Штамм Rhodococcus qingshengii ARC50 ВКПМ Ac-2156 - деструктор нефти и нефтепродуктов Российский патент 2024 года по МПК C12N1/20 C02F3/34 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к области биотехнологии, микробиологии, экологии, охране окружающей среды и представляет собой новый бактериальный штамм Rhodococcus qingshengii ARC50 ВКПМ Ас-2156, обладающий способностью к деструкции нефти и нефтепродуктов и характеризующийся сохранением высокого уровня жизнеспособности после проведения распылительного высушивания. Штамм может быть использован для очистки акваторий водоемов и береговой линии, загрязненных нефтью и нефтепродуктами, при температуре до -2,5°С в условиях, бедных по питательным веществам.

Уровень техники

Несмотря на значительное количество штаммов для утилизации нефти и нефтепродуктов, а также для биовосстановления загрязненных углеводородами земель, данная проблема остается открытой для поиска новых решений. Важным критерием применимости микроорганизмов для технологий утилизации нефти является их способность переносить этап обезвоживания. Сухая форма микробной биомассы имеет ряд значительных преимуществ, в такой форме биомасса имеет малый вес, транспортировка значительно дешевле, не требует поддержания низких температур и пр. Поэтому важным критерием для возможности использования микроорганизмов в препаратах для утилизации нефти является способность переносить этап обезвоживания.

Известен штамм Rhodococcus sp.- деструктор нефтяных углеводородов (патент РФ №2518349, приоритет 11.04.2013, опубл. 10.06.2014.), который утилизирует нефть, мазут, керосин, нафталин, пентадекан, тетрадекан, гексадецен, фенилдекан, пристан уже на 5 день при 20-30°С. Данный штамм показал высокую степень деструкции углеводородов при температуре +30°С. Однако данный штамм не способен производить утилизацию углеводородов при низких температурах.

Известен штамм Serratia plymuthica VKM B-2819D (патент РФ №2560272, приоритет 22.09.2014, опубл. 20.08.2015), обладающий способностью быстро утилизировать нефть и нефтепродукты (дизельное топливо, масло моторное, масло гидравлическое, газовый конденсат), может быть использован для очистки почв и водоемов, загрязненных нефтью и нефтепродуктами, в широком диапазоне температур от +4 до +30°С. Недостатком штамма является то, что он не способен утилизировать нефтезагрязнения при высокой солености воды до 30 г/л.

Штамм Rhodococcus erythropolis депонирован под регистрационным номером В КМ AC-2613D (патент РФ №2553336 приоритет 20.08.2013 опубл. 10.06.2015). Штамм используется для очистки пресноводных, солоноватоводных и морских объектов и донных отложений. Микроорганизм обеспечивает деструкцию нефти в водных объектах при температуре от +2 до +25°С и солености до 2,7%. Недостатком изобретения является то, что штамм утилизирует углеводороды в условиях богатых по питательным веществам (в состав среды входит пептон 5 г/л и сахароза 15 г/л). В реальных условиях утилизации углеводородных загрязнений количество питательных веществ значительно снижены.

Известен штамм Nocardia coeliaca ARC 12 ВКПМ Ac-1990 (патент РФ №2624067, приоритет 07.12.2015, опубл. 30.06.2017), обладающий способностью к деструкции нефти и нефтепродуктов. Штамм может быть использован для очистки акваторий водоемов, береговой линии, загрязненных нефтью и нефтепродуктами, при температуре от +20 до +4°С и солености 30 г/л, в условиях бедных по питательным веществам. К недостаткам препарата можно отнести тот факт, что заявленный температурный диапазон активности штамма находится в области положительных температур. Также для препарата не указаны пределы солености, в которых он сохраняет активность и параметры сохранения жизнеспособности штамма после распылительной сушки.

Наиболее близким к заявляемому штамму является Marinomonas rhizoma ARC-45, обладающий способностью к деструкции нефти и нефтепродуктов, депонированный во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов под регистрационным номером ВКПМ В-13091. Штамм бактерий Marinomonas rhizoma ВКПМ В-13091 может быть использован для очистки акваторий водоемов, береговой линии, загрязненных нефтью и нефтепродуктами, при температуре от +20 до -2,5°С и солености 30±10 г/л в условиях, бедных по питательным веществам (патент РФ №2699988, приоритет 15.11.2018, опубл. 12.09.2019). Однако недостатком данного штамма является экспериментально показанное значительное снижение концентрации жизнеспособных клеток после распылительного высушивания.

Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является получение бактериального штамма, способного осуществлять деструкцию нефти и нефтепродуктов при температуре до -2,5°С в условиях, бедных по питательным веществам, и сохранять высокий уровень жизнеспособности после проведения распылительного высушивания.

Техническим результатом заявленного изобретения является сохранение высокого уровня жизнеспособности бактериального штамма после проведения распылительного высушивания микроорганизмов.

Раскрытие изобретения

Технический результат достигается заявляемым штаммом Rhodococcus qingshengii ARC50 ВКПМ Ас-2156, способным осуществлять деструкцию нефти и нефтепродуктов, который может быть использован для очистки акваторий водоемов и береговой линии, загрязненных нефтью и нефтепродуктами, при температуре до -2,5°С в условиях, бедных по питательным веществам, и характеризующийся снижением количества жизнеспособных клеток не более, чем в 100 раз, после проведения распылительного высушивания при температуре сушки до 120°С.

Штамм выделен из накопительной культуры, полученной из образца нефтезагрязненного грунта, отобранного у западного берега полуострова Ямал в октябре 2015 года. Штамм депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов ФГУП ГосНИИгенетика (ВКПМ, Москва, 1-й Дорожный пр., д.1) под регистрационным номером ВКПМ Ас-2156.

Идентификация штамма была осуществлена на основании анализа последовательности гена 16S рРНК, а также его культурально-морфологических и физиолого-биохимических характеристик.

Полученный штамм характеризуется следующими признаками.

Культурально-морфологические признаки

Колонии круглые, блестящие, гладкие, однородной структуры, мягкой консистенции, с ровным краем, по мере роста приобретают слабый розовый оттенок. Окраска по Граму положительная.

Физиолого-биохимические признаки

Штамм растет при температуре от +40 до -2,5°С, в аэробных условиях. Растет на плотных и жидких питательных средах с содержанием NaCl ЗОг/л. Способен расти в жидкой среде с углеводородами в качестве единственного источника углерода и энергии.

Культивирование и хранение

Штамм поддерживают пересевами 1 раз в 21 день при 10°С на плотной питательной среде №1 следующего состава (г/л): К₂НРO₄ - 1,5; КН₂РO₄ - 0,75; MgSO₄ -1,0; (NH₄)2SO₄ - 4,0; NaCl - 30; гидролизат казеина - 5,0; дрожжевой экстракт - 2,5; D-глюкоза - 1,0; агар -14; рН 7,0 (в случае приготовления жидкой среды №1 агар не добавляется), или питательной среде №2 следующего состава (г/л): К₂НРО₄ - 1,5; КН₂РO₄ - 0,75; MgSO₄ - 1,0; (NH₄)₂SO₄ - 4,0; NaCl - 30; гидролизат казеина - 0,5; дрожжевой экстракт - 0,1; нефть - 1% об., агар -14; рН 7,0. Культивирование на жидких питательных средах проводили на среде №3 следующего состава (г/л): К₂НРO₄ - 1,5; КН₂РO₄ - 0,75; MgSO₄ - 1,0; (NH₄)₂SO₄ - 4,0; NaCl - 30; гидролизат казеина - 0,5; дрожжевой экстракт -0,1; нефть - 1% об.;рН 7,0.

В среду №2 и №3 в качестве углеводородного субстрата использовали смесь товарной нефти Возейского месторождения (плотность 37,9° API, сернистость 0,66%, характеризуется как тяжелая, вязкая, с высоким содержанием смол и асфальтенов) и дизельного топлива в соотношении 1:1 по объему. Смесь нефти и дизельного топлива стерилизовали отдельно и вносили в среду после стерилизации.

Штамм также может храниться при +4±2°С в лиофилизированном состоянии с использованием сухого обезжиренного молока в качестве защитной среды.

Осуществление изобретения

Возможность реализации заявляемого изобретения показана, но не ограничена, в примерах конкретного выполнения.

В связи с тем, что штамм предполагается использовать для очистки акваторий водоемов и береговой линии, загрязненных нефтью и нефтепродуктами, наиболее удобным способом доставки и применения штамма является использование биомассы, обезвоженной путем распылительного высушивания.

