СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЛЮКОЗЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ПОЛИМЕТАКРИЛАТНОЙ МАТРИЦЫ Российский патент 2024 года по МПК G01N21/29 G01N21/31 C12Q1/26 

Известен способ количественного определения концентрации глюкозы в крови (цельная капиллярная, сыворотка или плазма) и моче человека глюкозооксидазным методом с использованием стандартного набора «Глюкоза-Ново» компании ЗАО «Вектор-Бест», который используется в клинико-диагностических, биохимических лабораториях и научно-исследовательской практике [Инструкция по применению набора реагентов для определения концентрации глюкозы в крови и моче глюкозооксидазным методом «Глюкоза-Ново» https://docs.nevacert.ru/files/med_reestr_v2/22335_instruction.pdf]. Метод определения основан на том, что глюкоза окисляется кислородом воздуха в присутствии глюкозооксидазы с образованием глюконовой кислоты и перекиси водорода. Перекись водорода под действием пероксидазы в реакции с 4-аминоантипирином и фенолом образует окрашенный продукт - хинонимин, интенсивность окраски которого пропорциональна концентрации глюкозы в анализируемой пробе и измеряется фотометрически при длине волны 510 (490-540) нм. Диапазон линейности определяемых концентраций глюкозы с использованием стандартного набора «Глюкоза-Ново» составляет 0.7-28.0 ммоль/л.

Недостатками такого способа является низкий срок хранения набора «Глюкоза-Ново», а также высокий предел обнаружения, который не позволяет использовать предлагаемый набор компании «Вектор-Бест» для определения глюкозы в биологических объектах с низким содержанием глюкозы.

В практике современной аналитической химии вместо традиционных химических реагентов для определения глюкозы в различных биологических жидкостях человека находят применение наноматериалы, которые позволяют снизить предел обнаружения глюкозы и повысить чувствительность ее определения. Золотые наночастицы стали одним из наиболее часто используемых наноматериалов для биосенсоров благодаря их оптическому отклику, связанному с поверхностным плазмонным резонансом, который очень чувствителен к изменениям свойств наночастиц золота.

Известен способ определения содержания глюкозы в сыворотке крови с использованием наночастиц золота [L. Saa, M. Coronado-Puchaua, V. Pavlova, L. M. Liz-Marzán. Enzymatic etching of gold nanorods by horseradish peroxidase and application to blood glucose detection // Nanoscale. 2014, vol. 6, № 13. pp. 7405-7409]. Метод основан на химическом травлении золотых наночастиц пероксидом водорода, который образуется в результате окисления глюкозы кислородом под действием фермента глюкозооксидазы. Однако низкие концентрации пероксида водорода не позволяют использовать систему для определения глюкозы в биологических жидкостях и чтобы преодолеть это ограничение в раствор вводят фермент пероксидазу хрена, который способен индуцировать окисление наночастиц золота в присутствии незначительных концентраций пероксида водорода, что позволяет проводить определение физиологических концентраций глюкозы в крови. Введение растворов глюкозы различной концентрации к растворам, содержащим глюкозооксидазу, пероксидазу хрена и наночастицы золота, приводит к постепенному синему смещению максимума поглощения поверхностного плазмонного резонанса в коротковолновую область спектра, который использовали в качестве аналитического сигнала при определении глюкозы в реальном объекте. Определение глюкозы в сыворотке крови проводили методом стандартной добавки с предварительным разбавлением образца в 50 раз. Линейная зависимость между количеством глюкозы, добавленной в раствор, и аналитическим сигналом наблюдается в диапазоне концентраций глюкозы в растворе 0 - 250 ммоль/л. Данный метод позволяет проводить определение глюкозы в сыворотке крови человека с пределом обнаружения 10 ммоль/л. Предложенный способ отличается высокой чувствительностью определения глюкозы.

К недостаткам предлагаемого способа можно отнести применение дорогостоящего реактива пероксидазы хрена для процесса определения глюкозы.

В работе [Q. Zhong, Y. Chen, X. Qin, Y. Wang, C. Yuan, Y. Xu. Colorimetric enzymatic determination of glucose based on etching of gold nanorods by iodine and using carbon quantum dots as peroxidase mimics // Microchimica Acta. 2019. vol. 186, №3. pp. 161-169] предложен способ определения содержания глюкозы, основанный на травлении золотых наностержней с использованием углеродных квантовых точек. Суть метода заключается в процессе окисления глюкозы в присутствии глюкозооксидазы, который приводит к образованию пероксида водорода с последующим окислением добавленного иодида с образованием элементарного иода под каталитическим действием углеродных квантовых точек. Затем иод вытравливает наночастицы золота, что приводит к постепенному уменьшению максимальной длины волны поглощения золотых наночастиц с 953 нм до 645 нм. Сдвиг максимальной длины волны поглощения линейно уменьшается в диапазоне концентраций глюкозы 0.01-2.00 ммоль/л, а предел обнаружения глюкозы предложенным способом составляет 3.0 мкмоль/л (0.003 ммоль/л).

