Способ профилактики помутнения и васкуляризации трансплантата роговицы у животных после сквозной кератопластики на фоне предсуществующего васкуляризированного бельма роговицы вследствие ожоговой травмы глаза Российский патент 2024 года по МПК A61F9/01 A61P27/02 

Изобретение относится к медицине, а именно к офтальмологии, и может быть использовано для профилактики помутнения и васкуляризации трансплантата роговицы у животных после сквозной кератопластики на фоне предсуществующего васкуляризированного бельма роговицы вследствие ожоговой травмы глаза.

По данным разных авторов, ожоги органа зрения составляют от 4,2% до 38,4% всех глазных травм [Кононова А.А. К оценке некоторых методов консервативного лечения химических ожогов глаз в клинике и эксперименте: Автореф. дис. … канд. мед. наук. - Челябинск, 1969. - 20 с; Куглеев А.А., Макарова Р.Г. Анализ бытового травматизма органа зрения по данным глазной клиники ГИДУВ и Городской глазной больницы за 1960-1965 гг.// Науч. тр. Ленингр. гос. ин-та усоверш. врачей. - 1968. - Вып.64. - С.16-25; Пятышина О.В., Шалаева Е.Ю., Костив В.Я. Частота и исходы ожоговой травмы органа зрения. Современные технологии в офтальмологии, 2022, выпуск №2(42)]. Термические ожоги возникают под воздействием на ткань высокотемпературных факторов. Зачастую причиной термических ожогов является нарушение правил техники безопасности при работе с огнем, паром, кипящей водой или расплавленным металлом [Парамонов Б.А., Порембский Я.О., Яблонский В.Г. Ожоги: Руководство для врачей. - СПб.: Спец. лит., 2000. - 486 с]. Двухсторонний характер усугубляет тяжесть травмы.

Как химические, так и термические ожоги наделяют белки постожоговой роговицы и конъюнктивы новыми антигенными свойствами [Джалиашвили О.А., Кривенков Г.Н. Об аутоантигенных свойствах роговицы и конъюнктивы при термических и химических ожогах глазного яблока // Офтальмол. журн. - 1965. - №3. - С.183-187; Шульгина Н.С.Роль нарушения иммунобиологических систем в патогенезе ожогового процесса роговицы // Офтальмол. журн. -1959. - №6. - С.323-327; Reim М, Kottek A., Schrage N. The cornea surface and wound healing // Prog. Retinal Eye Res. - 1997. - Vol.16, N. 2. - P. 183-225]. Именно антигены гистосовместимости в комбинации с васкуляризацией роговицы реципиента являются причинами отторжения трансплантата. «Иммунная привилегия» роговицы, являющаяся основой успешной трансплантации роговицы, тесно связана с аваскулярной природой роговицы. Гибель стволовых клеток лимба роговицы, возникающая при ожоге роговицы, приводит к лимбальной недостаточности, что в дальнейшем приводит к развитию неоваскуляризации роговицы, состоящей из ангио- и лимфангиогенеза [Anderson D.F., Ellies P., Pires R.T.F., Tseng S.C.G. Amniotic membrane transplantation for partial limbal stem cell deficiency // Br. J. Ophthalmol. - 2001. - Vol.85. - P. 567-575; Chen J.J.Y., Tseng S.C.G. Corneal epithelial wound healing in partial limbal deficiency // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. - 1990. - Vol.31. - P. 1301-1314]. При полной лимбальной недостаточности ввиду отсутствия источника регенерации клеток эпителия роговицы эпителизация роговицы возможна только за счет эпителия бульбарной конъюнктивы. Данный процесс сопровождается врастанием в роговицу поверхностных и глубоких сосудов с формированием фиброваскулярного паннуса.

Сформированные новообразованные сосуды не обладают структурной целостностью и пропускают жидкость в интестициальное пространство, что может привести к кровоизлияниям, экссудативным реакциям и фиброзу.

