Способ генотипирования полиморфного локуса rs13161158 (T>C) гена HSPA4 у человека методом ПЦР в режиме "реального времени" с применением аллель-специфических флуоресцентных зондов Российский патент 2024 года по МПК C12Q1/68 

Область техники, к которой относится изобретение. Изобретение относится к области биотехнологии, молекулярно-генетической диагностики, в частности к оценке однонуклеотидного полиморфизма rs13161158 (T>C) гена HSPA4 молекулярно-генетическим методом исследования.

Уровень техники. HSPA4 принадлежит к семейству HSP70, экспрессирующихся в ответ на клеточный стресс и являющихся катализатором белкового фолдинга. Ген HSPA4 широко экспрессируется в различных органах/тканях и, согласно биоинформатическому ресурсу GeneCards, является биомаркером хронической обструктивной болезни легких, ревматоидного артрита, сахарного диабета 2 типа, язвенного колита [https://www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=HSPA4]. Кроме того, установлена значительная роль HSPA4 в индуцировании онкогенного стресса путем ингибирования апоптоза и активации пролиферации раковых клеток [Shang B.B. et al. Significant correlation between HSPA4 and prognosis and immune regulation in hepatocellular carcinoma // PeerJ. - 2021. - Vol. 9. - P. e12315].

Ген HSPA4 (Gene ID: 3308) локализован на хромосоме 5q31.1. Согласно SNPinfo Web Server/ LD TAG SNP Selection [https://snpinfo.niehs.nih.gov/snpinfo/snptag.html] полиморфный вариант rs13161158 гена HSPA4 является таргетным (то есть репрезентативным однонуклеотидным полиморфизмом в геномной области с высокой степенью неравновесия по сцеплению с группами других полиморфных локусов, составляющих гаплотип). Однонуклеотидный полиморфизм rs13161158, позиция chr5:133071996 (GRCh38.p14) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/rs13161158) локализован в интроне и характеризуется заменой T>C. Согласно биоинформатическому ресурсу GTEx Portal, генетический вариант rs13161158 (T>C) влияет на экспрессию генов AFF4, KIF3A посредством eQTL-эффектов.

Кроме того, обнаружена значительная связь rs13161158 с модификациями гистонов в скелетных мышцах, кровеносных сосудах, тканях желудочно-кишечного тракта [https://pubs.broadinstitute.org/mammals/haploreg/detail_v4.2.php?query=&id=rs13161158]; влияние данного генетического варианта на связывание с транскрипционными факторами [http://atsnp.biostat.wisc.edu/search]. Это создает потребность в создании простого в исполнении, недорого и доступного исследователям, работающим в области генетической эпидемиологии, метода идентификации однонуклеотидного полиморфизма rs13161158 (T>C) гена HSPA4.

Известен способ анализа генетических вариаций в геноме человека методом секвенирования амплифицированных участков ДНК [Mardis E. R. DNA sequencing technologies: 2006-2016 // Nature protocols. - 2017. - Vol. 12. - №.2. - P. 213-218]. Недостатками метода являются высокая стоимость оборудования и реагентов, что исключает широкое внедрение метода в экспериментальные исследования, особенно изучение многофакторных заболеваний, которые требуют большого размера выборок для обеспечения высокой мощности исследований.

Известен способ анализа генетических вариаций в геноме человека методом матричноактивированной лазерной десорбционно-ионизационной масс-спектрометрии (MALDI). Метод заключается в том, анализируемая ДНК переносится на подложку, где она кристаллизуется с матрицей. Затем кристаллизованные аналиты переносят, облучают лазером, вызывая десорбцию и ионизацию молекул в вакуумной камере. Положительно заряженные ионы ДНК ускоряются и мигрируют через вакуумную трубку к высокочувствительному детектору с разной скоростью в зависимости от массы ионов, что приводит к различному времени пролета. Используя время пролета отдельных ионизированных ДНК-аналитов, система определяет массу и отображает масс-спектр, идентифицирующий различные генетические мишени [Li D. et al. MALDI-TOF mass spectrometry in clinical analysis and research // ACS Measurement Science Au. - 2022. - Vol. 2. - №.5. - P. 385-404]. Недостатками метода являются трудоемкость, высокая стоимость оборудования, высокая стоимость эксперимента, наличие высококвалифицированного персонала.

За прототип выбран коммерческий набор по генотипированию rs13161158 (C/T) HSPA4 (C__45113169_10; каталог 4351379) компании ThermoFisher. Однако, генотипирование с использованием коммерческих наборов характеризуется высокой стоимостью, а информация о структуре необходимых для проведения ПЦР праймеров и аллель-специфических зондов является закрытой для исследователей, в связи с чем он не может быть воспроизведен при наличии стандартного набора оборудования и реактивов.

