Способ заключения гистологических срезов в нелюминесцирующую прозрачную среду Российский патент 2024 года по МПК G01N1/28 

Изобретение относится к медицине и биологии и может быть использовано при изготовлении гистологических препаратов в лабораторных условиях.

Известна наиболее часто применяемая для заключения гистологических препаратов прозрачная среда бальзам (канадский, пихтовый, сибирский кедровый), представляющая собой раствор смол хвойных деревьев в ксилоле (Микроскопическая техника руководство для врачей и лаборантов. Под ред. Д.С. Саркисова и Ю.Л. Перова. – Москва: «Медицина». – 1996. – C. 60.). Эта среда имеет ряд существенных технологических недостатков, а именно:

1) растворителем канадского бальзама является ксилол, поэтому для заключения препарата в канадский бальзам его следует провести через ряд спиртов восходящей крепости и ксилол для того, чтобы в срезах не оставалось следов спирта, который вызывает помутнение бальзама, даже если в препарате присутствует менее 1,6% остаточной воды – это сильно замедляет скорость гистологического исследования;

2) растворитель ксилол является токсичным и пожароопасным веществом является производственно вредным и токсичным для человека веществом (Паспорт безопасности ГОСТ 30333-2007 Ксилол (изомеры) ≥97%, для синтеза);

3) основным компонентом смол хвойных деревьев (бальзама) являются терпены, в силу своего химического строения способные к индуцированному ультрафиолетом свечению в видимой желто-зеленой области в широком диапазоне от 440 до 600 нм (Donaldson L., Williams N. Imaging and Spectroscopy of Natural Fluorophores in Pine Needles // Plants. 2018. 7, 10; 16 p. doi:10.3390/plants7010010; Desaulniers Brousseau V., Wu B-S., MacPherson S., Morello V., Lefsrud M. Cannabinoids and Terpenes: How Production of Photo-Protectants Can Be Manipulated to Enhance Cannabis sativa L. Phytochemistry // Front. Plant Sci. 2021. No 12. P. 620021. doi: 10.3389/fpls.2021.62002) – это исключает возможность люминесцентного исследования готовых гистологических препаратов, поскольку паразитная люминесценция бальзама скрывает естественную или вызванную люминесценцию гистологического препарата.

Известно применение в гистологии в качестве прозрачной среды для заключения гистологических срезов природной смеси арабиногалактанов (гуммиарабик). Арабиногалактаны, в том числе, имеющие происхождение из камедной акации, используются как флуоресцентные метки для выявления малых количеств искомых белков (Zhang M., Nilsson L., Lee S., Choi J. Modification of EDC method for increased labeling efficiency and characterization of low-content protein in gum acacia using asymmetrical flow field-flow fractionation coupled with multiple detectors // Anal. Bioanal. Chem. 2021. Vol. 413, no 25):6313-6320. doi: 10.1007/s00216-021-03587-y.). Поэтому при люминесцентной микроскопии гуммиарабик является источником вызванной флуоресценции в видимом диапазоне и скрадывает индуцированную люминесценцию или флуюоресценцию исследуемых гистологических препаратов.

Известно использование в гистологии в качестве прозрачной среды желатина (Микроскопическая техника руководство для врачей и лаборантов. Под ред. Д.С. Саркисова и Ю.Л. Перова. – Москва: «Медицина». – 1996. – C. 38.). Желатин, как белок, содержащий циклические аминокислоты (фенилаланин, триптофан, гидроскипролин), также способен к широкополосной индуцированной люминесценции (Kasha M. On the Properties of Gelatin-Dye Phosphors and the Continuum Theory of Szent-Gyorgyi // Science. – 1948. – Vol. 107, no 2787. – P. 566-567. doi: 10.1126/science.107.2787.566-a.), по этой причине прозрачные среды на основе желатина не могут быть использованы в люминесцентной микроcкопии.

Известен ряд нелюминесцирующих прозрачных сред для заключения гистологических препаратов на основе полистирола (Микроскопическая техника руководство для врачей и лаборантов. Под ред. Д.С. Саркисова и Ю.Л. Перова. – Москва: «Медицина». – 1996. – C. 40; Барштейн Р.С., Кириллович В.И., Носовский Ю.Е. Пластификаторы для полимеров. – М., – 1982, С. 200; http://biooptics.narod.ru/documents/polystyrene_for_histology.html;

http://invert.bio.msu.ru/images/Presentations/Gebruk_meth_lab_inv.pdf) . Их общими недостатками являются:

- использование ксилола (или толуола) как растворителя, вследствие высокой летучести которого и таких компонентов как диметилфталат или другие пластификаторы (бутилфталат) существует необходимость частого добавления растворителя, что нарушает равновесие между концентрациями ксилола и пластификаторов;

- большое количество исходных материалов;

- длительное время приготовления рабочего раствора;

- пленка полистирола легко отделяется от предметного стекла;

- довольно высокая стоимость от 2500 до 3628 руб. за 1000 мл;

-не предусматривается использование покровного стекла, что снижает устойчивость препарата к внешним воздействиям, то есть страдает объективность морфологических изменений в срезе;

- необходимость хранения без доступа прямых солнечных лучей;

- нефро- и нейротоксичность;

- со временем полистирол становится хрупким, в плёнке появляются трещины, что затрудняет микроскопическое исследование и совершенно неприемлемо для микросъемки.

