Способ скрининговой дифференциальной диагностики предраковых заболеваний и рака слизистой оболочки рта (СОР) Российский патент 2021 года по МПК A61B5/1468 G01N33/483 G01N33/50 

Изобретение относится к области медицины, а именно к стоматологии, и может быть использовано для ранней диагностики и дифференциальной диагностики предраковых заболеваний слизистой оболочки рта (СОР), в частности плоского лишая (ПЛ), лейкоплакии и плоскоклеточного рака СОР (ПР СОР).

Своевременная и эффективная диагностика неопластических поражений СОР по-прежнему остается серьезной проблемой стоматологии и онкологии. Рак ротовой полости расценивается в качестве одной из наиболее частых причин, связанных с осложнениями и смертностью во всем мире, с более чем десятью миллионами случаев, которые диагностируются ежегодно. Несмотря на успехи в лечении рака ротовой полости с помощью современных методов, таких как хирургия, радиология и химиотерапия, долгосрочная выживаемость больных составляет менее 50% [Кононенко В.И., Оптимизация системы раннего прогнозирования прогрессирования рака слизистой оболочки полости рта: автореф. дис.… д-ра мед. наук: 14.01.14; 14.01.12 / Кононенко Владимир Иванович. - Волгоград, 2017. - 39 с.].

Развитию рака СОР зачастую предшествуют длительно существующие предраковые заболевания СОР (ПЗ СОР), которые в свою очередь подразделяются на облигатные и факультативные. Наиболее распространенными из них являются типичная, эрозивно-язвенная и гиперкератотические формы плоского лишая (ПЛ), плоская, эрозивная и веррукозная формы лейкоплакии. Известно, что эрозивно-язвенные формы ПЗ СОР характеризуются торпидными течением к лечебным мероприятиям, протекают с выраженными воспалительными деструктивными изменениями в тканях ротовой полости и болевым синдромом, а также характеризуются склонностью к рецидивирующему течению. По данным различных авторов, факультативные ПЗ СОР имеют вероятность озлокачествления от 1 до 20% и, наиболее часто трансформируются в плоскоклеточный рак [Гажва С.И. Распространенность стоматологических заболеваний слизистой оболочки полости рта и их диагностика / С.И. Гажва, Т.Б. Степанян, Т.П. Горячева // Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований. - 2014. - №5-1. - С.41-44.].

Плоскоклеточный рак полости рта занимает шестое место в мире по частоте среди злокачественных опухолей всех локализаций. В Российской Федерации заболеваемость злокачественными новообразованиями полости рта составляет 2-4% от общего числа злокачественных опухолей человека.

В связи с этим особую актуальность приобретает разработка способа ранней неинвазивной диагностики и выявления начальных признаков малигнизации, который позволяет диффереренцировать ПЗ СОР и начальные признаки ПР СОР и может быть использован в качестве первичного скринингового обследования.

Несмотря на кажущуюся простоту клинической визуализации ПЗ СОР, учитывая их наружную локализацию, определение конкретной нозологической формы предрака и ее дифференциальной диагностики со злокачественными заболеваниями для врачей первичного звена затруднительна. Причинами запоздалой диагностики ПЗ СОР являются позднее обращение больных за медицинской помощью, «стертость» клинической картины, так как различные ПЗ СОР имеет сходные маркерные патологические элементы, отсутствие доступных, малоинвазивных и быстрых методов диагностики, что приводит к диагностическим ошибкам [Гилева, О.С. Предраковые заболевания в структуре заболеваний слизистой оболочки рта / Гилева О.С., Либик Т.В., Позднякова А.А., Сатюкова Л.Я. // Проблемы стоматологии. - 2013. - №2. - с. 1-9.].

Проведенные исследования среди врачей-стоматологов показали, что около 40% специалистов дифференцируют ранние проявления рака слизистой полости рта, а в своей практике около 4,2% респондентов используют морфологические диагностические мероприятия по выявлению рака данной локализации [Кряжинова И.А., Олесов Е.Е., Садовский В.В., Степанов А.Ф., Попов А.А. Онкологическая настороженность врачей-стоматологов по данным анкетирования в Московской области. Медицина экстремальных ситуаций. 2019; 21(2): 244-250.].

Особенно затруднительна ранняя диагностика озлокачествления, поскольку его клинические признаки появляются немного позднее реально возникшей злокачественной трансформации. Так, исследованиями В.П. Харченко и соавт. показано, что более 2/3 больных к моменту обращения в лечебное учреждение и установления диагноза имеют III-IV стадии заболевания. Процент инкурабельных форм рака СОПР из-за диагностических ошибок, по данным разных авторов, достигает 58,4-70% [Каприн А.Д., Старинский В.В., Петрова Г.В. Злокачественные новообразования в России в 2017 году - М.: МНИОИ им. П.А. Герцена, - 2018. - 250 с.].

Разрешение диагностических трудностей большинство авторов видят в вспомогательных методах диагностики (цитологическое исследование, хейлостоматоскопия, биомикроскопия, оптическая когерентная томография, гистология). Однако эти методы имеют ряд существенных недостатков.

