Способ прогнозирования риска развития рака предстательной железы Российский патент 2024 года по МПК C12Q1/68 

Изобретение относится к медицине, а именно к молекулярно-генетической диагностике в онкологии и может быть использовано для прогнозирования риска развития рака предстательной железы.

Рак предстательной железы (РПЖ) представляет собой злокачественное новообразование эпителиального происхождения [Miller G.J., Cygan J.M. Morphology of prostate cancer: the effects of multifocality on histological grade, tumor volume and capsule penetration. J Urol. 1994 Nov; 152(5 Pt 2): 1709-1713] РПЖ является вторым по частоте злокачественным новообразованием (после рака легких) у мужчин во всем мире, насчитывая 1 276 106 новых случаев и став причиной 358 989 смертей (3,8% всех смертей, вызванных раком у мужчин) в 2018 году, при этом имеется стабильная тенденция к росту заболеваемости и смертности [Bray F., Ferlay J., Soerjomataram I., Siegel R.L., Torre L.A., Jemal A. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin. 2018; 68(6) : 394-424; Ferlay J E.M., Lam F., Colombet M., Mery L., Pineros M., Znaor A., Soerjomataram I. et al. Global cancer observatory: cancer today. Lyon, France: International Agency for Research on Cancer. Available from: https://gco.iarc.fr/today, Accessed 02 February 2019].

Первые места в структуре заболеваемости злокачественными новообразованиями мужского населения России распределены следующим образом: опухоли трахеи, бронхов, легкого (16,4%), предстательной железы (15,1%). Четверть (25,0%) случаев смерти мужчин обусловлены раком трахеи, бронхов, легкого, далее следуют опухоли желудка (10,1%), предстательной железы (8,6%) [Злокачественные новообразования в России в 2021 году (заболеваемость и смертность). Под ред. А.Д. Каприна, В.В. Старинского, Г.В. Петровой. М.: МНИОИ им. П.А. Герцена – филиал ФГБУ «НМИЦ радиологии» Минздрава России, 2022. 252 с.].

Диагностике и лечению данной патологии в последнее время уделяется все больше внимания как в России, так и за рубежом [Каприн А.Д., Алексеев Б.Я., Матвеев В.Б. и др. Рак предстательной железы. Клинические рекомендации. Современная онкология 2021; 23(2): 211-247]. Этиология РПЖ многофакторна, при этом факторы риска включают пожилой возраст, положительный семейный анамнез и этническое происхождение [Sung H., Ferlay J., Siegel R.L., Laversanne M., Soerjomataram I., Jemal A., Bray F. Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J. Clin. 2021;71: 209-249]. Выявление факторов риска РПЖ имеет решающее значение для разработки новых технологий его диагностики и лечения.

Данные проведенных эпидемиологических исследований свидетельствуют о том, что ведущее значение среди факторов риска РПЖ занимает наследственность. Так, исследование близнецов показало, что 57 % больных РПЖ имеют семейную связь [Mucci L.A., Hjelmborg J.B., Harris J.R., Czene K., Havelick D.J., Scheike T., Graff R.E., Holst K., Möller S., Unger R.H. et al. Familial risk and heritability of cancer among twins in nordic countries. JAMA J. Am. Med. Assoc. 2016; 315: 68-76]. Недавние исследования показывают, что более 100 хорошо известных однонуклеотидных полиморфизмов SNP оказались связаны с РПЖ и представляют собой основной фактор риска развития РПЖ [Allemailem K.S., Almatroudi A., Alrumaihi F., Almansour N.M., Aldakheel F.M., Rather R.A., Afroze D., Rah B. Single nucleotide polymorphisms (SNPs) in prostate cancer: Its implications in diagnostics and therapeutics. Am. J. Transl. Res. 2021; 13: 3868-3889].

Ядерный фактор гепатоцитов 1 бета (HNF1B) – тканеспецифичный транскрипционный фактор, который играет важную роль в канцерогенезе ряда опухолей [Dundr P., Bártů M., Hojný J., Michálková R., Hájková N., Stružinská I., Krkavcová E., Hadravský L., Kleissnerová L., Kopejsková J., Hiep B.Q., Němejcová K., Jakša R., Čapoun O., Řezáč J., Jirsová K., Franková V. HNF1B, EZH2 and ECI2 in prostate carcinoma. Molecular, immunohistochemical and clinico-pathological study. Sci Rep. 2020 Sep 1; 10(1): 14365]. В исследовании Hu Y.L. и соавторов было установлено, что роль HNF1В в риске развития РПЖ может быть связана с андрогенным гормоном [Hu Y.L., Zhong D., Pang F., Ning Q.Y., Zhang Y.Y., Li G., Wu J.Z., Mo Z.N. HNF1b is involved in prostate cancer risk via modulating androgenic hormone effects and coordination with other genes. Genet. Mol. Res. 2013 Apr 25; 12(2): 1327-1335].