Для лечения пациентов с ожогами глаз было предложено большое количество разнообразных консервативных и хирургических методов [Волков В.В. Принципы сортировки и этапного лечения пострадавших с ожогами глаз // Воен.-мед. журн. - 1972. - №7. - С.23-29; Волков В.В., Шиляев В.Г. Комбинированные поражения глаз. - Л.: Медицина, 1976. -159 с; Якименко С.А. Оптическое сквозное кератопротезирование с применением новых моделей кератопротезов // Офтальмол. журн. - 1981. - №2. - С.102-104; Sharma N, Kaur М, Agarwal Т, Sangwan VS, Vajpayee RB. Treatment of acute ocular chemical burns. Surv Ophthalmol. 2018 Mar-Apr;63(2):214-235. doi: 10.1016/j.survophthal.2017.09.005. Epub 2017 Sep 19. PMID: 28935121; Clare G, Bunce C, Tuft S. Amniotic membrane transplantation for acute ocular burns. Cochrane Database Syst Rev. 2022 Sep 1;9(9):CD009379. doi: 10.1002/14651858.]. Часть методов признаются эффективными, в то время как терапевтическая ценность и отдаленные клинико-функциональные результаты ряда других в настоящее время представляются спорными.

Существует два основных способа ведения пациентов с ожоговой травмой в анамнезе, консервативное и хирургическое лечение. Консервативное лечение заключается в назначении антибиотиков, кортикостероидов, ингибиторов протеолитических ферментов, сосудистых средств. Активно используются препараты, улучшающие метаболические процессы и стимулирующие регенерацию эпителия и стромы роговицы, а также адаптогены, витамины, физио- и тканевая терапия [Черныш, Бойко: Ожоги глаз. Состояние проблемы и новые подходы. ГЭОТАР-Медиа, 2017].

К хирургическим методам лечения роговицы относятся конъюнктивально-лимбальная аллотрансплантация, кератолимбальная аллотрансплантация, пересадка амниотической мембраны на глазную поверхность, сквозная и послойная кератопластика и др. Современные представления о патофизиологии ожогового процесса, понимание значения стволовых клеток лимба расширили возможности хирургического лечения пациентов. Одним из перспективных направлений стала лимбальная трансплантация, однако второй здоровый глаз пациента и полная интактность роговицы и лимба, а также отсутствие в анамнезе каких-либо повреждений и хронических заболеваний роговично-лимбальной зоны значительно уменьшает количество пациентов, подходящие для данного метода лечения [Черныш, Бойко: Ожоги глаз. Состояние проблемы и новые подходы. ГЭОТАР-Медиа, 2017].

Другим способом восстановления прозрачности роговицы вследствие ожоговых изменений является сквозная кератопластика. В Российской Федерации ежегодно проводится около 2500-3000 кератопластик при бельмах, посттравматических рубцах, дистрофиях роговицы, язвах роговицы различной этиологии, кератоконусе. По данным авторов, общие показатели выживаемости трансплантата через 10 лет после сквозной кератопластики составляют 79,3% [Inoue К, Amano S, Oshika Т, Tsuru Т. Risk factors for corneal graft failure and rejection in penetrating keratoplasty. Acta Ophthalmol Scand. 2001 Jun;79(3):251-5]. Однако при кератопластиках высокого риска, например, у пациентов с постожоговыми бельмами, показатель прозрачного приживления роговичного трансплантата составляет от 20 до 45% [Ситник Г.В. Особенности фармакотерапии после фемтокератопластики у больных с кератоконусом, OAI-PMH ID: oai:eyepress.ru:articlel5269].

Существующие консервативные и хирургические методы лечения не обеспечивают в достаточной мере профилактику неоваскуляризации и помутнения роговицы, что говорит об актуальности поиска альтернативных способов лечения данной патологии.

Задачей изобретения является создание безопасного и эффективного способа профилактики помутнения и васкуляризации трансплантата роговицы у животных после сквозной кератопластики на фоне предсуществующего васкуляризированного бельма роговицы вследствие ожоговой травмы глаза.