Недостатком предлагаемого способа является многостадийность, трудоемкость и высокая длительность процесса синтеза квантовых точек, необходимых для определения глюкозы.

Наиболее близким аналогом к заявляемому изобретению является способ спектрофотометрического определения глюкозы в моче [X. Zhang, E. Sucre-Rosales, A. Byram, F.E. Hernandez, G. Chen. Ultrasensitive Visual Detection of Glucose in Urine Based on the Iodide-Promoted Etching of Gold Bipyramids // ACS Appl. Mater. 2020, № 12. С. 4950249509]. Принцип метода заключается в использовании перекиси водорода, продукта окисления глюкозы в присутствии глюкозооксидазы, для вытравливания, предварительно полученных наночастиц золота, и количественному определению содержания глюкозы в моче по смещению пика поглощения наночастиц золота с 800 нм до 520 нм. В оптимальных условиях этот анализ показывает линейный диапазон определяемых содержаний глюкозы 0.5-250 мкмоль/л с пределом обнаружения 0.34 мкмоль/л для образцов искусственной мочи. В представленном способе определения глюкозы отмечено, что иодид-ион обладает активностью пероксидазы хрена и может использоваться для стимулирования реакции восстановления пероксида водорода, что исключает использование дорогостоящего фермента, упрощает реакцию и снижает затраты.

Недостатком этого способа является использование большого количества реагентов, многостадийность и длительность процесса получения наночатиц золота, необходимых для определения глюкозы, а также длительность самого процесса определения глюкозы в аналите. Кроме того, наночастицы золота, необходимые для определения глюкозы в предложенном способе, нестабильны в течение длительного времени, поэтому синтез необходимо проводить непосредственно перед анализом, что является достаточно трудоемким процессом.

Задачей настоящего изобретения является разработка простого, нетрудоемкого, более экспрессного в сравнении с аналогом способа определения глюкозы на основе полиметакрилатной матрицы с различными вариантами детектирования аналитического сигнала и контроля уровня глюкозы в биологических жидкостях человека.

Решение указанной задачи достигается тем, что в способе определения глюкозы, включающем приготовление стандартного раствора глюкозы, взаимодействие анализируемого раствора с полиметакрилатной мембраной, измерение аналитического сигнала и определение содержания глюкозы, новым является то, что в качестве аналитической среды для формирования аналитического сигнала используют полиметакрилатную матрицу, в качестве аналитического сигнала используют светопоглощение при 365 нм, 535 нм или координаты цвета G, B полиметакрилатной матрицы, оценку содержания глюкозы проводят по градуировочному графику или методом добавок.

Сущность заявляемого способа заключается в следующем:

Находящаяся в анализируемом растворе глюкоза окисляется кислородом воздуха в присутствии фермента глюкозооксидазы с выделением глюконовой кислоты и пероксида водорода, количество которого эквивалентно содержанию глюкозы в растворе. Выделившийся в результате реакции пероксид водорода взаимодействует в растворе с иодид-ионами с образованием иода, который экстрагируется из раствора полиметакрилатной матрицей с иммобилизованными наночастицами золота, в результате чего интенсивность красной окраски полимерной мембраны уменьшается. Данный эффект наблюдается при взаимодействии мембраны с аналитом в сильнокислой среде.

В процессе иммобилизации наночастиц золота полиметакрилатные матрицы погружали в водный раствор H[AuCl₄], перемешивали 1-5 минут, отделяли мембраны от раствора, просушивали между листами фильтровальной бумаги. Далее в полиметакрилатных матрицах проводили процесс восстановление Au³⁺ до Au⁰ путем перемешивания матриц с 0,1% раствором NaBH₄ в течение 5 минут, в результате чего происходило окрашивание матриц в красно-фиолетовый цвет, вследствие образования наночастиц золота. Максимум поглощения наночастиц золота в полиметакрилатной матрице соответствует длине волны 535 нм.

