Способ генотипирования полиморфного локуса rs6457452 (С>T) гена HSPA1B у человека методом ПЦР в режиме "реального времени" с применением аллель-специфических флуоресцентных зондов Российский патент 2024 года по МПК C12Q1/6806 C12Q1/6827 C12Q1/686 

Область техники, к которой относится изобретение. Изобретение относится к области биотехнологии, молекулярно-генетической диагностики, в частности к оценке однонуклеотидного полиморфизма rs6457452 (С>T) гена HSPA1B молекулярно-генетическим методом исследования.

Уровень техники. Этот безинтронный ген кодирует белок теплового шока массой 70 кДа, который является членом семейства белков теплового шока 70. В сочетании с другими белками теплового шока этот белок стабилизирует существующие белки против агрегации и опосредует сворачивание вновь транслированных белков в цитозоле и органеллах. Он также участвует в пути убиквитин-протеасома посредством взаимодействия с РНК-связывающим белком 1, богатым AU-элементом. Ген расположен в области класса III главного комплекса гистосовместимости, в кластере с двумя близкородственными генами, которые кодируют сходные белки. Заболевания, связанные с HSPA1B, включают отек легких и системную красную волчанку [https://www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=HSPA1B&keywords=HSPA1B].

Ген HSPA1B (Gene ID: 3304) локализован на хромосоме 6p21.33. Согласно SNPinfo Web Server/ LD TAG SNP Selection [https://snpinfo.niehs.nih.gov/snpinfo/snptag.html] полиморфный вариант rs6457452 HSPA1B является таргетным (то есть репрезентативным однонуклеотидным полиморфизмом в геномной области с высокой степенью неравновесия по сцеплению с группами других полиморфных локусов, составляющих гаплотип). SNP rs6457452 позиция chr6:31827773 (GRCh38.p14) [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/rs6457452] представляет собой вариант, локализованный в 5′-нетранслируемой области гена и характеризуется заменой C>G,T. Однако, аллель G встречается в европейских популяциях с частотой <0.0000001, в связи с чем изучение замены C>T является актуальной для изучения мультифакторных болезней человека. SNP rs6457452 отличается высокой функциональной значимостью. Согласно биоинформатическому ресурсу GTEx Portal, данный генетический вариант влияет на экспрессию 22 генов - AGPAT1, ATP6V1G2, BAG6, CCHCR1, DDX39B, DPCR1, EGFL8, FKBPL, HCG22, HLA-B, HLA-S, LSM2, LY6G5B, LY6G5C, LY6G6F, PSORS1C1, PSORS1C2, STK19, STK19B, TNXA, VARS, VARS2 - в различных органах и тканях посредством eQTL-эффектов [https://gtexportal.org/home/snp/rs6457452]. Кроме того, обнаружено его влияние на модификации гистонов, маркирующих промоторы и энхансеры в большинстве тканей и органов человека [https://pubs.broadinstitute.org/mammals/haploreg/detail_v4.2.php?query=&id=rs6457452], а также на связывание с транскрипционными факторами [http://atsnp.biostat.wisc.edu/search]. Это создает потребность в создании простого в исполнении, недорого и доступного исследователям, работающим в области генетической эпидемиологии, метода идентификации однонуклеотидного полиморфизма полиморфизма rs6457452 (С>T) гена HSPA1B.

Известен способ анализа генетических вариаций в геноме человека методом секвенирования амплифицированных участков ДНК [Mardis E.R. DNA sequencing technologies: 2006-2016 //Nature protocols. - 2017. - Vol. 12. - №. 2. - P. 213-218]. Недостатками метода являются высокая стоимость оборудования и реагентов, что исключает широкое внедрение метода в экспериментальные исследования, особенно изучение многофакторных заболеваний, которые требуют большого размера выборок для обеспечения высокой мощности исследований.

Известен способ анализа генетических вариаций в геноме человека методом матричноактивированной лазерной десорбционно-ионизационной масс-спектрометрии (MALDI). Метод заключается в том, анализируемая ДНК переносится на подложку, где она кристаллизуется с матрицей. Затем кристаллизованные аналиты переносят, облучают лазером, вызывая десорбцию и ионизацию молекул в вакуумной камере. Положительно заряженные ионы ДНК ускоряются и мигрируют через вакуумную трубку к высокочувствительному детектору с разной скоростью в зависимости от массы ионов, что приводит к различному времени пролета. Используя время пролета отдельных ионизированных ДНК-аналитов, система определяет массу и отображает масс-спектр, идентифицирующий различные генетические мишени [Li D. et al. MALDI-TOF mass spectrometry in clinical analysis and research //ACS Measurement Science Au. - 2022. - Vol. 2. - №. 5. - P. 385-404]. Недостатками метода являются трудоемкость, высокая стоимость оборудования, высокая стоимость эксперимента, наличие высококвалифицированного персонала.