Техническим результатом заявляемого способа является сохранение прозрачности трансплантата роговицы и профилактика дальнейшего его помутнения, снижение риска васкуляризации трансплантата роговицы, возможность прорастания новообразованных сосудов в трансплантат не более, чем на 1 мм.

Технический результат достигается тем что, в способе профилактики помутнения и васкуляризации трансплантата роговицы у животных после сквозной кератопластики на фоне предсуществующего васкуляризированного бельма роговицы вследствие ожоговой травмы глаза, согласно изобретению, выполняют инсталляции кондиционированной среды мезенхимальных стволовых клеток (КС МСК) в конъюнктивальную полость: четырехкратно в течение часа, интервал между закапываниями - 20 минут.Инсталляции начинают на 1 сутки после кератопластики и выполняют в течение 30 дней. Раствор КС МСК получают следующим образом: выделяют мононуклеарную фракцию собственных клеток костного мозга, суспензию мононуклеарных клеток высевают на чашки Петри и культивируют в среде DMEM с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки, в CO2 инкубаторе в атмосфере 5% CO2 и 10% O2. После получения клеточного монослоя проводят полную смену культуральной среды и через 3 суток кондиционированную культуральную среду объединяют с лизатом мезенхимальных стволовых клеток (МСК), культуру клеток разрушают, используя физико-химические методы (два цикла замораживания-оттаивание).

Технический результат достигается за счет того, что используют кондиционированную среду (КС) МСК, которая обладает протективным, антиангиогенным эффектом, а также снижает уровень воспалительной реакции, что проявляется в уменьшении отека, более быстром восстановлении поверхности роговицы, ингибировании неоваскулогенеза.

Способ осуществляется следующим образом.

Выполняют инстилляции КС МСК в конъюнктивальную полость. Режим инсталляций четырехкратно в течение часа, интервал между закапываниями - 20 минут. Продолжительность лечения 30 суток.

Для получения КС МСК фракцию клеток костного мозга выделяют на градиенте плотности с использованием стандартного раствора. После суспензию мононуклеарных клеток высевают на чашки Петри и культивируют в среде DMEM с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки в CO2 инкубаторе в атмосфере 5% CO2 и 10% O2.

Для подтверждения того, что используемые клетки обладают свойствами МСК, проводят их остеогенную, хондрогенную и адипогенную дифференцировку по стандартной методике. После получения клеточного монослоя проводят полную смену культуральной среды и через 3 суток кондиционированную культуральную среду объединяют с лизатом МСК. Для получения лизатов МСК клетки разрушают, используя метод замораживания-оттаивания. Для разделения кондиционированной среды используют метод ультрафильтрации. 10 мл исследуемой кондиционированной среды помещают в концентратор Amicon Ultra-15,50000 NMWL (Millipore, Ireland), после чего центрифугируют в центрифуге с бакет-ротором в течение 25 минут при температуре +4°С. Верхнюю фракцию трижды промывают 10 мл IX PBS (Amresco, США), после чего переносят в новую пробирку и доводят объем до 10 мл с помощью IX PBS. Фильтрат, полученный при первом фильтровании, переносят в концентратор 30000 NMWL.

Процедуру фильтрования проводят так же, как описано выше, за исключением того, что верхнюю фракцию разбавляют до объема фильтрата, изначально внесенного в концентратор. Таким образом, получают нормализованные по объему фракции, содержащие преимущественно белки с массами до 100 kDa. Стерильные фракции кондиционированной среды лизата культивированных МСК растворяют в дистиллированной воде. Конечная концентрация белка составляет 8 мг\мл. Готовый раствор КС МСК представляет собой прозрачную гомогенизированную жидкость малинового цвета.

Изобретение поясняется следующими экспериментальными данными.

С помощью предложенного способа пролечены 5 экспериментальных животных (кролики породы Шиншилла) (5 правых глаз) с моделью посткератопластической роговицы на фоне предсуществующего васкуляризированного бельма роговицы вследствие ожоговой травмы глаза.