Исследуемый раствор, содержащий глюкозу, в присутствии глюкозооксидазы, нагревали 10 минут при температуре 37°С. Далее в раствор вносили иодид калия и полиметакрилатную матрицу с иммобилизованными наночастицами золота, тщательно перемешивали в течение 30 минут, вынимали матрицу, подсушивали фильтровальной бумагой, измеряли аналитический сигнал с последующим установлением зависимости величины аналитического сигнала от содержания глюкозы в анализируемом растворе и ее оценкой. Спектры поглощения полиметакрилатной матрицы с иммобилизованными наночастицами золота после контакта с раствором глюкозы представлены на Фиг. 1.

На Фиг. 1 представлены Спектры поглощения полиметакрилатной матрицы с иммобилизованными наночастицами золота, после контакта с раствором глюкозы, С_гл, ммоль/л: 1 - 0; 2 - 0.1; 3 - 0.2; 4 - 0.4; 5 - 0.6.

Находящаяся в анализируемом растворе глюкоза окисляется кислородом воздуха в присутствии фермента глюкозооксидазы с выделением глюконовой кислоты и пероксида водорода, количество которого эквивалентно содержанию глюкозы в растворе. Выделившийся в результате реакции пероксид водорода взаимодействует в растворе с иодид-ионами, присутствующими в избытке, с образованием иода с последующим образованием трииодид-иона, который извлекается из раствора полиметакрилатной матрицей. После контакта с аналитом матрица окрашивается в желтый цвет, на спектре поглощения появляется максимум при длине волны 365 нм (Фиг. 2), соответствующий поглощению трииодид-иона, который увеличивается пропорционально содержанию глюкозы в растворе. Данный эффект наблюдается при взаимодействии мембраны с аналитом в сильнокислой среде.

Исследуемый раствор, содержащий глюкозу, в присутствии глюкозооксидазы, нагревали 10 минут при температуре 37°С. Далее в раствор вносили иодид калия и полиметакрилатную матрицу, тщательно перемешивали в течение 30 минут, вынимали матрицу, подсушивали фильтровальной бумагой, измеряли аналитический сигнал с последующим установлением зависимости величины аналитического сигнала от содержания глюкозы в анализируемом растворе и ее оценкой.

На Фиг. 2 представлены Спектры поглощения полиметакрилатной матрицы после контакта с раствором глюкозы, С_гл, ммоль/л: 1 - 0; 2 - 0.1; 3 - 0.2; 4 - 0.4; 5 - 0.6.

Ниже представлены примеры осуществления заявленного изобретения.

Пример 1. Измерение поглощения полиметакрилатной матрицы и определение содержания глюкозы по градуировочному графику.

а) Анализируемый раствор объемом 5-30 мкл вносили в пробирку вместимостью 2.0 мл, добавляли 50 мкл раствора фермента глюкозооксидазы с концентрацией 6 мг/мл (активность ~17300 ед/г) и перемешивали с нагреванием 37°С в течение 10 минут. Затем в раствор вводили 40 мкл 1М HCl, 60 мкл 0.5%-го раствора KI, доводили раствор до объема 500 мкл (содержание глюкозы в растворе составляло 0.1 - 0.6 ммоль/л). В раствор помещали пластинку полиметакрилатной матрицы с иммобилизованными наночастицами золота и перемешивали в течение 30 минут. Затем полимерную мембрану вынимали, подсушивали фильтровальной бумагой и измеряли поглощение при длине волны 535 нм. Содержание глюкозы находили по градуировочной зависимости, построенной в аналогичных условиях. Уравнение градуировочной зависимости имеет вид: А₅₃₅ = 0.27 - 0.30⋅с_гл (R² = 0.9855), где с_гл - концентрация глюкозы, ммоль/л. Диапазон линейности градуировочной зависимости составляет 0 - 0.53 ммоль/л. Предел обнаружения глюкозы, рассчитанный по 3s-критерию, равен 0.009 ммоль/л.

б) Анализируемый раствор объемом 5-30 мкл вносили в пробирку вместимостью 2.0 мл, добавляли 50 мкл раствора фермента глюкозооксидазы с концентрацией 6 мг/мл (активность ~17300 ед/г) и перемешивали с нагреванием 37°С в течение 10 минут. Затем в раствор вводили 40 мкл 1М HCl, 60 мкл 0.5%-го раствора KI, доводили раствор до объема 500 мкл (содержание глюкозы в растворе составляло 0.1 - 0.6 ммоль/л). В раствор помещали пластинку полиметакрилатной матрицы и перемешивали в течение 30 минут, затем полимерную мембрану вынимали, подсушивали фильтровальной бумагой и измеряли поглощение при длине волны 365 нм. Содержание глюкозы находили по градуировочной зависимости, построенной в аналогичных условиях. Уравнение градуировочной зависимости имеет вид: ΔА₃₆₅=2.7⋅с_гл (R² = 0.9908), где с_гл - концентрация глюкозы, ммоль/л, ΔА₃₆₅ - разность оптических плотностей полиметакрилатной матрицы после контакта с анализируемым раствором в присутствии и отсутствии определяемого компонента соответственно. Диапазон линейности градуировочной зависимости составляет 0 - 0.6 ммоль/л. Предел обнаружения глюкозы, рассчитанный по 3s-критерию, равен 0.013 ммоль/л.