В исследовании Vieira G.M. и соавторов были сопоставлены эпидемиологические данные, заболеваемость и смертность от РПЖ с SNP, связанными с предрасположенностью и тяжестью этого новообразования, в различных популяциях [Vieira G.M., Gellen L.P.A., da Veiga Borges Leal D.F., Pastana L.F., Vinagre L.W.M.S., Aquino V.T., Fernandes M.R., de Assumpção P.P., Burbano R.M.R., Dos Santos S.E.B., Dos Santos N.P.C. Correlation between Genomic Variants and Worldwide Epidemiology of Prostate Cancer. Genes (Basel). 2022 Jun 10; 13(6): 1039]. Восемьдесят четыре SNP, связанных с предрасположенностью к РПЖ, были отобраны с помощью геномных ассоциативных исследований GWAS. Частоты аллелей получены из проекта 1000 геномов, а эпидемиологические данные – из Surveillance, Epidemiology, and End Results SEER. Заболеваемость РПЖ, уровень смертности и частоты аллелей вариантов оценивались с помощью корреляции Пирсона. Исследование показало, что 12 SNP (rs2961144, rs1048169, rs7000448, rs4430796, rs2066827, rs12500426, rs6983267, rs11649743, rs2075110, rs114798100, rs855723 и rs2075109) коррелировали с эпидемиологическими данными в различных этнических группах. Десять SNP (rs2961144, rs1048169, rs7000448, rs4430796, rs2066827, rs12500426, rs11649743, rs2075110, rs114798100 и rs2075109) положительно коррелировали с уровнем смертности. Семь SNP (rs1048169, rs2961144, rs7000448, rs4430796, rs2066827, rs12500426 и rs114798100) положительно коррелировали с РПЖ.

В исследовании Zheng L. и соавторов, включавшем более 3600 европеоидов с РПЖ, следующие SNP rs4430796, rs1859962, rs1447295, использовали для суммарного прогнозирования общего риска развития РПЖ. Установлено, что сам по себе генотип риска rs4430796 (A;A) – в ориентации dbSNP дает отношение шансов развития РПЖ 1,38 (CI: 1,21-1,57, p=1,6x10e-6) и может составлять 10,2% от популяционного риска. Генотип риска rs1859962 (G;G) дает отношение шансов развития РПЖ 1,28 (ДИ: 1,11-1,47, p=5,5x10e-4) и может составлять 6,5% от популяционного риска. Генотипы rs1447295 (A;A) и (A;C) дают отношение шансов развития РПЖ 1,22 (CI: 1,06-1,40, p=5,3x10-3) и могут составлять 5,4% популяционного риска. Генотипы риска rs6983267 (G;G) и (G; T) дают отношение шансов развития РПЖ 1,37 (CI: 1,18-1,59, p=3,4-10e-5) и могут быть причиной 22,2% популяционного риска [Lilly Zheng, Jielin Sun, Fredrik Wiklund et al. Cumulative Association of Five Genetic Variants with Prostate Cancer. N Engl J Med 2008; 358: 910-919].

В исследовании Yeager M. и соавторов обнаружено, что определенные SNP на хромосоме 8q24 человека связаны с риском развития РПЖ. Авторами показано, что повышенный риск развития РПЖ, связанный с SNP rs6983267, однако не зависит от риска, связанного с его близким соседом, SNP rs1447295. Отношение шансов для гетерозигот оценивается в 1,26 (CI: 1,13 - 1,41), а для гомозигот – в 1,58 (CI: 1,40 - 1,78), по сравнению с гомозиготным генотипом rs6983267 (T; T). Наличие rs1447295 может быть ответственно примерно за 7% случаев РПЖ у белых мужчин североевропейского происхождения. Таким образом, в совокупности с rs6983267 эти два SNP могут быть причиной четверти случаев РПЖ у белых мужчин. Повышенный риск, обусловленный этими локусами, наблюдался во всех исследованных возрастных группах [Yeager M., Orr N., Hayes R.B. et al. Genome-wide association study of prostate cancer identifies a second risk locus at 8q24. Nat Genet. 2007 May; 39(5): 645-649].

В исследовании Kim H.J. и соавторы оценивали ассоциацию 47 SNP в гене HNF1B с риском развития РПЖ и клиническими характеристиками (балл Глисона и стадия опухоли) у корейских мужчин (240 больных и 223 контрольных) с помощью логистического регрессионного анализа [Kim H.J., Bae J.S., Lee J., Chang I.H., Kim K.D., Shin H.D., Han J.H., Lee S.Y., Kim W., Myung S.C. HNF1B polymorphism associated with development of prostate cancer in Korean patients. Urology. 2011 Oct; 78(4): 969.e1-6]. Установлено, что два SNP (rs4430796 и rs2074429) и один гаплотип (Block3_ht1) чаще встречались у пациентов с оценкой по Глисону ≥7, чем у пациентов с оценкой по Глисону <6.

В исследовании Tong Y. и соавторов [Tong Y., Qu Y., Li S. et al. Cumulative evidence for relationships between multiple variants of HNF1B and the risk of prostate and endometrial cancers. BMC Med Genet 19, 128 (2018). https://doi.org/10.1186/s12881-018-0640-7] значимые взаимосвязи были обнаружены между SNP rs4430796 A и риском РПЖ (OR = 1,247, p = 2,21 × 10- 77); генотипы AA, AG также показали сильные значимые ассоциации с риском развития РПЖ (OR1 = 1,517, p = 4,46 × 10- 22; OR2 = 1,180, p = 0,002).

Мета-анализ, проведенный Ren F. и соавторами по восьми исследованиям, включавшим 7863 случая больных РПЖ и 17122 человек в контрольных группах, показал, что существует значимая кумулятивная ассоциация между SNP 17q24 rs1859962 и РПЖ во всех изученных генетических моделях [Ren F., Zhang P., Ma Z., Zhang L., Li G., Huang X., Chang D., Yu X. Association of 17q24 rs1859962 gene polymorphism with prostate cancer risk: A systematic review and meta-analysis. Medicine (Baltimore). 2020 Jan; 99(3): e18398].

