УСТРОЙСТВО И СПОСОБ ЭЛЕКТРОПОРАЦИИ Российский патент 2024 года по МПК C12M1/32 B01J19/00 B01L3/00 C12M1/42 C12N15/10 

[0001] Настоящая заявка испрашивает приоритет в соответствии со статьей 35 Кодекса США (35 U.S.С.§ 119(e)) на основании предварительной заявки на патент США №62/933717, поданной 11 ноября 2019 г. Данная заявка также испрашивает приоритет в соответствии со статьей 35 Кодекса США (35 U.S.С.§ 119(e)) на основании предварительной заявки на патент США №62/940032, поданной 25 ноября 2019 г. Предварительные заявки на патент США №62/933,717 и №62/940,032 настоящим полностью включены в настоящую заявку посредством ссылки.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[0002] Электропорация - это метод, при котором к клеткам прикладывается электрическое поле для увеличения проницаемости мембраны клеток. Это позволяет вводить в клетки лекарства, химические вещества и/или макромолекулы, такие как белки и нуклеиновые кислоты (такие как ДНК и РНК в различных формах). Электропорацию также можно назвать электропереносом.

РАСКРЫТИЕ СУЩНОСТИ И3ОБРЕТЕНИЯ

[0003] В целом, в одном аспекте варианты реализации относятся к устройству для электропорации. Устройство для электропорации содержит множество камер, выполненных с возможностью хранения множества клеток во время процесса электропорации; множество электродов, выполненных с возможностью генерирования множества электрических полей во множестве камер во время процесса электропорации, причем каждое электрическое поле из множества электрических полей соответствует одной камере из множества камер; проточный канал, выполненный с возможностью транспортировки множества клеток во время процесса сбора клеток после процесса электропорации; и множество клапанов, соединяющих множество камер с проточным каналом.

[0004] В целом, в одном аспекте варианты реализации относятся к способу. Способ включает выполнение процесса электропорации путем генерирования множества электрических полей во множестве камер с применением множества электродов, причем множество камер выполнены с возможностью хранения множества клеток во время процесса электропорации. Способ дополнительно включает выполнение процесса сбора клеток путем открытия множества клапанов, соединенных со множеством камер; и транспортировки множества клеток к выпускному отверстию с использованием проточного канала, соединенного со множеством клапанов, причем множество камер, множество электродов, множество клапанов, выпускное отверстие и проточный канал расположены внутри устройства для электропорации.

[0005] Другие аспекты вариантов реализации станут очевидными из нижеследующего описания и прилагаемой формулы изобретения.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

[0006] ФИГ. 1: вид в перспективе устройства для электропорации в соответствии с одним или более вариантами реализации.

[0007] ФИГ. 2: сечение устройства для электропорации в соответствии с одним или более вариантами реализации.

[0008] ФИГ. 3: вид сверху камеры в соответствии с одним или более вариантами реализации.

[0009] ФИГ. 4: блок-схема в соответствии с одним или более вариантами реализации.

[0010] ФИГ. 5: вид в перспективе уплотнения в соответствии с одним или более вариантами реализации.

[0011] ФИГ. 6: сечение уплотнительного колпачка (также называемого колпачком камеры) в соответствии с одним или более вариантами реализации.

[0012] ФИГ. 7: вид сбоку одной камеры для электропорации в соответствии с одним или более вариантами реализации.

[0013] ФИГ. 8: другой вид сбоку одной камеры для электропорации в соответствии с одним или более вариантами реализации.

[0014] ФИГ. 9: множество камер для электропорации, находящихся в устройстве для электропорации, в соответствии с одним или более вариантами реализации.

[0015] ФИГ. 10: приведенная для примера док-станция в соответствии с одним или более вариантами реализации.

[0016] ФИГ. 11: сечение уплотнения в соответствии с одним или более вариантами реализации.

[0017] ФИГ. 12: схема клапана (клапана камеры) в соответствии с одним или более вариантами реализации.

[0018] ФИГ. 13: вид спереди рычажного участка клапана камеры в соответствии с одним или более вариантами реализации.

[0019] ФИГ. 14: вид снизу устройства для электропорации в соответствии с одним или более вариантами реализации.

[0020] ФИГ. 15: сечение приведенного для примера впускного насоса и приведенного для примера выпускного насоса в соответствии с одним или более вариантами реализации.

[0021] ФИГ. 16: вид устройства для электропорации в разобранном виде в соответствии с одним или более вариантами реализации.

[0022] ФИГ. 17: вид устройства для электропорации в собранном виде в соответствии с одним или более вариантами реализации.

[0023] ФИГ. 18: пример одной процедуры электропорации в соответствии с одним или более вариантами реализации.

[0024] ФИГ. 19: блок-схема работы док-станции для электропорации в соответствии с одним или более вариантами реализации.

ОСУЩЕСТВЛЕНИЕ И3ОБРЕТЕНИЯ

[0025] В последующем подробном описании вариантов реализации изложены многочисленные уточняющие детали с целью обеспечения более полного понимания раскрытой технологии. Однако специалисту в данной области техники будет очевидно, что раскрытая технология может быть применена на практике без данных уточняющих деталей или с эквивалентными заменами по форме и/или функции.

[0026] Во всем тексте настоящей заявки порядковые номера (например, первый, второй, третий и т.д.) могут быть использованы в качестве прилагательного для элемента (т.е. любого существительного в тексте настоящей заявки). Использование порядковых номеров не должно подразумевать или создавать какой-либо конкретный порядок элементов, а также не должно ограничивать какой-либо элемент единственным элементом, если это явно не указано, например, с помощью терминов «до», «после», «один» и других подобных терминов. Порядковые номера использованы в тексте настоящей заявки с целью различения элементов. Например, первый элемент отличается от второго элемента, и первый элемент может следовать (или предшествовать) второму элементу при упорядочении элементов.

[0027] Один или более вариантов реализации относят к устройству для электропорации и способам применения/эксплуатации устройства для электропорации. Устройство для электропорации позволяет проводить крупномасштабные процессы электропорации.

[0028] На ФИГ. 1 показано устройство для электропорации (100) в соответствии с одним или более вариантами реализации. Устройство (100) для электропорации может быть названо картриджем (или кассетой). Устройство для электропорации может быть стерильным. Устройство (100) для электропорации может содержать корпус, выполненный из пластика (например, поликарбоната), стекла или другого материала, пригодного для биологического и/или медицинского применения. Как показано на ФИГ. 1, устройство (100) для электропорации имеет множество компонентов, включающих множество отверстий (105), впускное отверстие (110), выпускное отверстие (115), множество электродов (120) и множество разъемов (125) насоса. Как обсуждается далее и показано на ФИГ. 2, устройство (100) для электропорации может дополнительно содержать насосы (например, диафрагменные насосы; каждый насос оснащен двумя запорными клапанами (например, впускной и выпускной запорные клапаны для пропускания только одностороннего (однонаправленного) потока текучей среды)) с целью обеспечения движения текучей среды по всему устройству (100) для электропорации. Каждый компонент будет описан ниже.

[0029] В одном или более вариантах реализации множество отверстий (105) ведут в камеры (подробно описаны ниже). Клетки (вместе с любым сопутствующим суспензионным материалом) могут быть помещены в одну или более камер через многочисленные отверстия (105). Химические вещества, лекарства и/или макромолекулы, такие как белки и нуклеиновые кислоты (такие как ДНК и РНК в различных формах), которые должны быть введены в клетки во время электропорации, также могут быть депонированы в камеры через множество отверстий (105). Несмотря на то, что на ФИГ. 1 показано восемь отверстий (и, следовательно, восемь камер), в других вариантах реализации может быть другое количество отверстий (и, следовательно, другое количество камер). Например, в некоторых вариантах реализации картридж может иметь 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или более камер с возможностью увеличения их количества, что может быть необходимо для увеличения емкости электропорации клеток (или емкости электропорации партии). В одном или более вариантах реализации одно и то же отверстие может быть применено для нескольких камер одновременно.