Известно, что «золотым» стандартом диагностики неопластических заболеваний СОР является гистологическое исследование, которое в условиях рутинного приема в стоматологической поликлинике имеет существенные затруднения. Забор биоматериала должен проводиться специальным острым хирургическим инструментарием, он отличается травматичностью, риском развития кровотечения. Для забора биопсии необходимы определенные мануальные навыки, зачастую ими владеют только врачи-стоматологи хирургического профиля, а прием пациентов с ПЗ СОР преимущественно ведут стоматологи-терапевты. Важное значение имеет и срок ожидания результата исследования, в данном случае он составляет от 5-7 до 15 дней. Кроме того, не все стоматологические клиники имеют доступ к морфологической лаборатории [Алиева С.Б., Алымов Ю.В., Кропотов М.А. и др. Рак слизистой оболочки полости рта. Онкология. Клинические рекомендации. Под ред. М.И. Давыдова. М.: Издательская группа РОНЦ, 2015. С.27-37.].

Достаточно современным способом диагностики новообразований тканей в том числе и полости рта является оптическая когерентная томография (ОКТ). ОКТ - неинвазивный метод прижизненной диагностики изменений в слоях слизистой оболочки. По принципу действия и изображению на мониторе напоминает УЗИ и основано использовании низкоинтенсивного света ближнего инфракрасного диапазона в качестве зондирующего излучения. Процедура ОКТ заключается в подведении зонда к объекту исследования на 4-6 с, сканирования и получении изображения на экране монитора и его записи в память компьютера вместе дополнительными данными. Результаты исследования здоровой слизистой оболочки характеризуются слоистым изображением с четкой границей между слоями, а при патологических изменениях будет наблюдаться неоднородность слоев. В зависимости от заболевания данные характеристики выглядят по-разному. Преимущества данного метода состоят в том, что ОКТ-изображения используют низкокогерентный свет ближнего инфракрасного диапазона, который считается безопасным для организма, с глубиной зонирования 1,5-2 мм, однако данный способ имеет существенные недостатки, это высокая стоимость оборудования, для получения ОКТ-изображений используется ОКТ-томоскоп, и наличие специалиста, который владеет методикой его использования. Данный метод является дорогостоящим и трудноступным для большинства населения [Семкин В.А., Рабинович О.Ф., Агапитова Л.П., Безруков А.А., Бабиченко И.И. Диагностическая ценность метода когерентной томографии у больных с лейкоплакией слизистой оболочки рта. // Стоматология-2018; 97(1):37-39; Снопова Л.Б. Морфологическая оценка слизистых оболочек человека методом оптической когерентной томографии: Дис... канд. мед. наук. М. 2010.]

В связи с достаточно высокой распространенностью (до 50%) ПЗ в структуре заболеваний СОР, длительным хроническим течением заболевания, недостаточно эффективными результатами существующих методов лечения данной патологии, возможностью малигнизации патологического процесса актуальным является поиск новых методов диагностики, обладающих высокой специфичностью и чувствительностью, с отсутствием травматичных процедур, а также дающих быстрый результат за минимально короткое время и доступных по цене.

Установлено, что наиболее важными свойствами опухолевой клетки являются ее пролиферативная активность, скорость деления, влияющая на клиническую картину заболевания, интенсивность роста опухоли, скорость прорастания. Интенсивный рост опухоли определяет ее злокачественность.

В настоящее время изучение маркеров пролиферативной активности клетки является перспективным свойством для оценки характера опухоли, ее дифференциальной диагностики с предраковой патологией, что, в свою очередь, позволит выявить закономерность, возможность прогнозирования скорости роста опухоли и метастазирования, а также эффективности проводимой терапии.

Пролиферативная активность является ведущим фактором как в механизме злокачественной трансформации клеток, так и в биологическом поведении уже возникших опухолей. Перспективным маркером пролиферативной активности является антиген Ki-67, экспрессирующийся практически во всех фазах клеточного цикла и, соответственно, отражающий величину пролиферативного пула [Петров С.В., Райхлин Н.Т. Руководство по иммуногистохимической диагностике опухолей человека. - Казань, 2004. - 452 с.]

Проведен ряд исследований, изучающих диагностическое значение экспрессии р53 при красном плоском лишае СОР Murti PR и соавт. предположили, что пик гиперэкспрессии р53 по времени близок к моменту трансформации предрака в рак, и не может быть использован в качестве раннего маркера прогнозирования малигнизации предрака [Murti PR. Р53 expression in oral precancer as a marker for malignant potential // J. of Oral Pathology & Medicine. - 1998. - Vol. 27, №5. - Ρ 191-196.] В то же время, некоторые авторы считают, что р53 не может быть использован как единственный маркер для прогнозирования развития рака СОР [Асау R.R., Felizzola C.R. Evaluation of proliferative potential in oral lichen planus and oral lichenoid lesions using immunohistochemical expression of p53 and Ki67 // Oral Oncol. - 2006. - Vol. 42, №5. - Ρ 475-480.]