За прототип выбран коммерческий набор по генотипированию rs6457452 (C/T) HSPA1B (Assay ID C___3052604_10; каталог 4351379) компании ThermoFisher. Однако, генотипирование с использованием коммерческих наборов характеризуется высокой стоимостью, а информация о структуре необходимых для проведения ПЦР праймеров и аллель-специфических зондов является закрытой для исследователей, в связи с чем он не может быть воспроизведен при наличии стандартного набора оборудования и реактивов.

Таким образом, существует реальная потребность в создании быстрого, недорогого и легко воспроизводимого способа идентификации полиморфизма rs6457452 (С>T) гена HSPA1B, с доступной всем исследователям структурой праймеров и аллель-специфических зондов, который мог бы использоваться в качестве «рутинного» метода генотипирования в любой ПЦР-лаборатории.

Раскрытие сущности изобретения. Техническим результатом данного изобретения является разработка простого в исполнении и экономически целесообразного способа генотипирования однонуклеотидного полиморфизма rs6457452 (С>T), локализованного в позиции chr6:31827773 (GRCh38.p14) гена HSPA1B (Gene ID: 3304) методом полимеразной цепной реакции в режиме «реального времени» с применением аллель-специфических сигнальных зондов, содержащие флуорофоры FAM и ROX.

Технический результат достигается тем, что идентификацию аллельных вариантов rs6457452 (С>T) гена HSPA1B осуществляют с использованием прямого праймера rs6457452 5′-TCAGAAGGGGAAAGGCGG-3′ (SEQ ID NO 1), обратного праймера rs6457452 5′-GGAAAGCCTTGGGACCGC-3′ (SEQ ID NO 2), rs6457452-C-аллель-специфичного флуоресцентно-меченого зонда 5′-(FAM)CGAGGGTCCGCTTCGTCTTTC(RTQ1)-3′ (SEQ ID NO 3), rs6457452-T-аллель-специфичного флуоресцентно-меченого зонда 5′-(ROX)CGAGGGTCCGTTTCGTCTTTC(BHQ2)-3′ (SEQ ID NO 4).

Изобретение поясняется следующей фигурой: дискриминация аллелей по локусу rs6457452 гена HSPA1B при генотипировании методом ПЦР в режиме «реального времени» с применением аллель-специфических флуоресцентных зондов по данным величин RFU (относительные единицы флуоресценции) на амплификаторе CFX96: генотипы rs6457452-C/C показаны оранжевыми кругами, генотипы rs6457452-C/T показаны зелеными треугольниками, генотипы rs6457452-T/T показаны голубыми квадратами; черным ромбом отмечен отрицательный контроль.

Работа над дизайном олигонуклеотидов включала несколько этапов:

1) С применением открытой базы данных Ensembl genome browser 109 [https://www.ensembl.org/index.html] выбран синвенс, фланкирующий искомую однонуклеотидную замену [C/T] rs6457452 HSPA1B, и затем с помощью доступного онлайн программного обеспечения Primer3web version 4.1.0 [https://primer3.ut.ee/] подобрана последовательность олигонуклеотидов, используемых для проведения ПЦР-реакции:

прямой общий праймер rs6457452 5′-TCAGAAGGGGAAAGGCGG-3′ (SEQ ID NO 1),

обратный общий праймер rs6457452 5′-GGAAAGCCTTGGGACCGC-3′ (SEQ ID NO 2).

Размер амплифицируемого в ходе ПЦР фрагмента гена HSPA1B составляет 139 пар нуклеотидов (TCAGAAGGGGAAAGGCGGGTCTCCACGACGACTTATAAAAGCCGAGGGGCGCGCGGTCCGGAAAACGGCCAGCCTGAGGAGCTGCTGCGAGGGTCCG[C/T]TTCGTCTTTCGAGAGTGACTCCCGCGGTCCCAAGGCTTTCC).

2). Для дизайна зондов пользовались практическими рекомендациями [Basu C. (ed.). PCR primer design. - New york : Humana Press, 2015]. В реакции использовались гидролизные зонды. Последовательность зонда подбирали таким образом, чтобы он отжигался на матрицу между прямым и обратным праймерами. Каждый зонд снабжали флуорофором и гасителем флуоресценции, спектр поглощения которого соответствует длинам волн спектра флуорофора. Для гашения флуоресценции FAM пользовались гасителем RTQ1; для гашения флуоресценции ROX - гасителем BHQ2.