Для создания модели термического ожога роговицы использовали специальное устройство с металлическим цилиндром, которое подключали к источнику переменного тока; максимальный пик температуры составлял 210°С. Перед термическим воздействием в конъюнктивальную полость закапывали 0,5% раствор проксиметакаина. Ожог наносили путем установки основания данного цилиндра на периферическую область с захватом лимбальной зоны роговицы подопытных животных на 3 секунды. Следует отметить, что данная модель в отличие от химического повреждения роговицы позволяет в последующем исключить вероятность нейтрализации пептидов агрессивным химическим агентом. Используемая модель термического ожога позволяет к 7-м суткам получить обильное прорастание сосудов лимбальной сети в роговицу опытных животных, а к 14-м суткам получить формирование стойкого неоваскулярного бельма роговицы [Кодунов A.M., Терещенко А.В., Трифаненкова И.Г., Темнов А.А., Склифас А.Н., Ерохина Е.В., Демьянченко С.К., Шацких А.В. Влияние раствора пептидов на процессы ангиогенеза роговицы крыс в эксперименте // Саратовский научно-медицинский журнал. 2021. Т. 17. №2. С.314-318].

На 15 день эксперимента проводили сквозную кератопластику по стандартной технологии. Операцию выполняли под общим наркозом. Первоначально обрабатывали операционное поля 0.5% раствором хлоргексидина дважды. Из роговицы кролика-реципиента с помощью механического трепана выкраивали сквозной диск диаметром 8.0 мм и удаляли его. Донорскую роговицу выкраивали из роговицы предварительно энуклеированного глаза донора при помощи трепана диаметром 8.25 мм и переносили на подготовленное ложе пациента. Роговичный трансплантат фиксировали четырьмя узловыми швами 8-0. Далее накладывали 16 узловых швов 10-0, после чего снимали узловые провизорные швы 8-0. Переднюю камеру восстанавливали физиологическим раствором (NaCl 0,9%).

В послеоперационном периоде применяли инстилляции в конъюнктивальную полость раствора КС МСК. Инстилляции начинали на 1 сутки после проведенной кератопластики. Режим инсталляций четырехкратно в течение часа, интервал между закапываниями - 20 минут. На 1-е, 3-й, 7-е, 14-е, 30-е сутки животным опытной и контрольной групп проводили биомикроскопию, фоторегистрацию переднего отрезка глаза, исследование на приборе Pentacam AXL.

Для получения раствора КС МСК выделяли стволовые клетки костного мозга из тазовой кости. Мононуклеарную фракцию клеток костного мозга выделяли на градиенте плотности с использованием стандартного раствора Lympholyte-H (Cedarlane, Канада). Суспензию мононуклеарных клеток высевали на чашки Петри и культивировали в среде DMEM с добавлением 10% эмбриональной телячий сыворотки в CO2 инкубаторе в атмосфере 5% CO2 и 10% O2. После получения клеточного монослоя проводили полную смену культуральной среды и через 3 суток кондиционированную культуральную среду объединяли с лизатом МСК. Культуру клеток разрушали, используя физико-химические методы (два цикла замораживания-оттаивания). Готовый раствор КС МСК представлял собой прозрачную гомогенизированную жидкость малинового цвета.

Для подтверждения, что используемые клетки обладают свойствами МСК, были проведены их остеогенная, хондрогенная и адипогенная дифференцировки по стандартным методикам [Yagi Н., Soto-Gutierrez A., Navarro-Alvarez N., Nahmias Y., Goldwasser Y. et al. // Molecular Therapy, 2010, 18(10), Р.1857-64]. Остеогенная дифференцировка (с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 100 мкМ дексаметазона, 0,1 мМ аскорбиновой кислоты и 10 нМ Р-глицерофосфата) была подтверждена наличием щелочной фосфатазы в культуре клеток с использованием стандартных реактивов (Sigma-Aldrich, USA). Хондрогенная дифференцировка (с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 100 мкМ дексаметазона и 0,1 мкг/мл TGF-β) была подтверждена с использованием окраски альциановым голубым. Адипогенная дифференцировка (с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 10 мкМ дексаметазон, 10 мкг/мл инсулина, и 100 мкг/мл IBMX) была подтверждена окрашиванием с использованием Oil Red-O.