Известен способ диагностики клинической формы лейкоплакии слизистой оболочки рта (СОР), включающий морфометрическое и иммуногистохимическое исследования гистологических срезов биоптата слизистой оболочки щек из очага поражения, определение толщины эпителия, выявление пролиферирующих клеток с определением маркера пролиферации Ki-67, отличающийся тем, что при помощи морфометрической сетки случайного шага С.Б. Стефанова определяют площади структурных компонентов слизистой оболочки, которую выражают в процентах от общей площади среза, а с использованием морфометрической окулярной сетки Г.Г. Автандилова определяют клеточный состав ткани, выражая количество клеток в процентах от их общего количества в срезе, и при значении площадей: рогового слоя эпителия - 8,73±0,97%, поверхностного слоя эпителия - 4,18±0,44%, промежуточного слоя эпителия - 30,35±3,34%, базального слоя эпителия - 8,74±2,01%, базальной мембраны эпителия - 1,20±0,17%, собственной пластинки слизистой оболочки и подслизистой основы - 42,86±4,77%, кровеносных сосудов собственной пластинки слизистой оболочки - 3,94±0,63%, содержании Ki 67(+) элементов - 2,783±0,179%, CD 45(+) клеток - 15,372±0,836%, CD 3(+) Т-лимфоцитов - 8,020±1,010%, CD 20(+) В-лимфоцитов - 10,664±1,016%, CD 38(+) плазматических клеток - 5,376±1,322, CD 68(+) макрофагов - 5,624±1,004% и МРО(+) нейтрофильных лейкоцитов - 7,420±0,650% диагностируют плоскую форму лейкоплакии СОР; при значении площадей: рогового слоя эпителия - 10,08±2,57%, поверхностного слоя эпителия - 6,68±0,76%, промежуточного слоя эпителия - 31,5±3,98%, базального слоя эпителия - 10,53±0,86%, базальной мембраны эпителия - 2,82±0,41%, собственной пластинки слизистой оболочки и подслизистой основы - 34,08±4,00%, кровеносных сосудов собственной пластинки слизистой оболочки - 4,31±0,48%, содержании Ki 67(+) элементов - 3,548±1,008%, CD 45(+) клеток - 18,372±0,836%, CD 3(+) Т-лимфоцитов - 5,270±1,235%; CD 20(+) В-лимфоцитов - 7,473±1,189%; CD 38(+) плазматических клеток - 3,045±0,879%, CD 68(+) макрофагов - 4,060±0,691% и МРО(+) нейтрофильных лейкоцитов - 3,832±0,561% диагностируют веррукозную форму лейкоплакии СОР; при значении площадей: рогового слоя эпителия - 13,67±2,73%, поверхностного слоя эпителия - 8,53±1,46%, промежуточного слоя эпителия - 39,7±4,09%, базального слоя эпителия - 13,07±2,34%, базальной мембраны эпителия - 3,22±0,54%, собственной пластинки слизистой оболочки и подслизистой основы - 10,27±2,69%, кровеносных сосудов собственной пластинки слизистой оболочки - 5,81±1,29%, наличии лейкоцитарно-некротических масс площадью 5,73±1,13%, содержании Ki 67(+) пролиферирующих клеток - 2,510±0,194%; CD 45(+) клеток - 19,252±1,489%, CD 3(+) Т-лимфоцитов - 5,520±0,926%; CD 20(+) В-лимфоцитов - 8,423±1,098%; CD 38(+) плазматических клеток - 4,035±0,990%, CD 68(+) макрофагов - 6,322±1,025% и МРО(+) нейтрофильных лейкоцитов - 15,184±0,734% диагностируют эрозивно-язвенную форму лейкоплакии СОР. Недостатками данного способа являются инвазивность, травматичный забор биоматериала, трудоемкость и большое количество рассчетов [Способ диагностики клинической формы лейкоплакии слизистой оболочки рта Заявка: 2019136835, 2019.11.15].

За прототип предлагаемого изобретения выбран известный способ дифференциальной диагностики красного плоского лишая и лейкоплакии слизистой оболочки полости рта [Патент РФ 2651050, 2018 г.], включающий проведение иммуногистохимического исследования биоптата очага поражения, отличающийся тем, что проводят исследование по определению локализации экспрессии молекулы клеточной адгезии Е-кадгерина, и при выявлении мембранной экспрессии Е-кадгерина в пределах 99-100%, мембранно-редуцированной экспрессии в пределах 0-1%, отсутствии мембранно-цитоплазматической экспрессии и отсутствии отсутствия иммунореактивности диагностируют красный плоский лишай; при выявлении мембранной экспрессии Е-кадгерина в пределах 80-98% и мембранно-редуцированной экспрессии в пределах 2-20%, отсутствии мембранно-цитоплазматической экспрессии и отсутствии отсутствия иммунореактивности, определяют экспрессию белка пролиферативной активности Κi67 и при локализации клеток экспрессирующих Ki67 только в базальном слое, диагностируют красный плоской лишай, а при локализации клеток экспрессирующих Ki67 в базальном и надбазальных слоях, диагностируют лейкоплакию; при выявлении мембранной экспрессии Е-кадгерина в пределах 30-79% и мембранно-редуцированной экспрессии в пределах 7-20%, а также мембранно-цитоплазматической экспрессии в пределах 30-50% и отсутствия иммунореактивности в пределах 20-50% диагностируют лейкоплакию. Недостатком способа является инвазивность и отсутствие возможности дифференцировки признаков малигнизации.