Для наиболее эффективного применения микроорганизмов для очистки от нефти и нефтепродуктов необходимо использовать штаммы, осуществляющие деструкцию углеводородов в условиях максимально приближенных к естественным условиям применения штамма - акватория и береговая линия моря. Условия должны быть приближены как по температуре, так и по составу питательной среды. Наиболее подходящей средой (бедной средой по питательным веществам) является морская вода. Внесение пептона и сахарозы в питательную среду (например, как в патенте РФ №2553336) продемонстрирует высокую активность микроорганизмов, вместе с тем в реальных условиях моря отсутствуют условия, богатые по питательным веществам.

Пример 1. Выделение и культивирование штамма Rhodococcus qingshengii ARC50 ВКПМ Ас-2156.

Штамм выделен из образца нефтезагрязненного грунта, отобранного у западного берега полуострова Ямал в октябре 2015 года. Образец массой 5±2 г вносили в 100 мл питательной среды №3. Культивирование проводили при температуре +4°С, на орбитальном шейкере (130 об/мин). В дальнейшем при последовательных пересевах накопительную культуру вносили в качестве инокулята в количестве 10 мл в 100 мл стерильной питательной среды №3. Было проведено не менее 10 пассажей накопительной культуры. Выделение штамма из накопительной культуры проводили на среде №2.

Пример 2. Исследование нефтеокисляющей активности штамма Rhodococcus qingshengii ARC50 ВКПМ Ас-2156.

Исследование нефтеокисляющей активности штамма было проведено в модельных условиях при отрицательной температуре культивирования с использованием стерильной морской воды в качестве питательной среды. Оценку убыли углеводородов нефти проводили при помощи метода газо-жидкостной хроматографии, определяли следующие параметры: содержание н-алканов, нафтено-ароматической фракции, суммарное содержание нефтепродуктов.

Постановку опытных образцов осуществляли в двух вариантах: в одном случае в колбу дополнительно вносили лед для создания ледовой массы, во втором в колбе вся среда находилась в жидком агрегатном состоянии. Колбы объемом 250 мл со 100 мл морской воды с соленостью 30 г/л для охлаждения до температуры культивирования выдерживали в течение суток в термостатируемой камере, после чего в каждую стерильно вносили качестве основного источника углерода один объемный процент стерильной смеси товарной нефти (Возейского месторождения, плотность 37,9° API, сернистость 0,66%, характеризуется как тяжелая, вязкая, с высоким содержанием смол и асфальтенов) и дизельного топлива в соотношении 1:1 по объему. Биомассу микроорганизмов, выращенных на плотной питательной среде №2, смывали стерильным раствором NaCL (30 г/л) и оценивали оптическую плотность полученной суспензии на спектрофотометре при длине волны 640 нм, доводили оптическую плотность до одинаковых значений, после чего вносили по 1 мл суспензии штамма в каждую колбу. Через двое суток после инокулирования проб в часть образцов асептически вносили фрагменты льда (около 1 см³), который служил точкой кристаллизации для инициации процесса формирования ледовой массы. В качестве контроля в нескольких повторностях были поставлены образцы, которые не содержали биомассу микроорганизмов.

Исследования проводили в термостатируемой камере при температуре -3±0,5°С в жидкой фазе в течение 90 дней, температура в опытных колбах фиксировалась с помощью дистанционных температурных датчиков. Затем, для оценки убыли нефтепродуктов за счет углеводородокисляющей активности штаммов микроорганизмов, проводилась экстракция углеводородов гексаном согласно ГОСТ 31953-2012. Хроматографическая оценка убыли углеводородов проводилась на хроматографе Кристалл 2000 м (Хроматэк) с капиллярной колонкой DB-1 (Agilent, длина - 30 м, диаметр - 0,25 мм, толщина слоя - 0,25 мкм) с пламенно-ионизационным детектором(ПИД). Температура детектора - 350°С; температура испарителя - 300°С; газ-носитель - гелий; поток газа - 1,0 мл/мин; расход газа - 20,0 мл/мин; расход водорода - 20 мл/мин; расход воздуха - 200 мл/мин. Измерения проводили в условиях температурного градиента от 100 до 300°С со скоростью градиента 15,0°С/мин.