[0030] В одном или более вариантах реализации каждый из множества электродов (120) связан с одной из камер. Более того, каждый из множества электродов (120) имеет внутреннюю часть и наружную часть. Внутренняя часть находится внутри камеры и контактирует с содержимым (например, клетками), хранящимся в камере. Наружная часть является внешней по отношению к камере и находится на поверхности устройства (100) для электропорации и/или выступает за пределы поверхности устройства (100) для электропорации. Внутренняя часть и/или наружная часть могут иметь эллиптическую (например, круговую) поверхность. Возможны и другие формы (например, прямоугольные). Каждый из электродов (120) может содержать основу, состоящую из одного металла или сплава, и покрытие, состоящее из того же или другого металла или сплава. Например, каждый из множества электродов (120) может содержать основу, состоящую из алюминия, и золотое покрытие. Другие металлы (например, медь, серебро и т.д.) также могут быть использованы вместо алюминия и/или золота или в дополнение к алюминию и/или золоту. Металлы и/или сплавы могут быть выбраны на основе их химической инертности и, таким образом, маловероятное™ химической реакции с содержимым (например, клетками) камер или проникновения в камеры.

[0031] В одном или более вариантах реализации электроды расположены на противоположных поверхностях устройства (100) для электропорации. Другими словами, несколько электродов (120) могут дублироваться на противоположной поверхности. В результате каждая камера может быть связана с парой электродов, находящихся на противоположных боковых стенках (по одному электроду со стороны каждой поверхности). Процесс электропорации может быть выполнен путем приложения напряжения к паре электродов, что приводит к возникновению электрического поля внутри камеры, связанного с парой электродов.

[0032] В одном или более вариантах реализации впускное отверстие (110) и выпускное отверстие (115) расположены на противоположных концах устройства (100) для электропорации. Впускное отверстие (110) и выпускное отверстие (115) могут быть расположены на одной и той же или на разных поверхностях устройства (100) для электропорации, таких как верхняя поверхность или нижняя поверхность. Впускное отверстие (110) действует в качестве входа для жидкой среды во время процесса сбора клеток. Жидкая среда, полученная через впускное отверстие (110), может быть применена, например, для промывания камер после процесса электропорации. В одном или более вариантах реализации впускное отверстие (110) выполнено с возможностью соединения с мешком (или другим контейнером), в котором хранится жидкая среда, с помощью охватываемого фитинга с замком Люэра (не показан). Выпускное отверстие (115) действует как точка сбора во время процесса сбора клеток. В выпускное отверстие (115) поступают клетки из камер после того, как электропорированные клетки (в жидкой среде) и свободная от клеток жидкая среда (для промывания камер) были транспортированы через проточные каналы. В одном или более вариантах реализации выпускное отверстие (115) выполнено с возможностью соединения с мешком (или другим контейнером), в котором хранятся собранные клетки и собранная жидкая среда, с помощью охватываемого фитинга с замком Люэра (не показан).

[0033] В одном или более вариантах реализации гидросистемные устройства (например, насосы) могут быть соединены с разъемами насоса (ФИГ. 1 (125)) для применения в процессе сбора клеток с целью обеспечения движения текучей среды внутри устройства (100) для электропорации, например, перемещение клеток после процесса электропорации в мешки для сбора клеток. Гидросистемные устройства и процесс сбора клеток описаны ниже.

[0034] На ФИГ. 2 показана линейное изображение сечения устройства (100) для электропорации в соответствии с одним или более вариантами реализации. Как показано на ФИГ. 2, устройство (100) для электропорации содержит множество камер (205), множество клапанов (210), проточный канал (215), множество боковых проточных каналов (например, боковой проточный канал А (220А), боковой проточный канал В (220В)), несколько насосов (например, насос А (225А), насос В (225В)) и канал воздушного потока (230) с вентиляционным отверстием (235). Насос А 225А и насос В 225В могут быть названы впускным насосом и выпускным насосом соответственно. Каждый из данных компонентов описан ниже.

[0035] В одном или более вариантах реализации камеры (205) выполнены с возможностью хранения клеток вместе с химическими веществами, лекарствами и/или макромолекулами, такими как белки и нуклеиновые кислоты, которые должны быть введены в клетки во время процесса электропорации. Камеры (205) могут быть изготовлены из корпуса устройства (100) для электропорации и, таким образом, могут быть изготовлены из пластика (например, поликарбоната). В одном или более вариантах реализации нижняя часть каждой камеры (205) имеет каплевидную форму, как описано ниже со ссылкой на ФИГ. 7. Другими словами, стенки в нижней части камеры наклонены внутрь (т.е. камера становится более узкой) по направлению ко дну камеры. Это может быть полезно при опорожнении камер (205) (описано ниже). Камеры (205) могут быть выполнены с возможностью хранения любого желаемого объема в камере, включающего, например, по меньшей мере 250 микролитров (мкл), 300 мкл, 350 мкл, 400 мкл, 450 мкл, 500 мкл, 600 мкл, 640 мкл, 700 мкл, 750 мкл, 800 мкл, 900 мкл, 1 миллилитр (мл), 2 мл и так далее. Разные камеры (205) могут иметь разные размеры и вмещать разные объемы. В одном или более вариантах реализации камеры выполнены с возможностью хранения от 300 до 640 мкл (объем клеток в жидкой суспензии) при проведении процесса электропорации. В одном или более вариантах реализации камеры выполнены с возможностью хранения максимального объема 600 мкл клеток в жидкой суспензии для электропорации. В одном или более вариантах реализации камеры предназначены для хранения максимального объема 640 мкл клеток в жидкой суспензии для электропорации.

[0036] Как было указано выше, устройство для электропорации может иметь восемь камер (120). Данные восемь камер в комбинации могут быть выполнены с возможностью хранения по меньшей мере 2 мл (например, 8 камер по 250 мкл), по меньшей мере 2,4 мл (например, 8 камер по 300 мкл), по меньшей мере 3,2 мл (например, 8 камер по 400 мкл), по меньшей мере 4 мл (например, 8 камер по 500 мкл), по меньшей мере 4,8 мл (например, 8 камер по 600 мкл), по меньшей мере 5,6 мл (например, 8 камер по 700 мкл) или по меньшей мере 6,4 мл (например, 8 камер по 800 мкл) объема клеток в жидкой суспензии для электропорации.

[0037] В одном или более вариантах реализации клапаны (210) соединяют камеры (205) с проточным каналом (215) (см., например, ФИГ. 2). Для каждой камеры может быть применен один клапан. В качестве альтернативного варианта несколько камер могут иметь общий клапан. Каждый из клапанов (210) может соответствовать клапану зонтичного типа, клапану пережимного типа, клапану поршневого типа, клапану отсечного типа, клапану пружинного типа, клапану рычажного типа и т.д. Клапаны (210) могут быть стандартными (т.е. имеющимися в продаже) клапанами вышеуказанных типов. Предпочтительно выбор клапана может снизить вероятность утечки, уменьшить вероятность засорения и увеличить количество клеток, собранных в процессе сбора клеток (как описано ниже). По умолчанию клапаны (210) находятся в закрытом положении. Несколько клапанов (210) могут быть открыты одновременно. В качестве альтернативного варианта клапаны (210) могут быть открыты последовательно, например, по одному за раз.

[0038] В некоторых вариантах реализации каждый клапан камеры представляет собой пережимной клапан и не допускает утечек при давлении по меньшей мере до примерно 0,24 МПа (35 psi) и дает утечку при отрицательном давлении по меньшей мере -0,069 МПа (-10 psi).