Задачей предлагаемого изобретения является создание способа дифференциальной диагностики ПЗ и рака СОР, который может быть осуществлен без инвазивного травматичного забора биоматериала у пациента и использован в качестве скринингового обследования.

Технический результат, достигаемый при осуществлении способа, заключается в возможности дифференцировать предраковые заболевания и рак слизистой оболочки рта, выявить начальные признаки малигнизации на ранней стадии заболевания, при первичном скрининговом исследовании, без инвазивного травматичного забора биоматериала у пациента, с получением результатов в достаточно короткие сроки, с возможностью дистанционной оценки результатов.

Предлагаемый способ скрининговой дифференциальной диагностики предраковых заболеваний и плоскоклеточного рака слизистой оболочки рта (СОР) заключается в том, что осуществляют прямое флуоресцентное иммуноцитохимическое (ФИЦХ) исследование биоматериала пациента, который получен путем самостоятельного смыва пациентом в течение 1 минуты из ротовой полости 5% раствором глюкозы после ополаскивания полости рта дистиллированной водой. Определяют степень превышения интенсивности флуоресценции клеточного ядра над интенсивностью флуоресценции цитоплазмы и экспрессию маркеров пролиферации Ki67, р16 и р53. При выявлении в полученном препарате одновременно двух или трех этих маркеров, значения уровня экспрессии которых находятся в диапазоне Ki67 ≥ 10%, Р16 ≥ 5, Р53 ≥ 10% и при значении соотношения интенсивности флуоресценции ядра к интенсивности флуоресценции цитоплазмы 3 и более - предполагают плоскоклеточный рак СОР. При выявлении в препарате одновременно одного или двух маркеров пролиферации, значения уровня экспрессии которых находятся в диапазоне Ki67 5-10%, Р16 1-5%, Р53 1-10% и при значении соотношения интенсивности флуоресценции ядра к интенсивности флуоресценции цитоплазмы менее 3 - предполагают предраковое заболевание СОР. Оценку результатов ФИЦХ исследования с подсчетом процента экспрессии маркеров пролиферации проводят, предпочтительно, в виде мультицветового исследования.

Преимуществами предлагаемого способа является отсутствие инвазивного травматичного забора биоматериала у пациента, сокращение сроков получения результата, высокая чувствительность (до 98%), возможность дистанционной оценки результатов, что повышает доступность метода, и возможность использования данной методики для скринингового исследования населения с целью выявления признаков малигнизации на ранней стадии заболевания и дифференциации предраковых заболеваний и рака слизистой оболочки рта.

Предлагаемый способ может быть использован в качестве первичного скринингового обследования. Использование предлагаемого способа дополнительно к традиционному цитологическому исследованию позволяет значительно повысить результативность выявления и дифференциальной диагностики предраковых заболеваний и рака слизистой оболочки рта.

При разработке способа было проведено клинико-лабораторное обследование 140 пациентов, из них 55 больных с подтвержденным гистологически диагнозом плоскоклеточный рак СОР, 55 больных с ПЗ СОР (35 человек плоский лишай и 20 человек лейкоплакия), 30 здоровых добровольцев. Всем пациентам проведено традиционное цитологическое исследование на стекле, определен индекс кератинизации эпителия СОР, иммуноцитохимическое исследование методом прямой иммунофлуоресценции для оценки уровней экспрессии белков Р53, Р16 и Ki67. Данные сопоставлены с результатами гистологического анализа (в контрольной группе гистологическое исследование не проводили в связи с отсутствием показаний для взятия биопсии).

При первичном обращении каждому пациенту проводили опрос, сбор анамнеза, визуальный осмотр, пальпацию регионарных лимфатических узлов, осмотр зубных рядов и собственно полости рта. Кроме того, осуществляли флуоресцентную диагностику СОР при помощи прибора АФС-Д (Полироник) для более точного выявления границ поражения, фотодокументацию и измерение патологических элементов. Далее проводили забор биоматериала по следующей методике: пациент самостоятельно после двух кратного полоскания ротовой полости дистиллированной водой в объеме 30 мл, в течение 1 минуты, выполняет смыв из ротовой полости раствором (стерильным) 5% глюкозы в объеме 10 мл. При выполнении процедуры пациент в течение 5 минут колебательными движениями перемещает раствор по ротовой полости, после чего сплевывает его в стерильный одноразовый пластиковый контейнер. Контейнер маркируется и в сопровождении направления доставляется в лабораторию.

С целью определения экспрессии маркеров пролиферации Ki67, Ρ16, Р53, в исследуемом материале выполняли иммуноцитохимическое исследование методом прямой иммунофлуоресценции с использованием первично меченых флуоресцентных антител к Р53-Су5 (мышиные, моноклональные, клон Pab240), P16-AlexaFluor488 (кроличьи, моноклональные, клон EP1551Y), Ki67-Cy3 (мышиные, моноклональные, клон EPR3610) («Abcam», Великобритания). Для подтверждения отсутствия неспецифического связывания применяемых антител с целевыми белками использованы изотопические контроли к Р53 (мышиные, моноклональные, меченые Су5, IgG2a, клон MG2a-53), к Р16 (кроличьи, моноклональные, меченые AlexaFluor488, IgG, клон EPR25A), к Ki67 (мышиные, моноклональные, меченые Су3, IgG1, клон СТ6) («Abcam», Великобритания).