В исследовании Osman A.E. и соавторов изучали наличие SNP rs16901979A, rs629242T и rs1447295A у пациентов с РПЖ из Саудовской Аравии (n=85) и сравнили результаты со здоровыми людьми (n=115) и пациентами с нодулярной гиперплазией простаты (n=120). ДНК выделяли из парафинированных тканей, фиксированных формалином, или цельной крови из обеих групп пациентов и здорового контроля. Было установлено, что аллели rs16901979A, rs629242T и rs1447295A встречались с достоверно более высокой частотой у больных РПЖ по сравнению с контрольной группой [Awad Elsid Osman, Sahar Alharbi, Atif Ali Ahmed, Asim Ali Elbagir, Single nucleotide polymorphism within chromosome 8q24 is associated with prostate cancer development in Saudi Arabia // Asian Journal of Urology, 2022, https://doi.org/10.1016/j.ajur.2022.03.012Ошибка! Недопустимый объект гиперссылки.

Известен способ детекции биомаркеров в микровезикулах мочи для диагностики, прогнозирования, проведения мониторинга или выбора терапии при РПЖ или другом расстройстве предстательной железы [патент RU №2668164]. Способ основан на детекции уровня экспрессии мРНК PCA3 и ERG в экстракте из образца мочи и его сравнении по заранее определенной формуле.

Недостатком данного способа является трудоемкость выполнения и, кроме того, в нем не учитывается роль генетических полиморфизмов, позволяющих прогнозировать риск развития РПЖ.

Известен способ прогнозирования степени злокачественности РПЖ [патент RU №252122], включающий биохимическое исследование сыворотки крови пациента. Определяют уровень матрилизина и растворимого Fas-антигена (sFas): если сумма их концентраций до 7,0 нг/мл, судят о незлокачественном процессе, если сумма концентраций от 7,0 до 12,0 нг/мл судят об умеренной степени злокачественности, если сумма концентраций выше 12,0 нг/мл судят о высокой степени злокачественности. Изобретение позволяет прогнозировать степень злокачественности РПЖ на основе комплексной оценки серологических факторов риска, коррелирующих с морфологической картиной по шкале Глиссона.

Недостатком данного способа служит то, что изобретение направлено на определение степени злокачественности новообразования у пациентов с ранее установленным диагнозом РПЖ и не позволяет установить вероятность развития РПЖ. Кроме того, при использовании способа не учитывается роль генетических полиморфизмов. позволяющих прогнозировать риск развития РПЖ.

Известен способ диагностики РПЖ [WO 2014140594 А1; Kristiansen G. Diagnostic and prognostic molecular biomarkers for prostate cancer // Histopathology. 2012. 60, 125-141], начиная с ранних стадий до распространенных процессов, по уровню экспрессии одного или всех трех генов или кодируемых ими белков – VPS13A, VPS28 и NAALADL2 в плазме или сыворотке крови. В заявленном способе объектом исследования являются гены и кодируемые ими белки. В данном методе сравнивают уровни их экспрессии в сыворотке крови обследуемого пациента и в сыворотке крови здорового человека.Если уровень экспрессии одного или всех трех генов выше, то диагностируется рак.

Недостатком данного способа служит то, что в данном изобретении отсутствует количественная оценка значений показателей экспрессии, авторы только заявляют, что чем выше уровень экспрессии генов, тем более распространен опухолевый процесс.

Известен также способ диагностики РПЖ [патент RU №2348042], который включает сочетанное определение активности сериновой протеиназы-хепсина и метилированного гена глютатион-S-трансферазы класса PI (GSTP1) в опухолевых клетках, обнаруживаемых в моче пациентов. При значении активности хепсина выше, чем 42% по отношению к контролю, и выявлении метилированного гена GSTP1 диагностируют онкологическое заболевание.

Недостатком данного способа служит то, что он может применяться только для диагностики новообразований, но не для прогнозирования риска их развития.

Известен также способ прогнозирования РПЖ [патент RU №2721916], включающий определение экспрессии сигнатурных генов для диагностики РПЖ, для определения прогноза и предрасположенности к развитию заболевания. Данный способ основан на определении уровня экспрессии для следующих генов: AZGP1, FBLN1, ILK, KRT15, MEIS2, MYBPC1, PAGE4, SRD5A2, COL1A1, COL3A1, COL5A2, INHBA, THBS2, VCAN, BGN, BIRC5, DYRK2 и изоформ PDE4: PDE4D5 и/ил PDE4D7, для получения профиля экспрессии и классификации субъекта как имеющего благоприятный или неблагоприятный прогноз по РПЖ на основе профиля экспрессии, при котором благоприятный прогноз предполагает повышенную вероятность выживаемости в течение предопределенного периода после постановки первоначального диагноза и/или отсутствии прогрессирования заболевания после первоначального лечения, неблагоприятный прогноз предполагает агрессивное заболевание, пониженную вероятность выживаемости, повышенную вероятность биохимического рецидива, клинического рецидива и/или наличия локальных или отдаленных метастазов в течение предопределенного периода времени после постановки первоначального диагноза.

Недостатком данного способа служит его высокая стоимость и то, что определение уровня экспрессии генов необходимо проводить непосредственно в биопсийном материале предстательной железы, что усложняет процедуру исследования в связи с ее травматичностью, многоэтапностью и т.д. Определение экспрессии всех перечисленных генов в венозной крови или в моче зачастую не дает оптимального результаты и может привести к искажению данных в связи, например, с отсутствием РНК в венозной крови или моче.