[0039] На ФИГ. 12 показана схема клапана (1200) в соответствии с одним или более вариантами реализации как для открытого, так и для закрытого положения клапана. Клапан (1200) может соответствовать любому из клапанов (210), рассмотренных выше со ссылкой на ФИГ. 2. Клапан (1200) может содержать рычажный участок (1201) и пружину (1210). Рычажный участок (1201) может содержать пружинный соединитель (1206), с помощью которого пружина (1210) присоединяется к рычажному участку (1201). Рычажный участок (1201) может также содержать шарнир (1203), колпак (1205) и силовой участок (1207).

[0040] Клапан (1200) связан с одной из камер (205). В одном или более вариантах реализации при закрытом положении клапана (1200), колпак (1205) смещает и прижимает резиновый слой между выпускным отверстием на дне камеры и проточным каналом (215). Таким образом, выпускное отверстие в нижней части камеры герметично закупоривается, что предотвращает вытекание содержимого камеры в проточный канал (215) и/или попадание жидкости через проточный канал (215) в камеру. В одном или более вариантах реализации резиновый слой представляет собой гибкую часть проточного канала (215). Пружина (1210) удерживает клапан (1200) в закрытом положении в момент, когда на него не действуют никакие внешние силы.

[0041] В одном или более вариантах реализации для того, чтобы открыть клапан (1200), нужно приложить усилие к силовому участку (1207) рычажного участка (1201). Например, усилие может быть приложено с помощью привода клапана док-станции (описан ниже). Под действием силы рычажный участок (1201) вращается вокруг шарнира (1203). Такое перемещение рычажного участка (1201) также вызывает перемещение колпака (1205) и открытие выпускного отверстия в нижней части камеры. Соответственно, когда выпускное отверстие в нижней части камеры закрыто, содержимое камеры может вытекать в проточный канал (215) и/или жидкость через проточный канал (215) может попадать в камеру (например, при работе насоса). Когда сила перестает действовать на силовой участок (1207), пружина (1210) заставляет клапан (1200) вернуться в закрытое положение. Другими словами, пружина (1210) заставляет рычажный участок (1201) вращаться вокруг шарнира (1203), что заставляет колпак (1205) смещаться и сжимать резиновый слой, герметично закупоривая выпускное отверстие.

[0042] На ФИГ. 13 показан вид спереди рычажного участка (1201) в соответствии с одним или более вариантами реализации. Как показано на ФИГ. 13, рычажный участок (1201) содержит шарнир (1203), колпак (1205) и пружинный соединитель (1206).

[0043] На ФИГ. 14 показан вид снизу устройства (100) для электропорации в соответствии с одним или более вариантами реализации. На ФИГ. 14 видны как проточный канал (215), так и выпускные отверстия камер (например, выпускное отверстие (1405) камер (205)). Когда клапан (1200) закрыт, колпак (1205) закупоривает выпускное отверстие (1405) камеры. Как указано выше, это предотвращает вытекание содержимого камеры в проточный канал (215) и/или попадание жидкости через проточный канал (215) в камеру. Когда клапан (1200) открыт, колпак (1205) не закупоривает выпускное отверстие камеры (1405), и содержимое камеры может вытечь в проточный канал (215). Аналогичным образом, жидкость через проточный канал (215) может попадать в камеру, если на нее действует сила, с которой работает насос, или другая сила, способная перемещать жидкость (например, сила тяжести (гравитационный поток), повышенное давление воздуха и т.д.).

[0044] На ФИГ. 15 показано сечение приведенного для примера впускного насоса (225А) и приведенного для примера выпускного насоса (225В) в соответствии с одним или более вариантами реализации. Приведенные для примера насосы (225А, 225В) на ФИГ. 15 встроены в линию с боковыми проточными каналами (220А, 220В). Насосы (225А, 225В), как показано, имеют гибкую (например, силиконовую) диафрагму (1508), примыкающую к полости для текучей среды, которая находится рядом с запорными клапанами типа «утиный клюв» (1506) (для обеспечения одностороннего (однонаправленного) потока текучей среды). Каждый из насосов (225А, 225В) приводят в действие за счет неоднократного сплющивания «купола» диафрагмы (1508) (с помощью приводов док-станции) с целью вытеснения текучей среды. В некоторых вариантах реализации нормальное значение рабочего потока каждого из насосов (225А, 225В) составляет примерно 15 мл/мин при 300 об/мин (оборотов в минуту) и значение при режиме «быстрого потока» составляет примерно 30 мл/мин при 600 об/мин привода насоса. В некоторых вариантах реализации поток насоса можно регулировать с шагом 50 мкл. В некоторых вариантах реализации каждый из насосов (225А, 225В) также способен действовать в качестве клапана, не допуская утечек при давлении по меньшей мере до 0,24 МПа (35 psi) и при давлении до отрицательного значения по меньшей мере -0,069 МПа (-10 psi).

[0045] На ФИГ. 15 также показаны охватываемые фитинги (1504) замком Люэра, вставленные как во впускное отверстие (110), так и выпускное отверстие (115). Колпачки (1502) Люэра вставлены охватываемые фитинги (1504) с замком Люэра.

[0046] Со ссылкой на ФИГ. 2, в одном или более вариантах реализации боковые проточные каналы (220А, 220В) соединяют проточный канал (215) с впускным отверстием (110) и выпускным отверстием (115). Каждый из каналов (220А, 220В, 215) может представлять собой трубку, выполненную в корпусе или иным образом, состоящую из пластика (например, поликарбоната), стекла, металла и т.д. В процессе сбора клеток содержимое (например, жидкая суспензия клеток) в камерах (210) может быть слито в проточный канал (215) путем открытия клапанов (210). Жидкая среда (поступившая через впускное отверстие (110)) может затечь в проточный канал (215) через боковой проточный канал А (220А) и вымыть дренированное содержимое (например, жидкую суспензию клеток) из проточного канала (215) в выпускное отверстие (115) через боковой проточный канал В (220В). Более того, жидкая среда может поступать в камеру с открытым клапаном (т.е. жидкая среда поступает в камеру из проточного канала (215)) и собирать дополнительные клетки (т.е. удалять больше клеток из камеры) путем промывания камеры перед затеканием в выпускное отверстие (115) через боковой проточный канал В (220В). Соответственно, проточный канал (215) и по меньшей мере один из боковых проточных каналов (например, 220В) выполнены с возможностью транспортировки клеток, прошедших процесс электропорации, во время процесса сбора клеток.

[0047] В одном или более вариантах реализации один или более насосов (насос А (225А), насос В (225В)) применяют для перемещения жидкой среды и, таким образом, промывают камеры (205) и проталкивают клетки к выпускному отверстию (115). Как описано выше, насос А 225А и насос В 225В можно называть впускным насосом и выпускным насосом соответственно. Количество и объем ходов насоса, необходимых для промывания данной камеры и проталкивания дренированного содержимого (т.е. жидкой суспензии клеток) к выпускному отверстию (115), зависит, например, от расстояния до впускного отверстия (110) заданной камеры.

[0048] В одном или более вариантах реализации канал воздушного потока (230) соединяет воздушный поток между несколькими камерами (205) под уплотнительным колпачком (500). Канал (230) воздушного потока соединен с наружной частью (например, поддерживает атмосферное давление) устройства для электропорации через вентиляционное отверстие или фильтр (235) (например, микробный воздушный фильтр или стандартный 0,2-микронный фильтр). После помещения клеток в камеры (205), но до выполнения процесса электропорации, отверстия (105) закупоривают (закрывают) уплотнением (как описано далее со ссылкой на ФИГ. 5 и 6), изготовленным, например, из силикона (или другого биологически совместимого материала), что создает замкнутую систему. Вентиляционное отверстие (235) или фильтр снаружи и канал (230) воздушного потока уменьшают или устраняют возможность образования частичного вакуума (например, меньшего, чем атмосферное давление в камерах) и, таким образом, способствуют дренированию камеры (в проточный канал (215)) в процессе сбора клеток, сохраняя при этом асептическую целостность камеры. В одном или более вариантах реализации сжатый воздух можно нагнетать в вентиляционное отверстие (235) и, таким образом, в канал (230) воздушного потока с целью ускорения дренирования камер во время процесса сбора клеток (при этом поток такого сжатого воздуха не сможет поднять или открыть уплотнительную крышку).