В исследовании использовался не фиксированный материал, полученный путем смыва с ротовой полости. Время инкубации с антителами составляло 15-30 минут в темноте. Визуализация флуоресценции проводилась с помощью микроскопа «Leica DM1000» (Leica, Германия), используемое увеличение х200. Анализ полученных изображений проводился с помощью программы AxioVision Rel.4.8 (Carl Zeiss, Германия), в ходе которого определялось количество клеток с положительной экспрессией исследуемых антигенов, т.е. наличием в клетке интенсивного свечения ядра в диапазоне эмиссии выбранных флуорофоров. Замеры интенсивности свечения выполняли в программе AxioVision Rel.4.8 (Carl Zeiss, Германия). С помощью программы делали замеры интенсивности свечения фона, цитоплазмы и ядра исследуемых клеток. В каждом препарате просматривали не менее 10 полей зрения. Полученный результат представляли в процентах в расчете на 100 клеток.

Было показано, что экспрессия всех трех маркеров повышалась в группах пациентов с раковой и предраковой патологией по сравнению с контролем. При этом в цитологических препаратах контрольной группы не выявлено клеток, экспрессирующих белок Р53. Экспрессию белка Ki67 в этой группе детектировали в 8 образцах из 30, при этом исследуемые образцы характеризовались наличием признаков воспаления.

Постановка изотипических контролей продемонстрировала наличие низкого уровня фоновой флуоресценции, что свидетельствует об отсутствии неспецифического связывания используемых моноклональных антител с целевыми белками.

Полученные в результате обследования данные позволили установить следующие критерии для дифференциальной диагностики:

Предварительный диагноз рак СОР:

1. В препарате определяются два и более маркера одновременно с уровнем экспрессии:

Ki67 ≥ 10%

Р16 ≥ 5

Р 53 ≥ 10%

2. Флуоресценция клеточного ядра интенсивнее флуоресценции цитоплазмы в 3 и более раза.

Предварительный диагноз предрак СОР:

1. В препарате определяется один или два маркера с уровнем экспрессии:

Κi67 5-10%

Р16 1-5%

Р 53 1- 10%

2. Флуоресценция клеточного ядра интенсивнее флуоресценции цитоплазмы менее, чем в 3 раза.

При отсутствие пред- и опухолевой патологии в препарате может определяться не более один маркер - Ki67 или Ρ16, при этом уровень экспрессии должен составлять:

Κi67 менее 5%

Р16 менее 1%

Р 53 - положительная реакция отсутствует.

Возможность осуществления изобретения может быть продемонстрирована следующими примерами.

Пример 1 конкретного исполнения дан в виде выписки из амбулаторной карты.

Больная Н., 1964 г.р. Обратилась с жалобами на наличие язвы на боковой поверхности языка слева, резко болезненной при приеме пищи. Считает себя больной в течение 6 месяцев, неоднократно была на приеме у стоматолога и ЛОР-врача, назначенное лечение оказалось безуспешным. Глотание болезненное, язык подвижный. Из сопутствующей патологии отмечает: хронический гастродуоденит.

При объективном осмотре: конфигурация лица не изменена, кожные покровы чистые, регионарные лимфатические узлы не пальпируются.

Слизистая оболочка правой и левой щек бледно-розового цвета, равномерно увлажнена. На боковой поверхности корня языка слева локализуется язва овальной формы с неровными подрытыми краями, размерами 1,5*1,0 см. При аутофлюоресцентной диагностике наблюдается гашение люминесценции («эффект темного пятна»).

Произведен самостоятельный смыв по описанной выше методике, соскоб на стекло и забор биопсии. Гемостаз.

ФИЦХ-исследование: проведена оценка интенсивности флуоресценции в программе AxioVisionLE.Rel.4.8., фирмы Carl Zeiss, Германия

Оцениваемые критерии и шкала оценки:

В процессе исследования оценивалась флуоресценция клеточного ядра в эпителиальной клетке с помощью программного обеспечения AxioVisionLE.Rel.4.8., Carl Zeiss, Германия.

Критерии и пример оценки:

С помощью программы сделаны замеры интенсивности свечения фона, цитоплазмы и ядра исследуемых клеток.

Критерием положительной реакции принято считать величину значения соотношения интенсивности флуоресценции клеточного ядра и интенсивности флуоресценции цитоплазмы - 3 и более (рис. 1-3).

Результат исследования выражен в процентах положительных клеток на 100 исследованных клеток.

Полученные результаты (рис. 1-3)

• флуоресценция фона - 1630

• флуоресценция цитоплазмы клетки - 7900

• флуоресценция ядра клетки - 28194.

интенсивность флуоресценции цитоплазмы = флуоресценция цитоплазмы-флуоресценция фона = 7900-1630 = 6270.