На основании изложенных критериев и практических рекомендаций были подобраны зонды со следующей структурой:

rs6457452-C-аллель-специфичный флуоресцентно-меченый зонд 5′-(FAM)CGAGGGTCCGCTTCGTCTTTC(RTQ1)-3′ (SEQ ID NO 3), rs6457452-T-аллель-специфичный флуоресцентно-меченый зонд 5′-(ROX)CGAGGGTCCGTTTCGTCTTTC(BHQ2)-3′ (SEQ ID NO 4).

3) Изготовление праймеров и зондов осуществлялось в сервисном центре НПК «Синтол», Москва.

4) С помощью практических экспериментов подобраны оптимальные условия для проведения генотипирования, которые включают следующие этапы: 50°C в течение 2 минут, 95°C в течение 10 минут, затем 39 циклов [95°C в течение 10 секунд и 65°C в течение 1 минуты].

5) Разработанный способ был апробирован в лаборатории геномных исследований на 200 образцах ДНК здоровых индивидуумов биобанка НИИ генетической и молекулярной эпидемиологии КГМУ. Генотипирование осуществляли по данным величин RFU (относительные единицы флуоресценции) зондов с флуоресцентными красителями. По результатам генотипирования rs6457452 160 человек (80%) индивидуумов оказались гомозиготами по аллелю C (генотип C/C), 36 человек (18%) являлись гетерозиготами (генотип C/T), 4 человека (2%) оказались гомозиготами по аллелю T (генотип T/T).

6) Валидацию способа проводили методом масс-спектрометрического анализа на геномном времяпролетном масс-спектрометре MassArray analyzer 4 (Agena Bioscience). Результаты обоих способов генотипирования полностью (100% генотипов) совпали. Однако патентуемый способ генотипирования полиморфного локуса rs6457452 (С>T) гена HSPA1B методом ПЦР в режиме «реального времени» с применением аллель-специфических зондов позволяет значительно (на 6 часов) сократить время проведения анализа, а также снижает себестоимость анализа (в 4-5 раз).

Осуществление изобретения.

Способ осуществляют следующим образом:

1. Выделение ДНК из периферической венозной крови. На первом этапе к 0,5 мл крови добавляли 0,5 мл PBS и центрифугировали 10 мин при 12 тыс. об/мин. Надосадочную жидкость сливали, добавляли 1 мл PBS и вновь центрифугировали при тех же условиях. Надосадочную жидкость сливали, добавляли 200 мкл ТЕ-буфера, пипетировали до растворения осадка и затем последовательно добавляли 10 мкл 1% раствора додецилсульфата натрия SDS и 5 мкл протеиназы К. Пробирки инкубировали в термостате при t=37°C 12 ч. В ходе второго этапа проводили четыре последовательных центрифугирования с фенолом и хлороформом согласно протоколу методики (10 мин, 8 тыс. об/мин), после чего ДНК осаждали ледяным раствором 95% этилового спирта и центрифугировали 10 мин при 14,3 тыс. об/мин. По испарении спирта ДНК растворяли в 100 мкл деионизированной дистиллированной воды. Получаемый раствор ДНК в воде имел чистоту в диапазоне А260/280=1,5-2,0 и среднюю концентрацию около 180-200 нг/мкл.

2. Подготовка образцов ДНК к генотипированию. Качество выделенной ДНК оценивали по степени чистоты и концентрации раствора на спектрофотометре NanoDrop (Thermo Fisher Scientific, США). Все анализируемые образцы ДНК были разведены деионизированной водой до концентрации 15-20 нг/мкл при А260/280=1,5-2,0.

3. Анализ полиморфизма rs6457452 (С>T) гена HSPA1B с помощью полимеразной цепной реакции в реальном времени с использованием аллель-специфических зондов. Для генотипирования использовали два фланкирующих праймера, прямой (SEQ ID NO 1) и обратный (SEQ ID NO 2), а также аллель-специфические зонды: С-аллель-специфичный флуоресцентно-меченый зонд (SEQ ID NO 3), T-аллель-специфичный флуоресцентно-меченый зонд (SEQ ID NO 4).

ПЦР в «реальном времени» проводили в 25 мл реакционной смеси, содержащей 1,25 ЕД ДНК-полимеразы Hot Start Taq («Биолабмикс», Новосибирск, Россия), 20 нг ДНК, по 10 мкМ каждого праймера, по 5 мкМ каждого зонда, 0.03 мМ каждого dNTP, 2,0 мМ MgCl2; 1хПЦР-буфер [67 мМ Tris-HCl, pH 8,8, 16,6 мМ (NH4)2SO4, 0,01% Tween-20]. Реакция амплификации состояла из стадии нагревания до 50°C в течение 2 минут, 95°C в течение 10 минут, затем 39 циклов [95°C в течение 10 секунд и 65°C в течение 1 минуты].