Пример 2. Колориметрическое определение глюкозы - измерение координат цвета полиметакрилатной матрицы и определение содержания глюкозы по градуировочному графику.

а) Колориметрическое определение выполняли аналогично методике, описанной в примере 1 а, с тем отличием, что после контакта с растворами глюкозы поглощение полиметакрилатных матриц не измеряли, а сканировали полимерные мембраны с помощью смартфона (рис. 3 а) и обрабатывали полученные изображения с помощью компьютерной программы цифровой обработки изображений «Adobe Photoshop» по светлоте в координатах R, G, B. В качестве аналитического сигнала выбран зеленый канал. Содержание глюкозы в анализируемом образце находили по градуировочной зависимости, построенной, сканированной и обработанной в аналогичных условиях. Уравнение градуировочной зависимости имеет вид: G = 129 + 170⋅с_гл (R² = 0.9903), где с_гл - концентрация глюкозы, ммоль/л. Диапазон линейности градуировочной зависимости составляет 0-0.6 ммоль/л, предел обнаружения, рассчитанный по 3s-критерию, равен 0.061 ммоль/л.

б) Колориметрическое определение выполняли аналогично методике, описанной в примере 1 б, с тем отличием, что после контакта с растворами глюкозы поглощение полиметакрилатных матриц не измеряли, а сканировали полимерные мембраны с помощью смартфона (Фиг. 3б) и обрабатывали полученные изображения с помощью компьютерной программы цифровой обработки изображений «Adobe Photoshop» по светлоте в координатах R, G, B. В качестве аналитического сигнала выбран голубой канал. Содержание глюкозы в анализируемом образце находили по градуировочной зависимости, построенной, сканированной и обработанной в аналогичных условиях. Уравнение градуировочной зависимости имеет вид: B = 219 - 167⋅с_гл (R² = 0.9942), где с_гл - концентрация глюкозы, ммоль/л. Диапазон линейности градуировочной зависимости составляет 0 - 0.6 ммоль/л, предел обнаружения, рассчитанный по 3s-критерию, равен 0.036 ммоль/л.

На Фиг. 3 представлено сканированное изображение образцов полиметакрилатных матриц с иммобилизованными наночастицами золота (а) и полиметакрилатных матриц (б) после контакта с растворами глюкозы для построения градуировочных зависимостей.

Пример 3. Измерение поглощения полиметакрилатной матрицы и определение содержания глюкозы методом добавок

Анализируемый раствор объемом 200-300 мкл вносили в пробирку вместимостью 2.0 мл, добавляли 50 мкл фермента глюкозооксидазы с концентрацией 500 мг/мл и перемешивали с нагреванием 37°С в течение 10 минут. Затем в пробирку добавляли 40 мкл 1М HCl, 60 мкл 0.5%-го раствора KI и разбавляли дистиллированной водой до объема 500 мкл. Также готовили растворы в других пробирках, куда дополнительно вводили 10, 20 и 30 мкл рабочего раствора глюкозы с концентрацией 10 ммоль/л. В растворы помещали пластинку полиметакрилатной матрицы и перемешивали в течение 30 минут, затем вынимали матрицы, подсушивали фильтровальной бумагой и измеряли поглощение при 365 нм. Содержание глюкозы определяли графическим способом, экстраполируя прямолинейную зависимость изменения поглощения ∆А₃₆₅ от концентрации глюкозы в добавке до значения ∆А₃₆₅ = 0, где ∆А₃₆₅ - разность оптических плотностей полиметакрилатной матрицы после контакта с анализируемым раствором в присутствии и отсутствии определяемого компонента соответственно.

Содержание глюкозы в анализируемом растворе (с_x, ммоль/л) определяли по полученному уравнению градуировочной зависимости. Содержание глюкозы в пробе биологической жидкости (X, ммоль/л), определяли по формуле:

Х=(с_x·500)/V_al,

где c_x - содержание глюкозы в анализируемом растворе, ммоль/л;

500 - объем, до которого разбавлена проба, мкл;

V_al - объем пробы, взятый для анализа, мкл.