В контрольной группе (5 кроликов, 5 правых глаз) проводили инстилляции антибиотиков (Офтаквикс) и кератопротекторов (Корнерегель) трехкратно, выполняли инстилляции 0,5% раствора левофлоксацина («Офтаквикс») и закладывание геля «Корнерегель» за нижнее веко три раза в день (в 08:00, 12:00, 16:00) в течении 30 дней.

Состояние животных в группах оценивали в течение 30-ти дней ежедневно. Клинически оценивали следующие признаки: наличие или отсутствие отделяемого, характер конъюнктивальной инъекции и ее выраженность, площадь дефекта роговицы (определялась после окрашивания 0,1% раствором флюоресцеина натрия), интенсивность помутнения роговицы, наличие неоваскуляризации роговицы.

Сроки клинического наблюдения составили 1-е, 3-е, 7-е, 14-е, 30-е сутки. В сроки 1-е, 7-е, 14-е, 30-е сутки по одному животному в каждой группе выводили из эксперимента для проведения морфологического и гистологического исследования роговицы. Материал фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина, промывали проточной водой, обезвоживали в спиртах восходящей концентрации и заливали в парафин, выполняли серии гистологических срезов с применением окраски гематоксилин-эозином. Препараты изучали под микроскопом фирмы Leica DM LB2 (Германия) при х50, x100, х200, х400, х630 кратном увеличении с последующим фотографированием.

Данные клинических наблюдений. В срок 1-е сутки в опытной и контрольной группах наблюдалась умеренная светобоязнь, конъюнктивальная инъекция сосудов. Трансплантат роговицы прозрачный, отечный, ушит узловыми швами. Швы чистые, состоятельные. Передняя камера средней глубины, влага прозрачная. Радужка структурная, зрачок 3 мм. В области зрачка визуализировалась экссудативная пленка. Хрусталик прозрачный. Рефлекс розовый, снижен за счет экксудативных мембран.

На 3-е сутки в опытной группе трансплантат роговицы прозрачный, ушит узловыми швами. Шов чистый, состоятельный. Передняя камера средней глубины, влага прозрачная. Радужка структурная, зрачок 3 мм, хрусталик прозрачный. Остатки экссудативной пленки по зрачковому краю. Рефлекс розовый. В контрольной группе - умеренное слизистое отделяемое. Стромальный отек трансплантата роговицы в оптической зоне, трансплантат ушит узловыми швами, швы состоятельные. Передняя камера средней глубины, влага прозрачная. Радужка структурная, зрачок 3 мм, экссудативная мембрана закрывала не весь просвет зрачка, с увеличением плотности. Хрусталик прозрачный. Рефлекс розовый.

На 7-е сутки в опытной группе трансплантат роговицы прозрачный, ушит узловыми швами. Шов чистый, состоятельный. Передняя камера средней глубины, влага прозрачная. Радужка структурная, зрачок 3 мм, хрусталик прозрачный. Рефлекс розовый. В контрольной группе умеренное слизистое отделяемое. Стромальный отек трансплантата роговицы, трансплантат ушит узловыми швами, швы провисают. Неоваскуляризация трансплантата роговицы с 9 до 3 часов с прорастанием на 4 мм. Передняя камера средней глубины, влага прозрачная. Радужка структурная, зрачок 3 мм, остатков экссудативной мембраны не наблюдалось. Хрусталик прозрачный. Рефлекс розовый.