интенсивность флуоресценции ядра = флуоресценция ядра-флуоресценция фона-флуоресценция цитоплазмы = 28194-7900-1630 = 18664.

интенсивность флуоресценции ядра/интенсивность флуоресценции цитоплазмы = 18664/6270 = 3.

Значения экспрессии маркеров пролиферации:

Ki67 = 10%

Р16 = 5%

Ρ 53 = 1%

Экспрессия двух маркеров - Ki67 и Ρ16, и значение соотношения интенсивности флуоресценции ядра к интенсивности флуоресценции цитоплазмы соответствует критериям, полученным для рака СОР. ФИЦХ-заключение: цитологическая картина и экспрессия маркеров соответствует изменениям злокачественного характера (карцинома).

Цитограмма: в цитологическом препарате преимущественное раздельно лежащие клетки плоского эпителия с признаками выраженного клеточного и ядерного полиморфизма, в части клеток отмечается наличие патологического ороговения. Цитологическая картина плоскоклеточного ороговевающего рака.

Гистологическое заключение: плоскоклеточная карцинома с тенденцией к ороговению.

Таким образом, результаты, полученные при ФИЦХ-исследовании биологического материала путем смыва из полости рта пациента, соответствуют результатам, полученным в результате цитологического и гистологического исследования.

Пример 2 конкретного исполнения дан в виде выписки из амбулаторной карты.

Больной К., 1948 г.р. Обратился с жалобами на наличие язвы на нижнепередней поверхности языка слева, резко болезненной при приеме пищи. Считает себя больным в течение 4-х месяцев. Глотание адекватное, безболезненное, язык подвижный. Из сопутствующей патологии отмечает: ишемическая болезнь сердца.

При объективном осмотре: конфигурация лица не изменена, кожные покровы чистые, регионарные лимфатические узлы не пальпируются.

Слизистая оболочка правой и левой щек бледно-розового цвета, равномерно увлажнена. На нижнепередней поверхности языка слева локализуется язва округлой формы с неровными подрытыми краями, с переходом на слизистую оболочку дна полости рта, размерами 2,0*2,0 см. При аутофлюоресцентной диагностике наблюдается гашение люминесценции («эффект темного пятна»).

Произведен самостоятельный смыв по описанной выше методике, соскоб на стекло и забор биопсии. Гемостаз.

ФИЦХ-исследование проведено так же, как в примере 1.

Полученные результаты:

• флуоресценция фона - 1893

• флуоресценция цитоплазмы клетки - 8651

• флуоресценция ядра клетки - 31513.

интенсивность флуоресценции цитоплазмы = флуоресценция цитоплазмы-флуоресценция фона = 8651-1893 = 6758.

интенсивность флуоресценции ядра = флуоресценция ядра-флуоресценция фона-флуоресценция цитоплазмы = 31513-8651-1893 = 20969

интенсивность флуоресценции ядра/интенсивность флуоресценции цитоплазмы = 20969/6758 = 3,1

Таким образом, данная клеточная реакция считается положительной.

Значения экспрессии маркеров пролиферации:

Ki67 = 17%

Ρ16 = 5%

Ρ 53 = 11%

Экспрессия всех трех маркеров и значение соотношения интенсивности флуоресценции ядра к интенсивности флуоресценции цитоплазмы соответствует критериям, полученным для рака СОР.

ФИЦХ-заключение: цитологическая картина и экспрессия маркеров соответствует изменениям злокачественного характера (карцинома).

Цитограмма: в цитологическом препарате преимущественное раздельно лежащие клетки плоского эпителия с признаками выраженного клеточного и ядерного полиморфизма, в части клеток отмечается наличие патологического ороговения. Цитологическая картина плоскоклеточного ороговевающего рака.

Гистологическое заключение: плоскоклеточная карцинома с тенденцией к ороговению.

Таким образом, результаты, полученные при ФИЦХ-исследовании биологического материала путем смыва из полости рта пациента, подтверждены при проведении цитологического и гистологического исследования.

Пример 3 конкретного исполнения дан в виде выписки из амбулаторной карты

Больная Г., 68 лет. Обратилась с жалобами на наличие эрозий на слизистой оболочке щек, болезненных при приеме пищи и в покое. Считает себя больной в течение года. Предшествующее лечение не было эффективным. Из сопутствующей патологии отмечает: хронический гастродуоденит, сахарный диабет 2 типа.

При объективном осмотре: конфигурация лица не изменена, кожные покровы чистые, регионарные лимфатические узлы не пальпируются.

Слизистая оболочка правой и левой щек отечна, гиперемирована, в ретромолярной области локализуются несколько эрозий неправильной формы. Суммарная площадь - 4,4 см². Вокруг эрозивных элементов и по линии смыкания зубов, а также на слизистой оболочке альвеолярных отростков верхней челюсти папулы жемчужно-белого цвета, образующие рисунок в виде кружев. При аутофлюоресцентной диагностике наблюдается гашение флуоресценции («эффект темного пятна») на фоне зеленого свечения.

Предварительный клинический диагноз: плоский лишай слизистой оболочки рта, эрозивная форма.