В результате были получены следующие данные по убыли различных групп нефтепродуктов (в таблице 1 приведены процентные значения убыли за указанный период эксперимента).

Степень утилизации: П -полная (98-100%), ЗН -значительная (50-98%), 34 -значимая (50-15%), Л- легкая (2-15%), О - утилизация отсутствует

К росту при отрицательных температурах способны психрофильные и психротолерантные микроорганизмы, при этом их оптимум роста находится все же в области положительных температур, поэтому при температурах выше -2,5°С рост и утилизация нефтепродуктов будет идти не менее эффективно.

Пример 3. Способ коллекционного (долговременного) хранения штамма Rhodococcus qingshengii ARC50 ВКПМ Ас-2156.

Штамм Rhodococcus qingshengii ARC50 ВКПМ Ас-2156 выращивают в жидкой питательной среде №1. Культивирование проводят при температуре +20°С на орбитальном шейкере, либо в ферментерах различного объема в течение 3 суток до конечного количества жизнеспособных клеток микроорганизмов не менее 10⁹ КОЕ/мл. В полученную суспензию клеток в питательной среде вносят защитную среду (сухое обезжиренное молоко в количестве 10%). Далее полученную суспензию замораживают и обезвоживают методом лиофилизации в стеклянных флаконах или запаянных стеклянных ампулах. Хранение флаконов или ампул проводят при температуре 6±2°С.

Пример 4. Способ промышленного производства препарата на основе штамма Rhodococcus qingshengii ARC50 ВКПМ Ас-2156.

Штамм Rhodococcus qingshengii ARC50 ВКПМ Ас-2156 выращивают в жидкой питательной среде №1. Культивирование проводят при температуре +20°С на орбитальном шейкере, либо в ферментерах различного объема в течение 2 суток до конечного количества жизнеспособных клеток микроорганизмов не менее 10⁹ КОЕ/мл.

Полученную суспензию клеток в питательной среде подвергают концентрированию не менее, чем в 3 раза последовательным центрифугированием суспензии в течение 5 минут при не менее, чем 13000g. Концентрированную биомассу микроорганизмов подвергают распылительному высушиванию на установке фирмы Niro atomizer (Дания) или аналогичных со следующими характеристиками:

• размер частиц полученного материала: 50-100 мкм;

• разделитель жидкости: дискового типа (60000 об/мин);

• температура входящего воздуха +120°С, выходящего +80°С.

После процесса высушивания подсчитывают количество жизнеспособных клеток микроорганизмов в полученном порошке и определяют выживаемость штамма в процессе распылительного высушивания.

Определение выживаемости штамма Rhodococcus qingshengii ARC50 ВКПМ Ас-2156 было проведено путем высева десятикратных разведений на плотную питательную среду №1 и подсчета количества жизнеспособных клеток. Количество жизнеспособных клеток микроорганизмов после концентрирования суспензии составило 6,7*10⁹ КОЕ/мл (что соответствует концентрации 2,2*10¹¹ КОЕ/г сухого вещества); после высушивания количество жизнеспособных клеток микроорганизмов - 2,4*10⁹ КОЕ/г порошка. Для сравнения были получены данные по выживаемости штамма Marinomonas rhizome ARC-45 ВКПМ В-13091 Патент №2699988 (табл. 2).

Таким образом, получен штамм, способный осуществлять деструкцию нефти и нефтепродуктов и характеризующийся снижением количества жизнеспособных клеток не более, чем в 100 раз по сравнению с исходным титром, после проведения распылительного высушивания. Микробный титр в высушенной биомассе после 20 месяцев хранения составил 6*10⁵ КОЕ/г.

Изобретение относится к области биотехнологии и представляет собой новый бактериальный штамм Rhodococcus qingshengii ARC50 ВКПМ Ас-2156, обладающий способностью к деструкции нефти и нефтепродуктов и характеризующийся сохранением высокого уровня жизнеспособности после проведения распылительного высушивания. Штамм может быть использован для очистки акваторий водоемов и береговой линии, загрязненных нефтью и нефтепродуктами, при температуре до -2,5°С в условиях, бедных по питательным веществам. 2 табл., 3 пр.

Штамм Rhodococcus qingshengii ARC50 ВКПМ Ac-2156 - деструктор нефти и нефтепродуктов.