Таким образом, существует реальная потребность в создании быстрого, недорогого и легко воспроизводимого способа идентификации полиморфизма rs13161158 (T>C) гена HSPA4, с доступной всем исследователям структурой праймеров и аллель-специфических зондов, который мог бы использоваться в качестве «рутинного» метода генотипирования в любой ПЦР-лаборатории.

Раскрытие сущности изобретения. Техническим результатом данного изобретения является разработка простого в исполнении и экономически целесообразного способа генотипирования однонуклеотидного полиморфизма rs13161158 (T>C), локализованного в позиции chr5:133071996 (GRCh38.p14) гена HSPA4 (Gene ID: 3308) методом полимеразной цепной реакции в режиме «реального времени» с применением аллель-специфических сигнальных зондов, содержащие флуорофоры FAM и ROX.

Технический результат достигается тем, что идентификацию аллельных вариантов rs13161158 (T>C) гена HSPA4 осуществляют с использованием прямого праймера rs13161158 5- CCAGTGGCTGATACACCAGA-3' (SEQ ID NO 1), обратного праймера rs13161158 5

-GGAAGACACTTACGCATTCCA-3

(SEQ ID NO 2), rs13161158-T-аллель-специфичного флуоресцентно-меченого зонда 5

-(FAM)CCATCTAGTGCCCCTAGCT(RTQ1)-3

(SEQ ID NO 3), rs13161158-C-аллель-специфичного флуоресцентно-меченого зонда 5

-(ROX) CCATCTAGCGCCCCTAGCT(BHQ2)-3

(SEQ ID NO 4).

Изобретение поясняется следующей фигурой: дискриминация аллелей по локусу rs13161158 гена HSPA4 при генотипировании методом ПЦР в режиме «реального времени» с применением аллель-специфических флуоресцентных зондов по данным величин RFU (относительные единицы флуоресценции) на амплификаторе CFX96: генотипы rs13161158-T/T показаны оранжевыми кругами, генотипы rs13161158-T/C показаны зелеными треугольниками, генотипы rs13161158-C/C показаны голубыми квадратами; черным ромбом отмечен отрицательный контроль.

Работа над дизайном олигонуклеотидов включала несколько этапов:

С применением открытой базы данных Ensembl genome browser 109 [https://www.ensembl.org/index.html] выбран синвенс, фланкирующий искомую однонуклеотидную замену [T/C] rs13161158 гена HSPA4, и затем с помощью доступного онлайн программного обеспечения Primer3web version 4.1.0 [https://primer3.ut.ee/] подобрана последовательность олигонуклеотидов, используемых для проведения ПЦР-реакции:

прямой общий праймер rs13161158 5

-CCAGTGGCTGATACACCAGA-3

(SEQ ID NO 1),

обратный общий праймер rs13161158 5

-GGAAGACACTTACGCATTCCA-3

(SEQ ID NO 2).

Размер амплифицируемого в ходе ПЦР фрагмента гена HSPA4 составляет 180 пар нуклеотидов:

(CCAGTGGCTGATACACCAGATCCTGTATTTCTTAGATGTTTCCTACCTTTCCT

CAGCTCTTCCATTGGTCTCCCAGATTTGTTTCCATTCCTCCATCTAG[T/C]GCC

CCTAGCTTTGATCCTGCATAACACTCTGTGTGGGAGTAAAATTTATGTAAAAT

ATTGGAATGCGTAAGTGTCTTCC)

2). Для дизайна зондов пользовались практическими рекомендациями [Basu C. (ed.). PCR primer design. - New york : Humana Press, 2015]. В реакции использовались гидролизные зонды. Последовательность зонда подбирали таким образом, чтобы он отжигался на матрицу между прямым и обратным праймерами. Каждый зонд снабжали флуорофором и гасителем флуоресценции, спектр поглощения которого соответствует длинам волн спектра флуорофора. Для гашения флуоресценции FAM пользовались гасителем RTQ1; для гашения флуоресценции ROX - гасителем BHQ2.

На основании изложенных критериев и практических рекомендаций были подобраны зонды со следующей структурой:

rs13161158-T-аллель-специфичный флуоресцентно-меченый зонд

5

-(FAM)CCATCTAGTGCCCCTAGCT(RTQ1)-3

(SEQ ID NO 3),

rs13161158-C-аллель-специфичный флуоресцентно-меченый зонд

5

-(ROX) CCATCTAGCGCCCCTAGCT(BHQ2)-3

(SEQ ID NO 4).