[0049] Как указано выше, имеются электроды (120), связанные с камерами (205). Как описано выше, внутренняя часть каждого электрода может иметь эллиптическую (например, круговую) поверхность. Эллиптические поверхности электродов (120) показаны на ФИГ. 2. В одном или более вариантах реализации эллиптические поверхности представляют собой круги диаметром 19,5 мм или приблизительно 19,5 мм. Также возможны другие диаметры и формы электродов. В одном или более вариантах реализации эллиптическая (или круговая) форма увеличивает проводимость на поверхности электрода.

[0050] На ФИГ. 3 показан схематичный вид сверху одной камеры (305) в соответствии с одним или более вариантами реализации. Камера (305) может соответствовать любой из камер (205), рассмотренных выше со ссылкой на ФИГ. 2. Камера (305) имеет противоположные края (330А, 330В). Как показано на ФИГ. 3, камера (305) связана с парой электродов (электрод А (320А), электрод В (320В)). Два электрода (320А, 320В) могут соответствовать электродам (120), описанным выше со ссылкой на ФИГ. 1 и 2. Пара электродов (320А, 320В) расположена на противоположных сторонах камеры (305). В одном или более вариантах реализации внутренние поверхности электродов (320А, 320В) образуют противоположные боковые стенки (340А, 340В) камеры (305). В одном или более других вариантах реализации внутренняя поверхность каждого из электродов (320А, 320В) примыкает к боковой стенке камеры (305). Как описано выше, во время процесса электропорации к электродам (320А, 320В) прикладывают напряжение для создания электрического поля внутри камеры (305). Каждый электрод в паре электродов может быть отнесен друг от друга на расстояние, достаточное для уменьшения или устранения дугового разряда между электродами, но достаточно близкое, чтобы поддерживать электрическое поле между электродами. Например, поверхность электрода 320А на боковой стенке 340А может отстоять от поверхности электрода 320В на боковой стенке 340В примерно на 4 миллиметра (мм). Также возможны другие расстояния, разделяющие электроды, (например, приблизительно 1 мм, 3 мм, 5 мм, 7 мм, 10 мм и т.д.).

[0051] На ФИГ. 7 показан вид сбоку одной камеры (305) в соответствии с одним или более вариантами реализации без установленных электродов. В варианте реализации по ФИГ. 7, камера (305) имеет сечение в форме перевернутой капли (т.е. камера становится более узкой в нижней части (или сужается к нижней части)). Такая каплевидная форма способствует дренированию электропорированных клеток из камеры (305) в проточный канал (215). Несмотря на то, что вариант реализации по ФИГ. 7 предполагает сечение камеры в форме перевернутой капли, специалист в данной области техники поймет, что также можно применять и другие формы камеры, включающие закругленную, прямоугольную, треугольную, ромбовидную, трубчатую и т.д.

[0052] В одном или более вариантах реализации обод (702) окаймляет края камеры (305). Обод (702) поддерживает один из пары электродов (320А, 320В). Аналогичный обод присутствует на противоположной стороне камеры (305) для поддержания другой пары электродов (320А, 320В). На ФИГ. 8 показан вид сбоку камеры, показанной на ФИГ. 7, с установленным электродом (320А).

[0053] Возвращаясь к ФИГ. 7, краевые поверхности (330А, 330В), которые могут включать нижнюю поверхность (поверхности) камеры (305), могут быть образованы корпусом устройства (100) для электропорации. Боковые стенки (ФИГ. 3; 340А, 340В) камеры (305) могут быть сформированы после того, как электроды (320А, 320В) будут вставлены в обода (702).

[0054] На ФИГ. 9 показано несколько камер (305), расположенных рядом друг с другом, в соответствии с одним или более вариантами реализации. В одном или более вариантах реализации электроды (320) отнесены друг от друга на расстояние (902), чтобы исключить взаимодействие между соседними электродами (320).

[0055] Как показано выше при описании ФИГ. 2, в одном или более вариантах реализации отверстия (105) в верхней части камер (205) могут быть закрыты уплотнением с целью создания автономного, биологически безопасного устройства после поступления необходимых материалов (например, жидкой суспензии клеток) и добавления в камеры (205) материала для электропорации (например, нуклеиновых кислот). На ФИГ. 5 показано приведенное для примера уплотнение 500, которое можно применять для герметизации нескольких отверстий (105). На ФИГ. 5 показано несколько уплотнительных колпачков (502А--502Н), причем каждый уплотнительный колпачок (502) соответствует одному из отверстий (105). Исходя из того, что на ФИГ. 5 показано несколько уплотнительных колпачков (502), соединенных друг с другом с помощью перемычек (504A-504G), специалист в данной области техники, ознакомившись с этим подробным описанием, поймет, что отдельные уплотнительные колпачки (502) могут быть применены отдельно к каждому из отверстий (105) или что меньшие группы уплотнительных колпачков (502) могут быть соединены вместе для герметизации поднабор отверстий (105).

[0056] Каждый уплотнительный колпачок (502) включает в себя верхнюю часть (506) и нижнюю кромку (508). На ФИГ. 6 показано сечение уплотнительного колпачка (502) в соответствии с одним или более вариантами реализации. Верхняя часть (506) уплотнительного колпачка (502) предназначена для герметизации верхней части соответствующей камеры (205). Нижняя кромка (508) выполнена с возможностью проходить в соответствующее отверстие (105) соответствующей камеры (205) для обеспечения плотного прилегания между отверстием (105) и уплотнительным колпачком (502). В одном или более вариантах реализации, несмотря на то, что нижняя кромка (508) частично проходит в соответствующее отверстие (105), между нижней кромкой (508) и соответствующей камерой (205) остается достаточно места, чтобы обеспечить поток воздуха между камерой (205) и каналом (230) воздушного потока. Аналогичным образом, когда уплотнение (500) устанавливается в нескольких камер (205), под перемычками (504) остается достаточно места для обеспечения потока воздуха через канал (230) воздушного потока. Поскольку канал (230) воздушного потока вентилируется через воздушный фильтр или вентиляционное отверстие (235), уплотнение (500) создает биологически закрытую замкнутую систему, которая по-прежнему позволяет поддерживать давление воздуха внутри системы.

[0057] На ФИГ. 11 показано сечение уплотнения (500), вставленного в отверстие (105) соответствующей камеры (205), в соответствии с одним или более вариантами реализации. Как видно из ФИГ. 11, уплотнительный колпачок уплотнения (500) вплотную входит в стенки конусообразной камеры в отверстии (105) и упирается в них, создавая уплотнение. Двусторонняя стрелка указывает расстояние между внутренними поверхностями электродов. Вентиляционное отверстие (или микробный воздушный фильтр) обозначен кружком слева от колпачка (500) камеры.

[0058] На ФИГ. 16 показан вид устройства (100) для электропорации в разобранном виде, которое (как указано выше) также может быть назван картриджем. На ФИГ. 16 показаны несколько электродов (120), впускное отверстие (110), выпускное отверстие (115), охватываемые фитинги (1504) с замком Люэра, колпачки (1502) Люэра и уплотнение (500) до начала сборки устройства (100) для электропорации. На ФИГ. 16 также показаны корпус А (1605А) насоса и корпус В (1605) насоса, выполненные с возможностью хранения компонентов впускного насоса (225А) и выпускного насоса (225В) соответственно.

[0059] На ФИГ. 17 показано устройство (100) для электропорации в собранном виде; устройство для электропорации (как указано выше) также может быть названо картриджем. На ФИГ. 17 показаны несколько электродов 120, корпус А (1605А) насоса, корпус В (1605В) насоса, множество клапанов (210) камер, каждый клапан с пружиной (1210) и рычагом (1201), уплотнение (500), охватываемые фитинги (1504) с замком Люэра и колпачки (1502) Люэра.