Известен способ прогнозирования агрессивных форм РПЖ у больных группы промежуточного и высокого риска [патент RU №2768477]. Сущность способа состоит в исследовании биопсийных или послеоперационных образцов опухоли методом мультиплексного анализа лигированных проб для выявления делеций генов PTEN и RB1. При обнаружении делеций гена PTEN прогнозируют периневральную инвазию и поражение лимфатических узлов. При обнаружении делеций гена RB1 прогнозируют низкую дифференцировку опухоли, наличие крибриформного компонента роста, инвазию в перипростатическую клетчатку и поражение лимфатических узлов.

Недостатком данного способа служит то, что изобретение направлено на пациентов с ранее установленным диагнозом РПЖ и предназначено для прогноза течения заболевания, но не для оценки риска его развития. Кроме того, данный способ подразумевает удаление опухоли или проведение биопсии предстательной железы, что усложняет процедуру в связи с ее травматичностью, многоэтапностью и т.д.

Известны также способы определения РПЖ и риска его развития, основанные на анализе отдельных однонуклеотидных полиморфизмов – SNP, ассоциированных с формированием РПЖ: rs1048169, rs2961144, rs7000448, rs4430796, rs2066827, rs12500426 и rs114798100 [Vieira G.M., Gellen L.P.A., da Veiga Borges Leal D.F., Pastana L.F., Vinagre L.W.M.S., Aquino V.T., Fernandes M.R., de Assumpção P.P., Burbano R.M.R., Dos Santos S.E.B., Dos Santos N.P.C. Correlation between Genomic Variants and Worldwide Epidemiology of Prostate Cancer. Genes (Basel). 2022 Jun 10; 13(6): 1039]; rs4430796, rs1859962, rs1447295 [Lilly Zheng, Jielin Sun, Fredrik Wiklund et al. Cumulative Association of Five Genetic Variants with Prostate Cancer. N Engl J Med 2008; 358: 910-919]; rs6983267, rs1447295 [Yeager M., Orr N., Hayes R.B. et al. Genome-wide association study of prostate cancer identifies a second risk locus at 8q24. Nat Genet. 2007 May; 39(5): 645-649]; rs4430796 и rs2074429 [Kim H.J., Bae J.S., Lee J., Chang I.H., Kim K.D., Shin H.D., Han J.H., Lee S.Y., Kim W., Myung S.C. HNF1B polymorphism associated with development of prostate cancer in Korean patients. Urology. 2011 Oct; 78(4): 969.e1-6]; rs1859962 [Ren F., Zhang P., Ma Z., Zhang L., Li G., Huang X., Chang D., Yu X. Association of 17q24 rs1859962 gene polymorphism with prostate cancer risk: A systematic review and meta-analysis. Medicine (Baltimore). 2020 Jan; 99(3): e18398]; SNP rs16901979A, rs629242T и rs1447295A [Awad Elsid Osman, Sahar Alharbi, Atif Ali Ahmed, Asim Ali Elbagir. Single nucleotide polymorphism within chromosome 8q24 is associated with prostate cancer development in Saudi Arabia // Asian Journal of Urology, 2022, https://doi.org/10.1016/j.ajur.2022.03.012]. Способы выявления перечисленных SNP, ассоциированных с РПЖ, основаны на выделении ДНК из венозной крови пациента, малоинвазивны и не требуют дополнительной биопсии ткани предстательной железы. Недостатками данных способов является то, что в перечисленных выше работах использован либо чрезвычайно дорогостоящий метод полногеномного секвенирования, в связи с чем он будет недоступен большинству пациентов, либо анализ генотипических сочетаний аллелей соответствующих генов, в которых зарегистрированы SNP. В последнем случае информативность метода будет достаточно низкой.

Единый подход к выбору типа оценочного параметра позволяет принять за наиболее близкий аналог любой из описанных в последнем абзаце способов определения РПЖ.

Задачей заявляемого изобретения является разработка информативного диагностического способа, позволяющего на основе анализа одновременно четырех однонуклеотидных полиморфизмов выделить пациентов с повышенным риском развития рака предстательной железы.

Сущность заявляемого способа прогнозирования риска развития рака предстательной железы характеризуется тем, что из периферической венозной крови выделяют дезоксирибонуклеиновую кислотау ДНК, проводят анализ однонуклеотидных полиморфизмов SNP: rs4430796 гена HNF1B C>T, rs1859962 гена CASC17 A>C, rs1447295 гена CASC8 G>T, rs6983267 CCAT2 G>T и определяют геномную комбинацию по сочетанию аллелей перечисленных генов, при выявлении геномных комбинаций аллелей данных генов: TT CC GG G/T; TT CC G/T TT; TT AA GG G/T; TT AA G/T G/T; TT AA G/T GG; TT AA G/T TT; TT А/C GG G/T; CC CC G/T G/T; CC AA GG GG; CC CC GG GG; CC CC GG TT; CC AA GG G/T прогнозируют высокий риск развития рака предстательной железы.

Такой технический прием как применение в качестве предикторов развития рака предстательной железы геномной комбинации однонуклеотидных полиморфизмов генов HNF1B, CASC17, CASC8, CCAT2, которые возможно определить посредством ПЦР одновременно при единичном взятии образца венозной крови, позволит на доклиническом этапе выявить риск развития РПЖ и своевременно реализовать необходимые лечебно-профилактические мероприятия.

Заявляемое изобретение поясняется с помощью Фиг. 1-5, на которых изображены:

на Фиг. 1 – Результирующая электрофореграмма выбранных образцов по всем исследуемым генам HNF1B, CASC17, CASC8, CCAT2, CASC11;

на Фиг. 2 – Электрофореграмма рестрицированных ампликонов фрагмента гена HNF1B (rs4430796);

на Фиг. 3 – Электрофореграмма рестрицированных ампликонов фрагмента гена CASC17 (rs1859962);

на Фиг. 4 – Электрофореграмма рестрицированных ампликонов фрагмента гена CASC8 (rs1447295);

на Фиг. 5 – Электрофореграмма рестрицированных ампликонов фрагмента гена CCAT2 (rs6983267).