3) Изготовление праймеров и зондов осуществлялось в сервисном центре НПК «Синтол», Москва.

4) С помощью практических экспериментов подобраны оптимальные условия для проведения генотипирования, которые включают следующие этапы: 50°C в течение 2 минут, 95 C в течение 10 минут, затем 39 циклов [95 C в течение 10 секунд и 62C в течение 1 минуты].

5) Разработанный способ был апробирован в лаборатории геномных исследований на 95 образцах ДНК здоровых индивидуумов биобанка НИИ генетической и молекулярной эпидемиологии КГМУ. Генотипирование осуществляли по данным величин RFU (относительные единицы флуоресценции) зондов с флуоресцентными красителями. По результатам генотипирования rs13161158 86 человек (90,53%) оказались гомозиготами по аллелю Т (генотип Т/Т); 8 человек (8,42%) являлись гетерозиготами (генотип Т/С), 1 человек (1,05%) индивидуумов оказались гомозиготами по аллелю С (генотип С/С).

6) Валидацию способа проводили методом масс-спектрометрического анализа на геномном времяпролетном масс-спектрометре MassArray analyzer 4 (Agena Bioscience). Результаты обоих способов генотипирования полностью (100% генотипов) совпали. Однако патентуемый способ генотипирования полиморфного локуса rs13161158 (T>C) гена HSPA4 методом ПЦР в режиме «реального времени» с применением аллель-специфических зондов позволяет значительно (на 6 часов) сократить время проведения анализа, а также снижает себестоимость анализа (в 4-5 раз).

Осуществление изобретения.

Способ осуществляют следующим образом:

1. Выделение ДНК из периферической венозной крови. На первом этапе к 0,5 мл крови добавляли 0,5 мл PBS и центрифугировали 10 мин при 12 тыс. об/мин. Надосадочную жидкость сливали, добавляли 1 мл PBS и вновь центрифугировали при тех же условиях. Надосадочную жидкость сливали, добавляли 200 мкл ТЕ-буфера, пипетировали до растворения осадка и затем последовательно добавляли 10 мкл 1% раствора додецилсульфата натрия SDS и 5 мкл протеиназы К. Пробирки инкубировали в термостате при t=37°C 12 ч. В ходе второго этапа проводили четыре последовательных центрифугирования с фенолом и хлороформом согласно протоколу методики (10 мин, 8 тыс. об/мин), после чего ДНК осаждали ледяным раствором 95% этилового спирта и центрифугировали 10 мин при 14,3 тыс. об/мин. По испарении спирта ДНК растворяли в 100 мкл деионизированной дистиллированной воды. Получаемый раствор ДНК в воде имел чистоту в диапазоне А260/280=1,5-2,0 и среднюю концентрацию около 180-200 нг/мкл.

2. Подготовка образцов ДНК к генотипированию. Качество выделенной ДНК оценивали по степени чистоты и концентрации раствора на спектрофотометре NanoDrop (Thermo Fisher Scientific, США). Все анализируемые образцы ДНК были разведены деионизированной водой до концентрации 15-20 нг/мкл при А260/280=1,5-2,0.

3. Анализ полиморфизма rs13161158 (T>C) гена HSPA4 с помощью полимеразной цепной реакции в реальном времени с использованием аллель-специфических зондов. Для генотипирования использовали два фланкирующих праймера, прямой (SEQ ID NO 1) и обратный (SEQ ID NO 2), а также аллель-специфические зонды: T-аллель-специфичный флуоресцентно-меченый зонд (SEQ ID NO 3), C-аллель-специфичный флуоресцентно-меченый зонд (SEQ ID NO 4).

ПЦР в «реальном времени» проводили в 25 мл реакционной смеси, содержащей 1,25 ЕД ДНК-полимеразы Hot Start Taq («Биолабмикс», Новосибирск, Россия), 20 нг ДНК, по 10 мкМ каждого праймера, по 5 мкМ каждого зонда, 0.03 мМ каждого dNTP, 3,0 мМ MgCl2; 1хПЦР-буфер [67 мМ Tris-HCl, pH 8,8, 16,6 мМ (NH4)2SO4, 0,01% Tween-20]. Реакция амплификации состояла из стадии нагревания до 50

C в течение 2 минут, 95

C в течение 10 минут, затем 39 циклов [95

C в течение 10 секунд и 62

C в течение 1 минуты].