Пример 4. Определение содержания глюкозы в биологической жидкости - слюне

Разработанную методику апробировали при анализе слюны на содержание в ней глюкозы без процедуры предварительной пробоподготовки объекта. Содержание глюкозы определяли графическим способом по методу добавок по методике, представленной в примере 3, чтобы исключить мультипликативные систематические погрешности, связанные с влиянием различных веществ, присутствующих в анализируемом объекте. Результаты определения представлены в таблице 1. Полученные результаты свидетельствуют о правильности и повторяемости предлагаемого способа определения глюкозы.

Таблица 1 - Результаты анализа слюны на содержание глюкозы (n = 3, P = 0.95)

Содержание глюкозы, ммоль/л в анализируемой пробе слюны в образце слюны с _{(введ. добавка)} с Экспериментально найденная добавка δ, % с ± Δс S _r, % 0 0.18 0.21 105 0.24 ± 0.06 11 0.20 0.39

δ - процентная мера правильности, рассчитанная как отношение найденной концентрации (среднего значения к истинному значению концентрации компонента в пробе.

Преимуществом заявленного изобретения по сравнению с прототипом является простота и экспрессность выполнения определения глюкозы, многообразие способов измерения аналитического сигнала и оценки содержания глюкозы, а также в 51 раз сокращено время подготовки наночастиц золота, необходимых для определения глюкозы. Значительным преимуществом заявленного способа по сравнению с известными является использование наночастиц золота на матричной основе (полиметакрилатной матрице), что является превосходной альтернативой для различных применений благодаря их долговременной стабильности, высокой реакционной способности поверхности, высокой чувствительности и простоты в обращении.

Список использованных источников и литературы:

1. Инструкция по применению набора реагентов для определения концентрации глюкозы в крови и моче глюкозооксидазным методом «Глюкоза-Ново» https://docs.nevacert.ru/files/med_reestr_v2/22335_instruction.pdf

2. L. Saa, M. Coronado-Puchaua, V. Pavlova, L. M. Liz-Marzán. Enzymatic etching of gold nanorods by horseradish peroxidase and application to blood glucose detection // Nanoscale. 2014, vol. 6, № 13. pp. 7405-740.

3. Q. Zhong, Y. Chen, X. Qin, Y. Wang, C. Yuan, Y. Xu. Colorimetric enzymatic determination of glucose based on etching
of gold nanorods by iodine and using carbon quantum dots
as peroxidase mimics // Microchimica Acta. 2019. vol. 186, №3. pp. 161-169.

4. X. Zhang, E. Sucre-Rosales, A. Byram, F.E. Hernandez, G. Chen. Ultrasensitive Visual Detection of Glucose in Urine Based on the Iodide-Promoted Etching of Gold Bipyramids // ACS Appl. Mater. 2020, № 12. С. 49502-49509.

Изобретение относится к аналитической химии. Раскрыт способ определения глюкозы с использованием полиметакрилатной матрицы, включающий взаимодействие анализируемого раствора с полиметакрилатной матрицей в присутствии фермента глюкозооксидазы и йодид-иона, вынимание матрицы из раствора, измерение аналитического сигнала и определение содержания глюкозы, где в качестве среды для формирования аналитического сигнала используют полиметакрилатную матрицу с иммобилизованными наночастицами золота, аналитический сигнал получают в результате экстракции йода полиметакрилатной матрицей с иммобилизованными наночастицами золота и измеряют при длине волны 365 нм или в координатах цвета G, B, оценку содержания глюкозы проводят по градуировочному графику или методом добавок. Изобретение обеспечивает разработку простого, нетрудоемкого, более экспрессного в сравнении с аналогом способа определения глюкозы на основе полиметакрилатной матрицы с различными вариантами детектирования аналитического сигнала и контроля уровня глюкозы в биологических жидкостях человека. 3 ил., 1 табл., 4 пр.

Способ определения глюкозы с использованием полиметакрилатной матрицы, включающий взаимодействие анализируемого раствора с полиметакрилатной матрицей в присутствии фермента глюкозооксидазы и йодид-иона, вынимание матрицы из раствора, измерение аналитического сигнала и определение содержания глюкозы, отличающийся тем, что в качестве среды для формирования аналитического сигнала используют полиметакрилатную матрицу с иммобилизованными наночастицами золота, аналитический сигнал получают в результате экстракции йода полиметакрилатной матрицей с иммобилизованными наночастицами золота и измеряют при длине волны 365 нм или в координатах цвета G, B, оценку содержания глюкозы проводят по градуировочному графику или методом добавок.