На Фиг. 1-5 были использованы следующие сокращения:

М – маркеры длин,

А – ПЦР-продукты до обработки рестриктазами,

Пр - наличие предковой аллели,

М - мутантной аллели, Г - гетерозиготы.

Длина специфических полос рестрикции обозначена соответствующими цифровыми значениями. Пустые дорожки обозначены (-).

Способ прогнозирования риска развития рака предстательной железы заключается в выделении ДНК из венозной крови пациента, постановке ПЦР, детекции ассоциированных с риском развития РПЖ SNP: rs4430796 гена HNF1B (C>T), rs1859962 гена CASC17 (A>C), rs1447295 гена CASC8 (G>T), rs6983267 CCAT2 (G>T) и определении геномной комбинации аллелей перечисленных генов у пациента.

Примеры. Для для детекции мутаций, ассоциированных с риском развития РПЖ: rs6983267, rs1447295, rs1859962, rs4430796 применялись следующие тест-системы:

1. ГЕН - HNF1B

SNP - rs4430796 (https://www.snpedia.com/index.php/Rs4430796)

C>T

Primer_F_HNF1B 5’-TTGTCTCAATGTCCCTGGGC-3’

Primer_R_HNF1B 5’-AACGTCCCTTCCTCAGCATC-3’

CTCTTGTCTTCTGTTACACACTGCTCTGAAGTGATTGTTTCAGTAT

TTATTGTCTCAATGTCCCTGGGCTGGTGAAAGGAATGGTTTTAGG

TGTTCATTTCATATTGTGGTGTTTGTGCTTTTGTTGGGAGCATTAC

ATGAATAGATTGGAAGAAGCAACATGAGAGCTGTTTGCTGCTTA

GAGCGAGAGACCTTTCCAAGAATGGGTTGGCCCCCCATACTTGGT

GACTAGCTCTTTAAGAATTTGTGTTCCTGACATGAAGCAACTCTC

TGTAGTTCCTGGAAAGCCTAAAAAAATTCTCAGGAGCCATTGTCT

CCAAAGACCCAACAACGCTTGGGCCCTGCCCAATTTAAGCTTTAT

GCAGCAT(C<T)TCCAGTCTGTGCTGCCTCTCTGTATTCAATGAGAA

TTTCTTCAGAAAGGAGAAGGAGGCAGGAAAGGCAGACTGGAAAC

TTCTCAAAAGACAGAGGTCCAGAAAGTTTCTCAAGATGCTGAGG

AAGGGACGTTTTACAAATACAACAGCCTCTTCAAGAGATTGTTGT

TATTGTTATTTTTGTTTTATTTATTTATTTATTTA

Рестрикция:

Эндонуклеаза рестрикции – Bpm I

CTGGAG(N)16↑

GACCTC(N)14↓

Предковый аллель С – 148, 305 п.о.

Мутантный аллель T – 453 п.о.

2) ГЕН - CASC17

SNP - rs1859962 (https://www.snpedia.com/index.php/Rs1859962)

A>C

Primer_F_CASC17 5’-TGGCTCACGTATAGGATGCT-3’

Primer_R_CASC17 5’-ACACCTTGGACCAGTTCTTG-3’

GCAATTCTAAATGCTTGGCTCACGTATAGGATGCTGGGCTGCTCC

TCCCAGTGATATTTCATTAATGAGCCCAGTGGGCTAACCCAGATC

GATACATAGGTTCCTACTATCCATCTCTCATCTTCAGGAATAGGC

ATTCCAAAGATGAAGACTCATACAGAGATTAGAATTTGTACAGTT

CCTTGTTACTGGATTTTTTAGCAGAAAAACACATTTTGGGAAATT

TAGCCCCATTATTAGAAATCTTGGGACCTTTAAAGTGTTCATC

(C<A)CACGGGCAGGGATTTGGAAAAGTCTGCAGCCTCTTATTTAT

ATCAAGAACTGGTCCAAGGTGTTCTTTGTGATTTGAATGTTTAAT

GAAATAATTGTTATTTGCCTTCC

Рестрикция:

Эндонуклеаза рестрикции – BstDS I

C↑CRYGG

GGYRC↓C

Фрагменты:

Предковый аллель A – 317 п.о.

Мутантный аллель С – 254, 63 п.о.

3) ГЕН - CASC8

SNP - rs1447295 (https://www.snpedia.com/index.php/Rs1447295)

G>T

Primer_F_CASC8 5’- CTAATGACTTCCCATGCCAG -3’

Primer_R_CASC8 5’ - CATTTGTTGAGTTGCACGCC - 3’

AAAAAAACATCAAATCCCTAAGAATTCCATGTGTCAAAACAAAA

CCAGCACATCTTGATTCATTGCAGTTCTTGTGAAGTCTCTCTTATC

CAGCTAATGACTTCCCATGCCAGGGGAAGCAGCATGAGGAAAAG

TCAACACAACAAATTTTGCAAAGTCTCTGCTCTTACTTAAATTTCT

TTTCCTCCCAGATTTTCCCATACCCCATTCTGAAGAACACAGGCA

GAAATCCCTACCCCCACCAGCATTTTTTTTTCTATCAAGGGGTTCC

TGTTGCTTTTTTTCCATAGCAC(T<G)TTTTACATACCTCCCCAATG

GCACTTCCTCAATTGAAGTCCCATCTCATCATCATCATCATTATTA

TTTTTACATAGAGACAGAACTGTTCATTACCCTTTAGTTGTCCCAT

CATCTAGTATAGTGTCTGGCGTGCAACTCAACAAATGAATGTTTG

CTGAACAACTAAATTATCAGTGGCAGGCAATATGTGTTCTAGAAT

CTTGTAATACTT

Рестрикция:

Эндонуклеаза рестрикции - HpySE526 I

A↑CGT

TGC↓A

Фрагменты:

Предковый аллель G – 201, 149 п.о.