4. Генотипирование. При проведении ПЦР в амплификаторе с флуоресцентной детекцией (Bio-Rad CFX96 или аналогичном амплификаторе) генотипирование осуществляют по данным величин RFU (относительных единиц флуоресценции). Для rs13161158 (T>C) гена HSPA4 зонд с флуоресцентным красителем FAM соответствует аллелю T, зонд с красителем ROX - аллелю C (фиг. 1). На фигуре видно четкое разделение образцов на кластеры, где черный ромб соответствуют отрицательному контролю, кластер оранжевых кругов - соответствует зонду с флуоресцентным красителем FAM и позволяет идентифицировать гомозигот T/T. Кластер синих квадратов соответствует зонду с красителем ROX и позволяет идентифицировать гомозигот C/C. Кластер зеленых треугольников соответствует накоплению уровня флуоресценции по обоим зондам и позволяет идентифицировать гетерозигот T/C.

Резюме.

Таким образом, разработан эффективный и недорогой способ для экспресс-идентификации полиморфного варианта rs13161158 (T>C) гена HSPA4 у человека методом ПЦР в режиме «реального времени» с применением аллель-специфических флуоресцентных зондов, который может быть использован в медицине при определении наследственной предрасположенности к развитию заболеваний, ассоциированных с носительством полиморфизмов гена HSPA4, а также в научных целях.

--->

<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing

1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">

<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="Способ

генотипирования полиморфного локуса rs13161158 (T C) гена HSPA4 у

человека методом ПЦР в режиме «реального времени» с применением

аллель-специфических флуоресцентных зондов.xml" softwareName="WIPO

Sequence" softwareVersion="2.3.0" productionDate="2024-02-26">

<ApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText></ApplicationNumberText>

<FilingDate></FilingDate>

</ApplicationIdentification>

<ApplicantFileReference>1880</ApplicantFileReference>

<ApplicantName languageCode="ru">Федеральное государственное

бюджетное образовательное учреждение высшего образования

&quot;Курский государственный медицинский университет&quot;

Министерства здравоохранения Российской Федерации,</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>Kursk State Medical

University</ApplicantNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">Способ генотипирования

полиморфного локуса rs13161158 (T&gt;C) гена HSPA4 у человека методом

ПЦР в режиме «реального времени» с применением аллель-специфических

флуоресцентных зондов</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>4</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q2">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>ccagtggctgatacaccaga</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="2">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>21</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..21</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q4">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>ggaagacacttacgcattcca</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="3">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>18</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..18</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q6">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>ccatctaggcccctagct</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="4">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>18</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..18</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q8">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>ccatctaggcccctagct</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Изобретение относится к области биотехнологии, молекулярно-генетической диагностики, и может быть использовано в медицине при определении наследственной предрасположенности к развитию заболеваний, ассоциированных с носительством полиморфного варианта rs13161158 (T>C) гена HSPA4. Предложен способ генотипирования полиморфного локуса rs13161158 (T>C) гена HSPA4 у человека методом ПЦР в режиме «реального времени» с применением аллель-специфических флуоресцентных зондов, предусматривающий проведение ПЦР с использованием специально подобранных праймеров (прямого 5'-CCAGTGGCTGATACACCAGA-3' и обратного 5'-GGAAGACACTTACGCATTCCA-3') и зондов c флуорофорами (T-аллель-специфичного флуоресцентно-меченого зонда 5'-(FAM)CCATCTAGТGCCCCTAGCT(RTQ1)-3' и C-аллель-специфичного флуоресцентно-меченого зонда 5'-(ROX) CCATCTAGСGCCCCTAGCT(BHQ2)-3') в амплификаторе с детекцией флуоресценции. Изобретение позволяет расширить арсенал способов генотипирования полиморфных вариантов гена HSPA4, отличается простотой, точностью. 1 ил.

Способ генотипирования полиморфного локуса rs13161158 (T>C) гена HSPA4 у человека методом ПЦР в режиме «реального времени» с применением аллель-специфических флуоресцентных зондов, отличающийся тем, что идентификацию аллельных вариантов rs13161158 (T>C) гена HSPA4 осуществляют с использованием прямого праймера rs13161158 5'-CCAGTGGCTGATACACCAGA-3' (SEQ ID NO: 1), обратного праймера rs13161158 5'-GGAAGACACTTACGCATTCCA-3' (SEQ ID NO: 2), rs13161158-T-аллель-специфичного флуоресцентно-меченого зонда 5'-(FAM)CCATCTAGТGCCCCTAGCT(RTQ1)-3' (SEQ ID NO: 3), rs13161158-C-аллель-специфичного флуоресцентно-меченого зонда 5'-(ROX) CCATCTAGСGCCCCTAGCT(BHQ2)-3' (SEQ ID NO: 4).