[0060] На ФИГ. 4 показана блок-схема в соответствии с одним или более вариантами реализации. Блок-схема на ФИГ. 4 описывает процесс применения/эксплуатации устройства (100) для электропорации, описанного выше. В одном или более вариантах реализации один или более этапов, указанных в блок-схеме на ФИГ. 4, могут быть опущены, повторены и/или выполнены в порядке, отличном от порядка, указанного на ФИГ. 4. Соответственно, объем изобретения не следует считать ограниченным конкретным порядком этапов, указанных на ФИГ. 4.

[0061] На этапе 407 клетки и химические вещества, лекарства и/или макромолекулы, такие как белки и нуклеиновые кислоты, которые должны быть введены в клетки, загружают в камеры (205) устройства (100) для электропорации. 3агрузка может происходить, например, через отверстия (105). Отверстия (105) затем могут быть закрыты с использованием уплотнения, такого как уплотнение (500) и/или уплотнительные колпачки (502). Несмотря на то, что устройство для (100) электропорации содержит несколько камер, некоторые камеры могут не применяться (т.е. жидкая суспензия клеток может не помещаться в некоторые камеры).

[0062] На этапе 409 устройство (100) для электропорации помещают в док-станцию. ФИГ. 10 иллюстрирует приведенную для примера док-станцию (1000) в соответствии с одним или более вариантами реализации. Док-станция (1000) содержит держатель (1002), приводы (1004) клапанов, электрические контакты (1006) и приводы (1008) насосов. Держатель (1002) имеет такие размеры и форму, чтобы вмещать и удерживать устройство (100) для электропорации в безопасном прямостоящем положении. Приводы (1004) клапанов выполнены с возможностью взаимодействия с клапанами (210) устройства (100) для электропорации. Например, если клапаны (210) устройства (100) для электропорации представляют собой клапаны пружинного типа, то приводы (1004) клапанов будут содержать компоненты, которые прикладывают усилие (например, надавливают) на клапаны (210), чтобы открыть клапаны (210). В одном или более вариантах реализации каждый привод (1004) клапана имеет взаимно однозначное соответствие с клапаном (210), так что каждым клапаном (210) можно индивидуально управлять с помощью соответствующего привода (1004) клапана.

[0063] Электрические контакты (1006) док-станции (1000) взаимодействуют с электродами (120) устройства (100) для электропорации. Как показано на ФИГ. 10, электрические контакты (1006) могут быть расположены линейно вдоль длины держателя (1002). Более того, электрические контакты (1006) могут быть расположены на противоположных сторонах держателя (1002); для наглядности на ФИГ. 10 изображена только одна сторона (1002). Электрические контакты (1006) могут быть, например, контактами высокого напряжения. Приводы (1008) насосов док-станции (1000) взаимодействуют с жидкостными компонентами устройства (100) для электропорации, такими как насосы (насос А (225А), насос В (225В)). Каждым из приводов (1004) клапана, электрических контактов (1006) и приводов (1008) насоса можно управлять с помощью одного или более блоков управления или устройств (не показаны), функционально связанных с док-станцией.

[0064] Возвращаясь к ФИГ. 4, на этапе 409 после помещения устройства (100) для электропорации в док-станцию наружная часть каждого из электродов (120) находится в контакте с одной или более электрическими цепями док-станции, такими как электрические контакты (1006) док-станции (1000). Соответственно, электроды (120) становятся элементами одной или более электрических цепей после помещения устройства (100) для электропорации в док-станцию. Кроме того, после помещения устройства (100) для электропорации в док-станцию один или более насосов (225А, 225В) и клапаны (210) или рычажные участки (1201) клапана могут находиться в рабочем контакте с приводами док-станции. Мешок (или другой контейнер) с жидкой средой может быть присоединен к впускному отверстию (110), а мешок для сбора (или другой контейнер) может быть присоединен к выпускному отверстию (115) устройства (100) для электропорации.

[0065] На этапе 412 электрические поля внутри одной или более камер (205) могут быть созданы с использованием электродов (120). Например, док-станция может подавать один или более импульсов напряжения на электроды (120) с использованием цепей (например, через электрические контакты 1006), управляемых программным обеспечением (например, через подключенное компьютерное устройство) для создания электрических полей. Электрические поля могут быть созданы во всех камерах (205) одновременно. В качестве альтернативного варианта электрическое поле может быть сгенерировано для каждой камеры (205) по одному за раз или для поднабора камер (205) одновременно. Эти приложенные электрические поля увеличивают проницаемость мембраны клеток и, таким образом, позволяют химическим веществам, лекарствам и/или макромолекулам, таким как белки и нуклеиновые кислоты, поступать в клетки.

[0066] На этапе 414 открывают клапаны (210) устройства (100) для электропорации. Например, приводы (1004) клапанов док-станции (1000) могут открывать клапаны (210) устройства (100) для электропорации, находящегося в держателе док-станции. С помощью док-станции можно открывать все клапаны (210) одновременно. В качестве альтернативного варианта, с помощью док-станции можно открывать клапаны (210) по одному за раз или одновременно открывать поднабор клапанов (210). В зависимости от типа клапана приводы могут управлять работой поршней, рычагов, пружин и т.д., чтобы открыть клапаны (210). Другими словами, клапаны (210) могут работать с помощью движения пружины, движения рычага, движения поршня и т.д. Открытие одного из клапанов (210) позволяет слить содержимое камеры, соединенной с клапаном, в проточный канал (215). Такой дренаж может быть результатом одной или более из: гидравлической силы, создаваемой приведением в действие насоса или насосов; гравитационной силы (в зависимости от расположения клапанов (210) по отношению к камерам (205)); перепада давления между камерой (205) и проточным каналом (215); повышенного давления воздуха; капиллярного эффекта и т.д. В одном или более вариантах реализации вентилируемый канал (230) воздушного потока, проходящий под отверстиями (105) и между камерами (205) может способствовать процессу слива, предотвращая создание частичного вакуума. В одном варианте реализации сжатый воздух можно нагнетать в воздушный фильтр или вентиляционное отверстие (235), соединяющее канал (230) воздушного потока с наружной частью устройства (100) для электропорации, для ускорения процесса слива.

[0067] На этапе 416 жидкую среду перекачивают через впускное отверстие (110) в камеры (205) устройства (100) для электропорации, а электропорированные клетки собирают через выпускное отверстие (115). Например, с помощью приводов (1008) насосов док-станции (1000) можно управлять одним или более насосами (225А, 225В) с целью перекачивания жидкой среды из мешка (или другого контейнера), прикрепленного к впускному отверстию (110), в устройство (100) для электропорации. При работе насосов (225А, 225В) жидкая среда проходит через различные каналы (220А, 215, 220В) и транспортирует слитую жидкую суспензию клеток в проточном канале (215) к выпускному отверстию (115) и затем в мешок для сбора (или другой контейнер), прикрепленный к выпускному отверстию (115). Действие насосов (225А, 225В) также заставляет жидкую среду поступать в камеры (205) из проточного канала (215) (через открытые клапаны), так что жидкая среда промывает камеры (205) от любых остаточных/оставшихся клеток в камерах (205) перед транспортировкой клеток к выпускному отверстию (115) через проточный канал (215). Камеры (205) можно промывать одновременно. В качестве альтернативного варианта камеры (205) могут быть промыты по одной за раз, или поднабор камер (205) может быть промыт вместе. Более того, каждая камера может быть промыта сразу же после опорожнения.

[0068] В одном или более вариантах реализации этап 412 соответствует процессу электропорации, тогда как этап 414 и этап 416 соответствуют процессу сбора клеток, который выполняется после процесса электропорации.

