят методом кроссполяризационной оптической когерентной томографии с получением ОКТ-изображений в прямой поляризации. ОКТ-сканирование проводят с помощью зонда, который вводится в исследуемую область и соприкасается со слизистой оболочкой дыхательных путей, в результате чего получают ОКТ-изображение слизистой оболочки дыхательных путей в продольном сечении. Каждое ОКТ-изображение имеет следующие характеристики: размер 2×2 мм, 200×200 пикселей, разрешение по глубине 15 мкм в свободном пространстве, продольное разрешение 25 мкм, изображение регистрируется в течение 2 секунд. При получении изображений в ходе исследования датчиков конфокальной лазерной эндомикроскопии и кроссполяризационной оптической когерентной томографии на экране прибора формируются изображения, которые архивируют с последующим компьютерным анализом изображения. Техническим результатом изобретения является повышение информативности и достоверности способа диагностики патологических изменений тканей, также снижение трудоемкости диагностики и времени обследования, получение результата в режиме экспресс и in vivo.

Способ неинвазивной экспресс-диагностики патологических изменений в слизистой оболочке дыхательных путей, в котором проводят исследование с помощью датчика конфокальной лазерной эндомикроскопии и получают изображение с 380-1150-кратным увеличением с поверхности слизистой оболочки дыхательных путей, при этом визуальную оценку слизистой оболочки дыхательных путей при использовании конфокальной лазерной эндомикроскопии осуществляют после внутривенного введения 5 мл флуоресцеина натрия 10% либо поверхностного нанесения флуоресцентных красителей, имеющих флуоресцентное свечение в диапазоне длин волн 505-550 нм с экспозицией 3 мин, после чего датчик конфокальной лазерной эндомикроскопии устанавливают непосредственно на поверхности исследуемого участка слизистой оболочки дыхательных путей, формируют монохромное изображение тканевых и клеточных элементов слизистой оболочки дыхательных путей, поступающее с видеоэндоскопической системы с увеличением в 1000 раз в режиме реального времени in vivo, записывают и архивируют с использованием внешних записывающих устройств, получаемое изображение анализируют и оценивают с использованием автоматической обработки эндомикрофотограмм, затем проводят исследование слизистой оболочки дыхательных путей с помощью датчика кроссполяризационной оптической когерентной томографии, регистрацию состояния слизистой оболочки дыхательных путей проводят методом кроссполяризационной оптической когерентной томографии с получением ОКТ-изображений в прямой поляризации, ОКТ-сканирование проводят с помощью зонда, который вводится в исследуемую область и соприкасается со слизистой оболочкой дыхательных путей, в результате чего получают ОКТ-изображение слизистой оболочки дыхательных путей в продольном сечении, при этом каждое ОКТ-изображение имеет следующие характеристики: размер 2×2 мм, 200×200 пикселей, разрешение по глубине 15 мкм в свободном пространстве, продольное разрешение 25 мкм, изображение регистрируется в течение 2 секунд, при получении изображений в ходе исследования датчиков конфокальной лазерной эндомикроскопии и кроссполяризационной оптической когерентной томографии на экране прибора формируются изображения, которые архивируют с последующим компьютерным анализом изображения.