Произведен самостоятельный смыв по описанной выше методике.

ФИЦХ-исследование проведено так же, как в примере 1.

Полученные результаты (рис. 4-6)

• флуоресценция фона - 905

• флуоресценция цитоплазмы клетки - 1493

• флуоресценция ядра клетки - 3806.

интенсивность флуоресценции цитоплазмы = флуоресценция цитоплазмы-флуоресценция фона = 1493-905=588.

интенсивность флуоресценции ядра = флуоресценция ядра-флуоресценция фона-флуоресценция цитоплазмы = 3806-905-1493 = 1408.

интенсивность флуоресценции ядра/интенсивность флуоресценции цитоплазмы = 1408/588 = 2,4.

Значения экспрессии маркеров пролиферации:

Ki67 = 8%

Ρ16 = 3%

Ρ 53 - не обнаружен

ФИЦХ-заключение: цитологическая картина и экспрессия маркеров соответствует картине предраковых изменений.

Цитологическое заключение: в препарате клетки многослойного плоского эпителия без атипии, отмечается умеренное количество нейтрофильных лейкоцитов, а также единичные клетки с признаками акантолиза.

Гистологическое заключение: в препарате клетки многослойного плоского эпителия без атипии, в части клеток признаки дискератоза, обилие нейтрофилов.

Таким образом, результаты, полученные при ФИЦХ-исследовании биологического материала путем смыва из полости рта пациента, подтверждены при проведении цитологического и гистологического исследования.

Пример 4 конкретного исполнения дан в виде выписки из амбулаторной карты.

Больной С., 1954 г.р. Обратилась с жалобами на чувство стянутости и шероховатости на слизистой оболочке щек. Считает себя больным в течение 6 месяцев. Из сопутствующей патологии отмечает: артериальную гипертонию.

При объективном осмотре: конфигурация лица не изменена, кожные покровы чистые, регионарные лимфатические узлы не пальпируются.

На слизистой оболочке правой и левой щек по линии смыкания зубов, в ретромолярной области слева и в области альвеолярного отростка и переходной складки в области зубов 3.7,3.6 локализуются очаги ороговения, возвышающиеся над уровнем слизистой оболочки молочно-белого цвета, не удаляющиеся при соскабливании. При аутофлюоресцентной диагностике наблюдается усиление флуоресценции (голубое свечение).

Предварительный клинический диагноз: веррукозная лейкоплакия слизистой оболочки рта.

Произведен самостоятельный смыв по описанной выше методике.

ФИЦХ-исследование проведено так же, как в примере 1.

Полученные результаты:

• флуоресценция фона - 1005

• флуоресценция цитоплазмы клетки - 1293

• флуоресценция ядра клетки - 3008.

интенсивность флуоресценции цитоплазмы = флуоресценция цитоплазмы-флуоресценция фона = 1293-1005 = 288.

интенсивность флуоресценции ядра = флуоресценция ядра-флуоресценция фона-флуоресценция цитоплазмы = 3008-1005-1293 = 710

интенсивность флуоресценции ядра/интесивность флуоресценции цитоплазмы = 710/288 = 2,5.

Ki67 = 5%

P16 - не обнаружен

Ρ53 = 2%

ФИЦХ-заключение: цитологическая картина и экспрессия маркеров соответствует картине предраковых заболеваний слизистой оболочки рта.

Цитологическое заключение: в препарате пласты плоского эпителия с признаками паракератоза в небольшой части клеток, а также единичные клетки с признаками гиперкератоза. Цитологическая картина не исключает наличие гиперкератоза (лейкоплакии).

Гистологическое заключение: эпителиальный покров слизистой оболочки резко утолщен за счет крупных пластов ороговевающего эпителия с наличием эндофитных эпителиальных выростов в собственную пластинку слизистой оболочки. Тонкие соединительнотканные сосочки глубоко вдаются в толщу покровного эпителия. Отмечается выраженный акантоз. В подлежащей собственной пластинке слизистой оболочки определяется хронический клеточный инфильтрат. Гистологическая картина эпителиальной гиперплазии.

Заключение: Веррукозная лейкоплакия с дисплазией 1 степени.

Таким образом, результаты, полученные при ФИЦХ-исследовании биологического материала путем смыва из полости рта пациента соответствуют результатам цитологического и гистологического исследования.

Пример 5 конкретного исполнения дан в виде выписки из амбулаторной карты

Больной К., 1961 г.р. Обратилась с жалобами на чувство стянутости и наличие разрастаний на слизистой оболочке подъязычной области. Считает себя больным в течение 2-х лет. Из сопутствующей патологии отмечает: язвенную болезнь желудка.

При объективном осмотре: конфигурация лица не изменена, кожные покровы чистые, регионарные лимфатические узлы не пальпируются.

На слизистой оболочке вентральной поверхности языка и подъязычной области локализуется очаг ороговения, возвышающийся над уровнем слизистой оболочки овальной формы, размерами 1,5*2 см молочно-белого цвета, не удаляющийся при соскабливании, в центре элемента эрозия, размерами 0,5*0, 5 см. При аутофлюоресцентной диагностике наблюдается усиление флуоресценции по периферии и гашение флюоресценции в центре («эффект темного пятна»).