[0069] На ФИГ. 19 показана блок-схема в соответствии с одним или более вариантами реализации. Блок-схема на ФИГ. 19 изображает процесс применения/эксплуатации док-станции (1000), описанный выше со ссылкой на ФИГ. 10. В одном или более вариантах реализации один или более этапов, показанных на ФИГ. 19, могут быть опущены, повторены и/или выполнены в порядке, отличном от порядка, указанного на ФИГ. 19. Соответственно, объем изобретения не следует считать ограниченным конкретным порядком этапов, указанным на ФИГ. 19. Процесс, изображенный на ФИГ. 19, относится к процессу, изображенному на ФИГ. 4 (как описано выше).

[0070] На этапе 1907 устройство (100) для электропорации (в которое в одном варианте реализации предварительно загружают клетками в жидкой суспензии) закрепляют в держателе (1002) док-станции (1000). Держатель (1002) содержит отверстие для вставки устройства (100) для электропорации и его закрепления в прямостоящем положении. После закрепления устройства (100) для электропорации в держателе электрические контакты (1006) док-станции (1000) соприкасаются с электродами (120) устройства (100) для электропорации. Как описано выше, электрические контакты (1006) расположены на противоположных сторонах держателя (1002).

[0071] Аналогичным образом, после закрепления устройства (100) для электропорации, приводы (1004) клапанов док-станции (1000) могут взаимодействовать с клапанами (210) устройства (100) для электропорации, и приводы (1008) насосов док-станции (1000) могут взаимодействовать с насосами (225А, 225В) устройства (100) для электропорации.

[0072] Одна или более камер (205) устройства (100) для электропорации могут быть заполнены (посредством осаждения жидкой суспензии) клетками и химическими веществами, лекарствами и/или макромолекулами, такими как белки и нуклеиновые кислоты, которые должны быть введены в клетки перед тем, как устройство (100) для электропорации будет закреплено в держателе (1002). Кроме того, уплотнение (500) может быть установлено в отверстия (105) устройства (100) для электропорации до того, как устройство (100) для электропорации будет закреплено в держателе (1002). До или после того, как устройство (100) для электропорации будет закреплено в держателе (1002), мешок (или другой контейнер) с жидкой средой может быть присоединен к впускному отверстию (110) (с помощью охватываемого фитинга 1504 с замком Люэра) и мешок для сбора (или другой контейнер) может быть присоединен к выпускному отверстию (115) (помощью охватываемого фитинга 1504 с замком Люэра) устройства (100) для электропорации.

[0073] На этапе 1909 док-станция (1000) для электропорации генерирует электрические поля между парами электродов (120) в камерах (205) устройства (100) для электропорации с использованием электрических контактов (1006). Электрические контакты (1006) являются элементами цепи (цепей) док-станции (1000). Электрические поля можно генерировать путем возбуждения электрических контактов (1006) одним или более сигналами с применением генератора импульсов. Электрические поля можно создавать во всех камерах (205) одновременно. В качестве альтернативного варианта электрическое поле может быть сгенерировано для каждой камеры (205) по одному за раз или для поднабора камер (205) одновременно. Приложенные электрические поля увеличивают проницаемость мембраны клеток и, таким образом, позволяют вводить в клетки химические вещества, лекарства и/или макромолекулы, такие как белки и нуклеиновые кислоты.

[0074] На этапе 1912 приводы (1004) клапанов док-станции (1000) управляются для открывания клапанов (210) устройства (100) для электропорации. Док-станция (1000) может открывать все клапаны (210) одновременно. В качестве альтернативного варианта, док-станция (1000) может открывать клапаны (210) по одному за раз, или док-станция (1000) может одновременно открывать поднабор клапанов (210). В зависимости от типа клапана приводы могут приводить в действие поршни, рычаги, пружины и т.д., чтобы открыть клапаны (210). Открытие одного из клапанов (210) вызывает слив содержимого камеры, соединенной с клапаном, в проточный канал (215) устройства (100) для электропорации.

[0075] На этапе 1914 приводы (1008) насосов док-станции (1000) приводят в действие насосы (225А, 225В), что может приводить к многократному сплющиванию диафрагмы (1508) каждого насоса (225А, 225В). В результате жидкую среду перекачивают из мешка (или другого контейнера), прикрепленного к впускному отверстию (110), в устройство (100) для электропорации. В частности, под действием приводов (1008) насосов насосы (225А, 225В) перекачивают жидкую среду через различные каналы (220А, 215, 220В) и транспортируют дренированную жидкую суспензию клеток через проточный канал (215) в выпускное отверстие (115) и далее в мешок для сбора (или другой контейнер), прикрепленный к выпускному отверстию (115). Под действием насосов (225А, 225В) жидкая среда поступает в камеры (205) из проточного канала (215) (через открытые клапаны), тем самым промывая камеры (205) от любых остаточных/оставшихся в них клеток перед транспортировкой клеток к выпускному отверстию (115) через проточный канал (215). Камеры (205) можно промывать одновременно. В качестве альтернативного варианта камеры (205) могут быть промыты по одной за раз, или поднабор камер (205) может быть промыт вместе. Более того, каждая камера может быть промыта сразу же после опорожнения.

[0076] В одном или более вариантах реализации этап 1909 соответствует процессу электропорации, тогда как этап 1912 и этап 1914 соответствуют процессу сбора клеток, который выполняется после процесса электропорации.

[0077] В одном или более вариантах реализации устройство (100) для электропорации стерилизуют. В одном или более вариантах реализации устройство (100) для электропорации стерилизуют путем воздействия дозы гамма-излучения в 50 килогрей (кГр) или более. В одном или более вариантах реализации устройство (100) для электропорации стерилизуют путем воздействия дозы гамма-излучения в 50-70 килогрей (кГр). В одном или более вариантах реализации устройство (100) для электропорации полностью функционально после процедуры стерилизации. В одном или более вариантах реализации устройство (100) для электропорации полностью функционально после воздействия дозы гамма-излучения в 50-70 килогрей (кГр).

[0078] В одном или более вариантах реализации устройство (100) для электропорации предназначено для одноразового применения. В одном или более других вариантах реализации устройство (100) для электропорации может быть применено повторно. Другими словами, процесс, указанный на ФИГ. 4 и/или ФИГ. 19, можно повторять несколько раз с применением одного устройства для электропорации.

[0079] Стандартные системы для электропорации требуют применения нескольких кювет для электропорации большого количества клеток. Более того, несмотря на то, что бокс биологической безопасности (БББ) можно применять для обеспечения асептических условий в таких процессах (т.е. пипетирование клеток в несколько кювет), характер работы с несколькими кюветами неизбежно увеличивает вероятность внесения микробного загрязнения (т.е. потери асептических условий). Кроме того, такой многоэтапный процесс увеличивает время обработки/обслуживания, а также вносит неизбежные изменения в условия и/или согласованность процесса.

[0080] В качестве значительного усовершенствования по сравнению с предыдущими системами устройство (100) для электропорации и док-станция (1000) могут быть применимы для электропорации большого количества клеток в рамках одной процедуры электропорации (т.е. за один прогон электропорации).