На 14-е сутки в опытной группе трансплантат роговицы прозрачный, ушит узловыми швами. Единичные стволы новообразованных сосудов с прорастанием в трансплантат не более, чем на 1 мм. Шов чистый, состоятельный. Передняя камера средней глубины, влага прозрачная. Радужка структурная, зрачок 3 мм, хрусталик прозрачный. Рефлекс розовый. В контрольной группе умеренное слизистое отделяемое. Стромальный отек трансплантата роговицы, трансплантат ушит узловыми швами, швы провисают. Неоваскуляризация роговицы с 9 до 3 часов с прорастанием на 4 мм. Передняя камера средней глубины, влага прозрачная. Радужка структурная, зрачок 3 мм, хрусталик прозрачный. Рефлекс розовый.

На 30-е сутки опытной группе трансплантат роговицы прозрачный, ушит узловыми швами. Единичные стволы новообразованных сосудов с прорастанием в трансплантат не более, чем на 1 мм. Шов чистый, состоятельный. Передняя камера средней глубины, влага прозрачная. Радужка структурная, зрачок 3 мм, хрусталик прозрачный. Рефлекс розовый. В контрольной группе трансплантат был отечный, мутный, из собственной роговицы циркулярно прорастало множество поверхностных и глубоких сосудов длиной 6-7 мм. Узловые швы провисали, отмечались единичные прорезывания швов, глубжележащие среды за флером.

Таким образом, заявляемый способ обеспечивает сохранение прозрачности трансплантата роговицы и профилактику дальнейшего его помутнения, снижение риска васкуляризации трансплантата роговицы, возможность прорастания новообразованных сосудов в трансплантат не более, чем на 1 мм.

Работа содержит материалы исследования, выполненного за счет гранта Российского научного фонда №23-25-10091 «Изучение антиангиогенных эффектов паракринных факторов мезенхимальных стволовых клеток при трансплантации роговицы в эксперименте», https://rscf.ru/proiect/23-25-10091/, и за счет гранта в форме субсидии из бюджета Калужской области.

Изобретение относится к офтальмологии и предназначено для профилактики помутнения и васкуляризации трансплантата роговицы у животных после сквозной кератопластики на фоне предсуществующего васкуляризированного бельма роговицы вследствие ожоговой травмы глаза. Применяют инсталляции в конъюнктивальную полость раствора кондиционированной среды мезенхимальных стволовых клеток (КС МСК) четырехкратно в течение часа с интервалом 20 мин, с 1 суток после кератопластики в течение 30 дней. Для получения раствора КС МСК выделяют мононуклеарную фракцию собственных клеток костного мозга, суспензию высевают на чашки Петри и культивируют в среде DMEM с 10% FBS в CO2 инкубаторе при 5% CO2 и 10% O2 с полной сменой культуральной среды после получения клеточного монослоя, через 3 суток кондиционированную культуральную среду объединяют с лизатом МСК. Изобретение обеспечивает сохранение прозрачности трансплантата роговицы, снижение риска васкуляризации трансплантата роговицы.

Способ профилактики помутнения и васкуляризации трансплантата роговицы у животных после сквозной кератопластики на фоне предсуществующего васкуляризированного бельма роговицы вследствие ожоговой травмы глаза, заключающийся в том, что применяют инсталляции в конъюнктивальную полость раствора кондиционированной среды мезенхимальных стволовых клеток (КС МСК), режим инсталляций - четырехкратно в течение часа, интервал между закапываниями - 20 минут, при этом инсталляции начинают на 1 сутки после кератопластики и выполняют в течение 30 дней, а раствор КС МСК получают следующим образом: выделяют мононуклеарную фракцию собственных клеток костного мозга, суспензию мононуклеарных клеток высевают на чашки Петри и культивируют в среде DMEM с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки в CO2 инкубаторе в атмосфере 5% CO2 и 10% O2, после получения клеточного монослоя проводят полную смену культуральной среды и через 3 суток кондиционированную культуральную среду объединяют с лизатом мезенхимальных стволовых клеток (МСК), культуру клеток разрушают, используя физико-химические методы.