Предварительный клинический диагноз: эрозивная лейкоплакия слизистой оболочки языка и дна полости рта.

Произведен самостоятельный смыв по описанной выше методике.

ФИЦХ-исследование проведено так же, как в примере 1.

Полученные результаты:

• флуоресценция фона - 1378

• флуоресценция цитоплазмы клетки - 2598

• флуоресценция ядра клетки - 6329

интенсивность флуоресценции цитоплазмы = флуоресценция цитоплазмы-флуоресценция фона = 2598-1378 = 1220.

интенсивность флуоресценции ядра = флуоресценция ядра-флуоресценция фона-флуоресценция цитоплазмы = 6329-1378-2598 = 2353.

интенсивность флуоресценции ядра/интесивность флуоресценции цитоплазмы = 2353/1220 = 1,98

Ki67 - 4%

Р16 - не обнаружен

Ρ 53 - 10%

ФИЦХ-заключение: цитологическая картина и экспрессия маркеров соответствует патологическим изменениям клеток (предраковый процесс)

Цитологическое заключение: в препарате на фоне пластов клеток неизмененного плоского эпителия отмечаются единичные эпителиальные клетки с признаками атипии по типу дисплазии 2-3 степени. Цитологическая картина дисплазии 2-3 степени в части клеток.

Гистологическое заключение: в препарате имеется повышенная пролиферативная активность клеток во всех эпителиальных слоях с ядерным и клеточным полиморфизмом и выраженным воспалительным инфильтратом в собственной пластинке слизистой оболочки. В эпителиальных слоях отмечается выраженный паракератоз. Гистологическая картина характерна для плоскоклеточной интраэпителиальной неоплазии 3-й степени.

Рекомендовано динамическое наблюдение, контроль через 3 месяца.

Изобретение относится к области медицины, а именно к стоматологии, и может быть использовано для ранней диагностики и дифференциальной диагностики предраковых заболеваний слизистой оболочки рта (СОР) и плоскоклеточного рака СОР (ПР СОР). Для этого осуществляют прямое флуоресцентное иммуноцитохимическое (ФИЦХ) исследование биоматериала пациента, который получен путем самостоятельного смыва пациентом в течение 1 минуты из ротовой полости 5% раствором глюкозы после ополаскивания полости рта дистиллированной водой. Определяют степень превышения интенсивности флуоресценции клеточного ядра над интенсивностью флуоресценции цитоплазмы и экспрессию маркеров пролиферации Κi67, Р16 и Р53. При выявлении в полученном препарате одновременно двух или трех этих маркеров, значения уровня экспрессии которых находятся в диапазоне Ki67 ≥ 10%, Р16 ≥ 5, Р53 ≥ 10%, и при значении соотношения интенсивности флуоресценции ядра к интенсивности флуоресценции цитоплазмы 3 и более предполагают плоскоклеточный рак СОР. При выявлении в препарате одновременно одного или двух маркеров пролиферации, значения уровня экспрессии которых находятся в диапазоне Ki67 5-10%, P16 1-5%, Р53 1-10%, и при значении соотношения интенсивности флуоресценции ядра к интенсивности флуоресценции цитоплазмы менее 3 предполагают предраковое заболевание СОР. Способ позволяет дифференцировать предраковые заболевания и рак слизистой оболочки рта, выявить начальные признаки малигнизации на ранней стадии заболевания при первичном скрининговом исследовании, без инвазивного травматичного забора биоматериала у пациента, с получением результатов в достаточно короткие сроки, с возможностью дистанционной оценки результатов. 1 з.п. ф-лы, 6 ил., 5 пр.

1. Способ скрининговой дифференциальной диагностики предраковых заболеваний и плоскоклеточного рака слизистой оболочки рта (СОР), заключающийся в том, что осуществляют прямое флуоресцентное иммуноцитохимическое (ФИЦХ) исследование биоматериала пациента, который получен путем самостоятельного смыва пациентом в течение 1 минуты из ротовой полости 5% раствором глюкозы после ополаскивания полости рта дистиллированной водой, определяют степень превышения интенсивности флуоресценции клеточного ядра над интенсивностью флуоресценции цитоплазмы и экспрессию маркеров пролиферации Ki67, Р16 и Р53 и при выявлении в полученном препарате одновременно двух или трех этих маркеров, значения уровня экспрессии которых находятся в диапазоне Κi67 ≥ 10%, Р16 ≥ 5, Р53 ≥ 10%, и при значении соотношения интенсивности флуоресценции ядра к интенсивности флуоресценции цитоплазмы 3 и более предполагают плоскоклеточный рак СОР; при выявлении в препарате одновременно одного или двух маркеров пролиферации, значения уровня экспрессии которых находятся в диапазоне Ki67 5-10%, PI6 1-5%, Р53 1-10%, и при значении соотношения интенсивности флуоресценции ядра к интенсивности флуоресценции цитоплазмы менее 3 предполагают предраковое заболевание СОР.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что оценку результатов ФИЦХ исследования с подсчетом процента экспрессии маркеров пролиферации проводят в виде мультицветового исследования.