[0081] В одном или более вариантах реализации устройство (100) для электропорации и док-станция (1000) могут быть применимы для электропорации, например, но не ограничиваясь этим, по меньшей мере 1×10⁸ клеток, по меньшей мере 2×10⁸ клеток, по меньшей мере 3×10⁸ клеток, по меньшей мере 4×10⁸ клеток, по меньшей мере 5×10⁸ клеток, по меньшей мере 6×10⁸ клеток, по меньшей мере 7×10⁸ клеток, по меньшей мере 8×10⁸ клеток, по меньшей мере 9×10⁸ клеток, по меньшей мере 1×10⁹ клеток, по меньшей мере 2×10⁹ клеток, по меньшей мере 3×10⁹ клеток, по меньшей мере 4×10⁹ клеток, по меньшей мере 5×10⁹ клеток, по меньшей мере б×10⁹ клеток, по меньшей мере 7×10⁹ клеток, по меньшей мере 8×10⁹ клеток, по меньшей мере 9×10⁹ клеток, по меньшей мере 1×10¹⁰ клеток, по меньшей мере 2×10¹⁰ клеток, по меньшей мере 3×10¹⁰ клеток, по меньшей мере 4×10¹⁰ клеток, по меньшей мере 5×10¹⁰ клеток, по меньшей мере 6×10¹⁰ клеток, по меньшей мере 7×10¹⁰ клеток, по меньшей мере 8×10¹⁰ клеток, по меньшей мере 9×10¹⁰ клеток, по меньшей мере 1×10¹¹ клеток, по меньшей мере 2×10¹¹ клеток, по меньшей мере 3×10¹¹ клеток, по меньшей мере 4×10¹¹ клеток, по меньшей мере 5×10¹¹ клеток, по меньшей мере 6×10¹¹ клеток, по меньшей мере 7×10¹¹ клеток, по меньшей мере 8×10¹¹ клеток, по меньшей мере 9×10¹¹ клеток, по меньшей мере 1×10¹² клеток, по меньшей мере 2×10¹² клеток, по меньшей мере 3×10¹² клеток, по меньшей мере 4×10¹² клеток, по меньшей мере 5×10¹² клеток, по меньшей мере 6×10¹² клеток, по меньшей мере 7×10¹² клеток, по меньшей мере 8×10¹² клеток и по меньшей мере 9×10¹² клеток за одну процедуру электропорации (т.е., за один прогон).

[0082] В одном или более вариантах реализации устройство (100) для электропорации и док-станция (1000) могут быть применены для электропорации любого типа эукариотических или прокариотических клеток (например, но не ограничиваясь ими, неприлипающих клеток, таких как иммунные клетки, NK-клетки, Т-клетки и др.).

[0083] На ФИГ. 18 показан пример «закрытой» (т.е. асептической или стерильной) конфигурации компонентов устройства для электропорации, применяемых в одной процедуре электропорации (прогон электропорации). Прогон может включать один или более из следующих этапов. В асептических условиях (например, в боксе биологической безопасности) контейнер (такой как мешок с поступающей средой (1805)) присоединяют к впускному отверстию (например, с помощью впускного стерильного шланга (1815)) и другой контейнер (например, выпускной мешок (1810) для культивированных клеток, предназначенный для сбора клеток после электропорации) присоединяют к выпускному отверстию (например, с помощью выпускного стерильного шланга (1820)). 3атем устройство для электропорации или картридж (100) (теперь это закрытая система) помещают в док-станцию или «гнездо» (1000), а остальные компоненты процесса электропорации можно контролировать с помощью компьютера (например, ноутбука или планшетного компьютера), функционально связанного с «гнездом», вместе с генератором импульсов электропорации (для передачи электрического сигнала (сигналов)). Между парами электродов камер создается одно или более электрических полей. Клетки, подвергнутые электропорации, собирают (например, путем перекачивания среды для культивирования клеток в устройстве для электропорации или картридже (100)) через выпускное отверстие (115) в контейнер для сбора (например, выпускной мешок (1810) для культивированных клеток); который может быть предварительно заполнен объемом культуральной среды. После завершения электропорации выпускной мешок (1810) для культивированных клеток может быть асептически отсоединен от устройства/картриджа для электропорации (например, путем термосваривания выпускного стерильного шланга с целью герметизации/закрытия соединения между выпускным мешком (1810) для культивированных клеток и выпускным отверстием (115)) и помещен в инкубатор.

[0084] Весь процесс электропорации с применением одного или более заявленных вариантов реализации выполняют за значительно меньшее время, чем необходимо для систем, требующих применения нескольких отдельных кювет. Таким образом, пример устройства для электропорации или картриджа (100), описанного в настоящей заявке, можно применять для автоматического проведения электропорации в закрытом режиме, таким образом, более эффективно и постоянно обеспечивая более высокие выходы трансфицированных клеток (например, трансфицированных иммунных клеток/Т-клеток), чем при применении других доступных систем. Таким образом, устройство (100) для электропорации, описанное в настоящей заявке, обеспечивает возможность электропорации большого количества клеток в закрытой системе высокоавтоматизированным способом (таким образом обеспечивая возможность быстрого и эффективного получения большого количества трансфицированных клеток в асептических и/или цГМФ производственных средах).

[0085] Контейнеры или мешки (1805, 1810), применяемые в процессе электропорации, могут быть, например, но не ограничиваясь ими, мешками для клеточных культур, изготовленными из фторированного этиленпропиленового (ФЭП) материала с целью обеспечения высокой проницаемости для кислорода и диоксида углерода, в то же время оставаясь непроницаемым для воды с целью улучшения культуры и увеличения количества клеток.

[0086] Компоненты устройства для электропорации или картриджа (100) могут включать электроды с золотым покрытием. 3олото может быть выбрано по причине его биосовместимости и наилучших электрических свойств. Устройство для электропорации или картридж (100) может быть собрано в контролируемой чистой среде. Устройство для электропорации или картридж (100) можно очищать и стерилизовать с помощью гамма-облучения перед распределением и/или применением.

[0087] Как указано выше, картридж для электропорации, описанный в настоящей заявке, может быть применен как часть системы, содержащей компьютер (включая, например, ноутбук или планшетный компьютер), генератор электрических импульсов и док-станцию или «гнездо» (1000) для закрепления (например, удерживания) и автоматического управления работой картриджа для электропорации (например, приложение электрического поля (полей) к клеткам, находящимся внутри камер устройства для электропорации, перекачивание среды и клеток через картридж (т.е. проточные каналы и камеры), открытие и закрытие клапанов (210) картриджа). В системе данного типа компьютер (или ноутбук/планшет) действует как пользовательский интерфейс, а также позволяет оперативно управлять генератором электрических импульсов. Генератор подает импульс электропорации через соединения в гнезде с помощью контактов с электродами картриджа. Таким образом, док-станция или «гнездо» (1000) удерживает картридж и обеспечивает как механический, так и электрический контакте картриджем.

[0088] Приведенный для примера картридж может содержать восемь камер и колпачок для закрытия и герметизации камер после заполнения материалами клеточной суспензии (например, клетками, средами, нуклеиновыми кислотами, белками, малыми молекулами). Картридж может иметь два фитинга (например, фитинги с замком Люэра) (1502, 1504), позволяющие асептически прикрепить мешок (1805) для поступающей среды и выпускной мешок (1810) для культивированных клеток в боксе биологической безопасности. Мешок (1805) для поступающей среды заполняется соответствующим количеством среды для восстановления и прикрепляется к входному фитингу на картридже пользователем, находящимся в боксе биологической безопасности (до проведения электропорации). Выпускной мешок (1810) для культивированных клеток может быть заполнен пользователем в боксе биологической безопасности (также перед электропорацией) и прикреплен к выходным фитингам на картридже.

[0089] Каждая камера (205), как правило, находится в закрытом положении с целью предотвращения вытекания образца в каналы коллектора перед электропорацией. Данные клапаны (210) могут быть открыты при приведении в действие док-станцией или «гнездом» (1000). Непосредственно под впускным отверстием (110) и выпускным отверстием (115) и фитингами (1504) находятся диафрагменные насосы (225А, 225В). Двигатели в док-станции или «гнезде» (1000) могут перекачивать жидкость с помощью запорных клапанов, встроенных в блок насосов (т.е. находящихся внутри). Такая конфигурация системы гарантирует, что культуральная жидкость течет только в одном направлении через камеры, каналы и попадает в выпускной мешок (1810) для культивированных клеток. Диафрагменные насосы (225А, 225В) также могут действовать как клапаны в закрытом состоянии.