Мутантный аллель Т – 350 п.о.

4) ГЕН – CCAT2

SNP - rs6983267 (https://helix.ru/kb/item/18-024#subj25)

G>T

Primer_F_CCAT2 – 5’-AGCTCCACCTCTGACCAATT-3’

Primar_R_CCAT2 – 5’-ACGAGAACAGTTGTGGGACA-3’

TATTGCATGATTCCACTTCCACAGCCCTCCAGCATTTTTTAGCAGC

TGCATCGCTCCATAGAGCCTGCAGAGGGCACTAGACTGGGAATT

AGAAAACCTGATTTCCCTTCCAGCTCCACCTCTGACCAATTGCCT

GACCCTGGTCAAATTGCTTAACCTCTTCCTATCTCAGCTCCCTATC

CATAAAACAGAGGGACGAATAAACTCTCCTCCTACCACTAAGAG

GTGTAGCCAGAGTTAATACCCTCATCGTCCTTTGAGCTCAGCAGA

TGAAAG(G>T)CACTGAGAAAAGTACAAAGAATTTTTATGTGCTAT

TGACTTTATTTTATTTTATGTGGGGGAGGGAGCCGGCCCCAGCTG

GAAAGCTGCTTTCTCTGAATCAAAGGGCAGGAACCCAGCAAGTTT

CTCAGGATTGGGGCCTTAGACTGGGCTGTGTATACAGACAGTGCC

AGCCAACCCCACAGTTCAGTTTCCTTTAACCTGGTGCTCCAGGCA

ATAACTGTGCAACTCTGCAATTTAACAATGTGTTCTTTGTCCCACA

ACTGTTCTCGTTTCTCAACTGCCCAGGTAATATGTTTGGGCCTGTA

GGAAGAGTCAAATAGTTAATAAGGGAAGGGTTTGGCATGCCCTA

CGTAAGTTCTACCAGCAAGTCCCAACAAGAAGGCATTCTGTGTCT

CCTGATTCCTGACCTA

Рестрикция:

Эндонуклеаза рестрикции - TseF I

↑GTSAC

CASTG↓

Предковый аллель G – 438 п.о.

Мутантный аллель T ¬- 165, 273 п.о.

Идентификация полиморфных вариантов генов HNF1B, CASC17, CASC8, CCAT2, ассоциированных с предрасположенностью с раком предстательной железы осуществляли методом сайт-специфической полимеразной цепной реакции путем оценки распространенности полиморфных вариантов генов HNF1B, CASC17, CASC8, CCAT2, ассоциированных с РПЖ среди пациентов урологического профиля.

Проводили пробоподготовку и хранение биоматериалов. Для этого венозную кровь набирали в вакуумные пробирки с антикоагулянтом (К3-ЭДТА). Далее образцы переносили в 1,5 мл микропробирки по трем аликвотам объемом по 500 мкл и хранили при -20°С (ПОЗИС ХЛ-340, Россия) до момента выделения ДНК.

Далее выделяли общую ДНК из образцов крови колоночным методом с использованием коммерческого набора GeneJET Genomic DNA Purification Kit (#01108225, Thermo, Германия). Процедуру осуществляли в условиях ламинарного бокса БМВ-II (Ламинар-С, Россия), следуя инструкциям производителя. Чистоту и концентрацию препаратов выделенной ДНК (OD260=1 соответствует 50 мкг/мл ДНК) оценивали методом УФ-спектрофотометрии с использованием оптического анализатора NanoDrop OneC (Thermo, США) на длинах волн 230/260/280 нм. Образцы ДНК хранили в 1,5 мл микропробирках при -20°С и использовали в качестве ДНК-матрицы до момента выделения ДНК.

ПЦР-амплификацию фрагментов генов HNF1B, CASC17, CASC8, CCAT2, CASC11 проводили в 200 мкл тонкостенных стрип-пробирках (Scientific Specialties, Inc., США) в термоциклере SimpliAmp (ABI, США), объем единичной реакционной смеси составлял 20 мкл. Состав амплификационной смеси (#KH016-002-21, Диа-м, Россия), режимы термоциклирования, последовательности синтетических олигонуклеотидных праймеров (Евроген, Москва), используемых для амплификации, приведены в приложении А, в таблицах А.1 и А.2.

Полученные ПЦР-продукты подвергали обработке специфическими эндонуклеазами рестрикции (Сибэнзим, Россия), приложение А, таблица А.3. Реакцию проводили в стандартных условиях, следуя рекомендациям производителя, объем единичной реакционной смеси составлял 50 мкл, длительность инкубации 5 ч.