4. Генотипирование. При проведении ПЦР в амплификаторе с флуоресцентной детекцией (Bio-Rad CFX96 или аналогичном амплификаторе) генотипирование осуществляют по данным величин RFU (относительных единиц флуоресценции). Для rs6457452 (С>T) гена HSPA1B зонд с флуоресцентным красителем FAM соответствует аллелю С, зонд с красителем ROX - аллелю G (фиг. 1). На фигуре видно четкое разделение образцов на кластеры, где черный ромб соответствуют отрицательному контролю, кластер оранжевых кругов - соответствует зонду с флуоресцентным красителем FAM и позволяет идентифицировать гомозигот С/С. Кластер синих квадратов соответствует зонду с красителем ROX и позволяет идентифицировать гомозигот T/T. Кластер зеленых треугольников соответствует накоплению уровня флуоресценции по обоим зондам и позволяет идентифицировать гетерозигот С/T.

Резюме.

Таким образом, разработан эффективный и недорогой способ для экспресс-идентификации полиморфного варианта rs6457452 (С>T) гена HSPA1B у человека методом ПЦР в режиме «реального времени» с применением аллель-специфических флуоресцентных зондов, который может быть использован в медицине при определении наследственной предрасположенности к развитию заболеваний, ассоциированных с носительством полиморфизмов гена HSPA1B, а также в научных целях.

--->

<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing

1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">

<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="Способ

генотипирования полиморфного локуса rs6457452 (С T) гена HSPA1B у

человека методом ПЦР в режиме «реального времени» с применением

аллель-специфических флуоресцентных зондов.xml" softwareName="WIPO

Sequence" softwareVersion="2.3.0" productionDate="2024-05-03">

<ApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText></ApplicationNumberText>

<FilingDate></FilingDate>

</ApplicationIdentification>

<ApplicantFileReference>2027</ApplicantFileReference>

<ApplicantName languageCode="ru">Федеральное государственное

бюджетное образовательное учреждение высшего образования

&quot;Курский государственный медицинский университет&quot;

Министерства здравоохранения Российской Федерации,</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>Kursk State Medical

University</ApplicantNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">Способ генотипирования

полиморфного локуса rs6457452 (С&gt;T) гена HSPA1B у человека

методом ПЦР в режиме «реального времени» с применением аллель-

специфических флуоресцентных зондов</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>4</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>18</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..18</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q2">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>tcagaaggggaaaggcgg</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="2">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>18</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..18</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q4">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>ggaaagccttgggaccgc</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="3">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>21</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..21</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q6">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>cgagggtccgcttcgtctttc</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="4">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>21</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..21</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q8">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>cgagggtccgtttcgtctttc</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способу генотипирования полиморфного локуса rs6457452 (С>T) гена HSPA1B у человека. Способ осуществляется посредством метода ПЦР в режиме «реального времени» и предусматривает использование прямого и обратного праймеров с последовательностями SEQ ID NO: 1 и 2 соответственно, а также rs6457452-C- и T-аллель-специфичных флуоресцентно-меченых зондов с последовательностями SEQ ID NO: 3 и 4 соответственно. Настоящее изобретение обеспечивает доступный и простой в исполнении способ идентификации однонуклеотидного полиморфизма rs6457452 (С>T) гена HSPA1B. 1 ил.

Способ генотипирования полиморфного локуса rs6457452 (С>T) гена HSPA1B у человека методом ПЦР в режиме «реального времени» с применением аллель-специфических флуоресцентных зондов, отличающийся тем, что идентификацию аллельных вариантов rs6457452 (С>T) гена HSPA1B осуществляют с использованием прямого праймера rs6457452 5′-TCAGAAGGGGAAAGGCGG-3′ (SEQ ID NO 1), обратного праймера rs6457452 5′-GGAAAGCCTTGGGACCGC-3′ (SEQ ID NO 2), rs6457452-C-аллель-специфичного флуоресцентно-меченого зонда 5′-(FAM)CGAGGGTCCGCTTCGTCTTTC(RTQ1)-3′ (SEQ ID NO 3), rs6457452-T-аллель-специфичного флуоресцентно-меченого зонда 5′-(ROX)CGAGGGTCCGTTTCGTCTTTC(BHQ2)-3′ (SEQ ID NO 4).