[0090] Для электропорации пользователь может асептически перенести смесь клеток/нуклеиновой кислоты в камеры (205) картриджа и закрыть картридж, находясь в боксе биологической безопасности. Клапаны (210) в картридже могут оставаться закрытыми до тех пор, пока они не будут открыты приводами в гнезде. Каждая камера (205) может быть подвергнута электропорации, а затем опорожнена (путем открытия клапана (210) и приведения в действие диафрагменных насосов (225А, 225В)) до тех пор, пока среда не попадет в выпускной мешок (1810) для культивированных клеток. Данный процесс можно повторять до тех пор, пока все камеры (205) не пройдут процедуру электропорации и не будут опорожнены путем перекачивания среды в выпускной мешок (1810) для культивированных клеток. После электропорации восстановленная среда для культивирования клеток из мешка (1805) для поступающей среды может быть перекачана через картридж для промывания камер (205) и проточных каналов (215, 220А, 220В) картриджа. После завершения процедуры промывания выпускной мешок (1810) для культивированных клеток может быть асептически отсоединен от картриджа путем термосваривания выпускного стерильного шланга (1820) и помещен в инкубатор для клеточных культур.

[0091] Таким образом, устройство (100) для электропорации, описанное в настоящей заявке, представляет собой значительно усовершенствованное устройство для крупномасштабной электропорации клеток (например, иммунных клеток/Т-клеток) и для производства генетически модифицированных клеточных продуктов. Картридж для электропорации обеспечивает возможность электропорации большого количества клеток с минимальными ручными манипуляциями (т.е. в значительной степени автоматизированным способом), в закрытой системе и за короткие промежутки времени, тем самым значительно снижая вероятность микробного загрязнения и улучшая консистенцию клеточного продукта.

[0092] Варианты реализации и примеры, изложенные в настоящей заявке, были представлены для того, чтобы наилучшим образом объяснить различные варианты реализации и их частное (частные) применение (применения) и тем самым дать возможность специалистам в данной области техники создавать и применять разные варианты реализации. Однако специалисты в данной области техники поймут, что вышеприведенное описание и примеры были представлены только в целях иллюстрации и примера. Изложенное описание не претендует на то, чтобы быть исчерпывающим и никоим образом не ограничивает заявленный объем притязаний.

[0093] Несмотря на то, что было описано множество вариантов реализации, специалисты в данной области техники, ознакомившись с данным описанием, поймут, что могут быть разработаны другие варианты реализации, не выходящие за рамки объема. Соответственно, объем изобретения должен быть ограничен только прилагаемой формулой изобретения.

Группа изобретений относится к устройству для электропорации и способу электропорации. Док-станция для электропорации содержит держатель, выполненный с возможностью закрепления в прямостоящем положении устройства для электропорации, электрические контакты, выполненные с возможностью выравнивания с электродами, когда устройство для электропорации закреплено в держателе, и приводы клапанов, выполненные с возможностью взаимодействия с клапанами камер, когда устройство для электропорации закреплено в держателе. Устройство для электропорации содержит по меньшей мере две камеры, электроды, выполненные с возможностью генерирования электрического поля во время процесса электропорации, проточный канал и клапаны камер, каждый из которых соединяет камеру с проточным каналом. Способ электропорации включает закрепление устройства для электропорации в держателе док-станции и генерирование электрического поля с применением электрических контактов док-станции для электропорации. Группа изобретений обеспечивает возможность проведения электропорации большого количества клеток с минимальными ручными манипуляциями в закрытой системе и за короткие промежутки времени, тем самым значительно снижая вероятность микробного загрязнения и улучшая консистенцию клеточного продукта. 2 н. и 17 з.п. ф-лы, 19 ил.

1. Док-станция для электропорации, содержащая:

(a) держатель, выполненный с возможностью закрепления в прямостоящем положении устройства для электропорации, содержащего: (i) по меньшей мере две камеры; (ii) электроды, выполненные с возможностью генерирования электрического поля во время процесса электропорации; (iii) проточный канал и (iv) клапаны камер, каждый из которых соединяет камеру с проточным каналом;

(b) электрические контакты, выполненные с возможностью выравнивания с электродами, когда устройство для электропорации закреплено в держателе; и

(c) приводы клапанов, выполненные с возможностью взаимодействия с клапанами камер, когда устройство для электропорации закреплено в держателе.

2. Док-станция для электропорации по п. 1, дополнительно содержащая привод насоса, выполненный с возможностью взаимодействия с насосом устройства для электропорации, когда устройство для электропорации закреплено в держателе.

3. Док-станция для электропорации по п. 2, дополнительно содержащая электрическую цепь, генерирующую электрическое поле с применением указанных электрических контактов.

4. Док-станция для электропорации по п. 1, дополнительно содержащая:

(d) контейнер, который соединен с впускным отверстием устройства для электропорации, когда устройство для электропорации закреплено в держателе; и

(e) контейнер, который соединен с выпускным отверстием устройства для электропорации, когда указанное устройство закреплено в держателе.

5. Док-станция для электропорации по п. 1, в которой держатель имеет отверстие, а электрические контакты выровнены линейно вдоль длины держателя.

6. Док-станция для электропорации по п. 1, в которой электрические контакты расположены на противоположных сторонах держателя.

7. Док-станция для электропорации по п. 1, в которой каждый клапан камеры представляет собой клапан пружинного типа, а каждый привод клапана выполнен с возможностью открытия клапана камеры путем приложения усилия к клапану камеры.

8. Док-станция для электропорации по п. 7, в которой приводы клапанов выполнены с возможностью одновременного открытия клапанов камер.

9. Док-станция для электропорации по п. 7, в которой приводы клапанов выполнены с возможностью открытия каждого клапана камеры по одному за раз.

10. Способ электропорации, включающий:

(a) закрепление устройства для электропорации в держателе док-станции для электропорации по п. 1; и

(b) генерирование электрического поля с применением электрических контактов док-станции для электропорации.

11. Способ по п. 10, дополнительно включающий выполнение процесса сбора клеток посредством управления работой одного или более приводов клапанов док-станции для электропорации.

12. Способ по п. 10, согласно которому док-станция для электропорации содержит привод насоса, выполненный с возможностью взаимодействия с насосом устройства для электропорации, когда устройство для электропорации закреплено в держателе, причем способ дополнительно включает управление работой привода насоса во время процесса сбора клеток для перекачивания жидкой среды в клапаны камер.

13. Способ по п. 10, согласно которому клапаны камер открывают по одному за раз.

14. Способ по п. 11, согласно которому выполнение процесса сбора клеток дополнительно включает: перекачивание по меньшей мере одним насосом устройства для электропорации жидкой среды из проточного канала по меньшей мере в одну камеру, причем жидкая среда поступает во впускное отверстие, и при этом впускное отверстие и выпускное отверстие соединены с проточным каналом посредством боковых проточных каналов внутри устройства для электропорации.

15. Способ по п. 11, согласно которому выполнение процесса сбора клеток дополнительно включает: дренирование камер в проточный канал, причем давление внутри камер поддерживают посредством вентиляционного отверстия или воздушного фильтра, соединенного с каналом воздушного потока, проходящим между камерами.

16. Способ по п. 10, дополнительно включающий: размещение клеток в отверстиях устройства для электропорации, ведущих к камерам, прикладывание уплотнения к отверстиям и соединение электродов по меньшей мере с одной цепью путем вставки устройства для электропорации в док-станцию.

17. Способ по п. 10, согласно которому электроды включают в себя пару электродов, расположенных на противоположных сторонах камеры, и каждый электрод из пары электродов содержит внутреннюю часть, находящуюся внутри камеры, и наружную часть, находящуюся снаружи камеры.

18. Способ по п. 10, согласно которому каждый клапан функционирует с применением движения пружины, движения рычага и/или движения поршня.

19. Способ по п. 10, согласно которому электропорации подвергают по меньшей мере 1×10⁸ клеток.