Продукты амплификации и рестрицированные фрагменты визуализировали методом горизонтального агарозного гель-электрофореза с использованием интеркалирующего красителя бромистого этидия (Хеликон, Россия). Процедуру проводили с использованием системы для горизонтального гель-электрофореза Blue Marine 200 Cx (Serva, Германия), подключенной к источнику постоянного тока 310 Marine Power Supply (Serva, Германия). В каждую лунку вносили по 10 мкл смеси исследуемых образцов с буфером для внесения, в качестве маркеров длин использовали фрагменты 100 – 3000 п.н. GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder (#01123772, Thermo Fisher Scientific). Разделение фрагментов проводили в 2% агарозном геле (агароза Е, низкий ЕЕО, #D00391, Диа-М, Россия), приготовленном на 1хТВЕ буфере (#2308707, Invitrogen, Великобритания), при следующих условиях: напряжение 90 В, мощность 20 Вт, сила тока 55 мА, длительность 220 мин. Захват изображений осуществляли с использованием гель-документирующей системы BlueCube-300 (Serva, Германия).

Результаты валидации разработанного протокола сайт-специфической ПЦР в варианте электрофоретической регистрации результатов изображены на фигуре 1. Образцами, вносимыми в гель, служили амплифицированные фрагменты исследуемых генов HNF1B, CASC17, CASC8, CCAT2 до и после обработки специфическими рестриктазами. Качественная идентификация характерных полос на электрофореграмме, соответствующая искомым продуктам, была удовлетворительной для генов HNF1B, CASC17, CASC8, CCAT2.

Ниже приведены валидные результаты ПЦР-анализа от поступивших клинических образцов 32 пациентов.

Наличие мононуклеотидных полиморфизмов в интересующем фрагменте гена HNF1B (rs4430796) были выявлены (Фиг. 2): мутантное (453 п.н.) и гетерозиготное состояние (453, 305 и 148 п.н.).

Наличие мононуклеотидных полиморфизмов в интересующем фрагменте гена CASC17 (rs1859962) были выявлены (Фиг. 3): предковое состояние (317 п.н.), мутантное (63, 254 п.н.) и гетерозиготное (63, 254, 317 п.н.).

Наличие мононуклеотидных полиморфизмов в интересующем фрагменте гена CASC8 (rs1447295) были выявлены (Фиг. 4): предковое состояние (149 и 201 п.н.) и гетерозиготное (350, 201 и 149 п.н.).

Наличие мононуклеотидных полиморфизмов в интересующем фрагменте гена CCAT2 (rs6983267) были выявлены (Фиг. 5) предковое состояние (438 п.н.), мутантное (165, 273 п.н.) и гетерозиготное (438, 273, 165 п.н.).

Возможность использования предложенного способа для прогнозирования риска развития РПЖ c использованием молекулярно-генетических данных подтверждает анализ результатов наблюдений 39 пациентов, из них 29 пациентов с раком предстательной железы, 5 пациентов с доброкачественной гиперплазией предстательной железы и 5 пациентов с мочекаменной болезнью и отсутствием новообразований. Средний возраст больных составил 67±12 лет. Возрастные характеристики всех пациентов были сопоставимы.

Критерии включения являлись:

пациенты русской национальности, не имеющие родства между собой, добровольно согласившиеся на проведение исследования;

пациенты только с установленными диагнозами: доброкачественная гиперплазия предстательной железы, рак предстательной железы, мочекаменная болезнь, подтвержденными с помощью клинических и лабораторно-инструментальных (в т.ч. морфологических) методов обследования.

Обследование пациентов проводилось на базе клиники урологии СГМУ им. В.И. Разумовского с января 2021 по апрель 2023 г. Все пациенты подписали информированное согласие на участие в исследовании, проведение исследования было согласовано с этическим комитетом СГМУ им. В.И. Разумовского. Далее образцы крови пациентов направлялись на молекулярно-генетическое исследования без указания информации о диагнозе. Типирование молекулярно-генетических маркеров осуществлялось в лаборатории клеточных технологий центра коллективного пользования экспериментальной онкологии и научно-производственного и образовательного центра молекулярно-генетических и клеточных технологий. Из периферической венозной крови выделяли ДНК, проводили анализ SNP (однонуклеотидных полиморфизмов): rs4430796 гена HNF1B (C>T), rs1859962 гена CASC17 (A>C), rs1447295 гена CASC8 (G>T), rs6983267 CCAT2 (G>T). При выявлении геномных комбинаций аллелей данных генов: TT CC GG G/T; TT CC G/T TT; TT AA GG G/T; TT AA G/T G/T; TT AA G/T GG; TT AA G/T TT; TT А/C GG G/T; CC CC G/T G/T; CC AA GG GG; CC CC GG GG; CC CC GG TT; CC AA GG G/T прогнозировали риск развития РПЖ. Сопоставление результатов молекулярно-генетического анализа с клинико-диагностическими данными позволило установить наличие корреляционной зависимости.

В качестве примеров конкретного применения разработанного способа ниже приведены результаты обследования пациентов, не являющихся родственниками между собой: им было проведено генетическое исследование по анализу SNP (однонуклеотидных полиморфизмов): rs4430796 гена HNF1B (C>T), rs1859962 гена CASC17 (A>C), rs1447295 гена CASC8 (G>T), rs6983267 CCAT2 (G>T).

У пациента П. была взята венозная кровь, при генотипировании ДНК-маркеров определена геномная комбинация TT CC GG G/T полиморфных локусов rs4430796 гена HNF1B (C>T), rs1859962 гена CASC17 (A>C), rs1447295 гена CASC8 (G>T), rs6983267 CCAT2 (G>T), что позволило на основе использования молекулярно-генетических данных отнести мужчину в группу пациентов с повышенным риском развития РПЖ. При клиническом обследовании был установлен диагноз: РПЖ Т2NxM0.

У пациента Б. была взята венозная кровь, при генотипировании ДНК-маркеров определена геномная комбинация TT AA GG G/T полиморфных локусов rs4430796 гена HNF1B (C>T), rs1859962 гена CASC17 (A>C), rs1447295 гена CASC8 (G>T), rs6983267 CCAT2 (G>T), что позволило на основе использования молекулярно-генетических данных отнести мужчину к группе пациентов с повышенным риском развития РПЖ. При клиническом обследовании был установлен диагноз: РПЖ Т2NxM0.

У пациента Г. была взята венозная кровь, при генотипировании ДНК-маркеров определена геномная комбинация TT AA G/T G/T полиморфных локусов rs4430796 гена HNF1B (C>T), rs1859962 гена CASC17 (A>C), rs1447295 гена CASC8 (G>T), rs6983267 CCAT2 (G>T), что позволило на основе использования молекулярно-генетических данных отнести мужчину к группе пациентов с повышенным риском развития РПЖ. При клиническом обследовании был установлен диагноз: РПЖ Т2NxM0.

У пациента Х. была взята венозная кровь, при генотипировании ДНК-маркеров определена геномная комбинация TT AA G/T TT полиморфных локусов rs4430796 гена HNF1B (C>T), rs1859962 гена CASC17 (A>C), rs1447295 гена CASC8 (G>T), rs6983267 CCAT2 (G>T), что позволило на основе использования молекулярно-генетических данных отнести мужчину к группе пациентов с повышенным риском развития РПЖ. При клиническом обследовании был установлен диагноз: РПЖ Т2NxM0.

У пациента В. была взята венозная кровь, при генотипировании ДНК-маркеров определена геномная комбинация TT А/C GG G/T полиморфных локусов rs4430796 гена HNF1B (C>T), rs1859962 гена CASC17 (A>C), rs1447295 гена CASC8 (G>T), rs6983267 CCAT2 (G>T), что позволило на основе использования молекулярно-генетических данных отнести мужчину к группе пациентов с повышенным риском развития РПЖ. При клиническом обследовании был установлен диагноз: РПЖ Т3NxM1.

У пациента Б. была взята венозная кровь, при генотипировании ДНК-маркеров определена геномная комбинация CC AA GG GG полиморфных локусов rs4430796 гена HNF1B (C>T), rs1859962 гена CASC17 (A>C), rs1447295 гена CASC8 (G>T), rs6983267 CCAT2 (G>T), что позволило на основе использования молекулярно-генетических данных отнести мужчину к группе пациентов с повышенным риском развития РПЖ. При клиническом обследовании был установлен диагноз: РПЖ Т3NxM0.

У пациента Ч. была взята венозная кровь, при генотипировании ДНК-маркеров определена геномная комбинация CC AA GG GG полиморфных локусов rs4430796 гена HNF1B (C>T), rs1859962 гена CASC17 (A>C), rs1447295 гена CASC8 (G>T), rs6983267 CCAT2 (G>T), что позволило на основе использования молекулярно-генетических данных отнести мужчину к группе пациентов с повышенным риском развития РПЖ. При клиническом обследовании был установлен диагноз: РПЖ Т3NxM0.

У пациента Е. была взята венозная кровь, при генотипировании ДНК-маркеров определена геномная комбинация CC AA GG GGCC AA GG G/T полиморфных локусов rs4430796 гена HNF1B (C>T), rs1859962 гена CASC17 (A>C), rs1447295 гена CASC8 (G>T), rs6983267 CCAT2 (G>T), что позволило на основе использования молекулярно-генетических данных отнести мужчину к группе пациентов с повышенным риском развития РПЖ. При клиническом обследовании был установлен диагноз: РПЖ Т1сNxM0.

Изобретение относится к медицине, а именно к молекулярно-генетической диагностике в онкологии, и может быть использовано для прогнозирования риска развития рака предстательной железы. Предложен способ прогнозирования риска развития рака предстательной железы. Из периферической венозной крови выделяют дезоксирибонуклеиновую кислоту ДНК. Затем проводят анализ однонуклеотидных полиморфизмов SNP: rs4430796 гена HNF1B C>T, rs1859962 гена CASC17 A>C, rs1447295 гена CASC8 G>T, rs6983267 CCAT2 G>T. Определяют геномную комбинацию по сочетанию аллелей перечисленных генов. При выявлении геномных комбинаций аллелей данных генов: TT CC GG G/T; TT CC G/T TT; TT AA GG G/T; TT AA G/T G/T; TT AA G/T GG; TT AA G/T TT; TT А/C GG G/T; CC CC G/T G/T; CC AA GG GG; CC CC GG GG; CC CC GG TT; CC AA GG G/T прогнозируют высокий риск развития рака предстательной железы. Разработка информативного диагностического способа позволяет на основе анализа одновременно четырех однонуклеотидных полиморфизмов выделить пациентов с повышенным риском развития рака предстательной железы. 5 ил., 1 пр.

Способ прогнозирования риска развития рака предстательной железы, характеризующийся тем, что из периферической венозной крови выделяют дезоксирибонуклеиновую кислоту ДНК, проводят анализ однонуклеотидных полиморфизмов SNP: rs4430796 гена HNF1B C>T, rs1859962 гена CASC17 A>C, rs1447295 гена CASC8 G>T, rs6983267 CCAT2 G>T и определяют геномную комбинацию по сочетанию аллелей перечисленных генов, при выявлении геномных комбинаций аллелей данных генов: TT CC GG G/T; TT CC G/T TT; TT AA GG G/T; TT AA G/T G/T; TT AA G/T GG; TT AA G/T TT; TT А/C GG G/T; CC CC G/T G/T; CC AA GG GG; CC CC GG GG; CC CC GG TT; CC AA GG G/T прогнозируют высокий риск развития рака предстательной железы.