Известен состав для заключения гистологических препаратов, включающий синтетическую смолу, растворитель и вспомогательный компонент. В качестве смолы берут пенополиуретан (ППУ), в качестве растворителя – ксилол и вспомогательного компонента – дибутилфталат при следующем соотношении ингредиентов, мас.%: пенополиуретан 15-20; ксилол 79-84; дибутилфталат 1,0 (Патент РФ RU 2499988 МПК G01N 1/28 (2006.01) Состав для заключения гистологических препаратов. Авторы Сентюрова Л.Г., Глушко А.М., Шерышева Ю.В. Патентообладатель(и): Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Астраханская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (ГБОУ ВПО АГМА Минздравсоцразвития России). Дата подачи заявки: 17.07.2012. Опубликовано: 27.11.2013 Бюл. № 33.). Основные недостатки этого состава также связаны с наличием в смеси ксилола, комплекс недостатков которого описан выше. Полиуретан также быстро высыхает и растрескивается. Кроме того, полиуретан флуоресцирует на длине 420 нм (Allen N.S., Homer J., McKellar J.F. Origin and role of the luminescent species in the photo-oxidation of commercial polypropylene // Applied Polymer. 1977, Vol. 21, no 8. С. 2261-2267. https://doi.org/10.1002/app.1977.070210823) разрешения Королевского химического общества, Лондон), и поэтому его используют для создания флуоресцирующих красок для дорожных покрытий или творческих целей, добавляя в полиуретан дополнительные флуоресцирующие пигменты.

Цианоакрилат широко используется в оптике для изготовления составных клеёных линз и светофильтров, поскольку после полимеризации образует тонкую прозрачную бесцветную плёнку с показателем преломления – 1,49 [Каталог WEICON 1-компонентные клеи и герметики / www/adhesive-finder.com], что очень близко к показателю преломления стекла – 1,5, используемого для приготовления предметных и покровных стёкол [ГОСТ 111-2014 Межгосударственный стандарт стекло листовое бесцветное]. Цианоакрилат продаётся в готовом для использования виде. Клея на основе цианоакрилата не теряют клеящих свойств в диапазоне температур от –60 до +80°С. Кратковременно допустима эксплуатация при –200 – +300°С, с сохранением свойств. Цианоакрилатные клеи при полимеризации выделяют токсичные пары, поэтому работать с ними необходимо под вытяжкой, тем не менее, клей не считается ядовитым. Полимеризированный цианоакрилат обладает хорошей биологической совместимостью и не содержит токсичных веществ. Считается, что клеи на основе цианоакрилата не горючи (точка горения 80°С, точка кипения выше 200°С). В медицине цианоакрилат применяется для трансплантации кожи [https://alshar.ru/osnovnyye-svoystva-i-pravila-raboty-s-tsianokrilatnym-kleyem/]. Учитывая физико-химические и биологические свойства цианоакрилата, он может быть использован в гистологии как нелюминесцирующая прозрачная среда для заливки гистологических срезов.

Наиболее близким известным аналогом применения цианоакрилата в гистологии в качестве клея является прикрепление свежеизготовленных замороженных срезов почки, после накопления в этом органе парааминогиппурата-I¹³¹, что препятствовало сморщиванию среза в результате высыхания и изменению нативных морфологических взаимоотношений ультрамикроструктур почки, вызываемого сморщиванием, а также намоканию фотоэмульсии фотографических пластинок после прикрепления клейкой лентой стёкол со смонтированными на них срезами, так, что срезы, закреплённые цианоакрилатом непосредственно прилегали к фотоэмульсионному слою фотопластинки для уменьшения размерных дефектов, вызванных боковым разлётом радиоактвиных частиц. (R. P. Wedeen and H. I. Jernow, Am. J. Physiol., Vol. 214, p. 776 (1968). В данном случае после проявления фотопластинок авторы получали радиоавтографическую картину распределения парааминогиппурата-I¹³¹ в ультрамикроструктурах почки (клубочковый и канальцевый аппарат и сосуды почек), но не использовали для получения длительно хранящихся гистологических препаратов для исследования методами световой микроскопии, в том числе, люминесцентной.

Техническими результатами использования цианокрилата как прозрачной среды являются: 1) отсутствие собственной люминесценции этой прозрачной среды для заливки гистологических срезов, что позволяет исследовать их любыми методами световой или люминесцентной микроскопии с возможностью получения высококачественных морфологически полностью сопоставимых фотографических фрагментов срезов, что позволяет осуществлять морфологическую оценку одних и тех же участков срезов, сфотографированных при разных источниках освещения гистологических срезов;
2) значительно, минимум на трое суток, сокращает сроки изготовления гистологических срезов в результате создания возможности микроскопии препарата сразу же, после заключения срезов в прозрачную среду цианокрилата, 3) расширение арсенала средств аналогичного назначения.

Технический результат достигается тем, что способ заключения гистологических срезов в нелюминесцирующую прозрачную среду включает нанесение необходимого количества цианоакрилата поверх сухих, или слегка влажных срезов, смонтированных на предметном стекле, после чего их накрывают сухим или слегка влажным покровным стеклом, или укладывают покровное стекло с размещёнными на нем срезами поверх капли цианоакрилата, нанесённой на предметное стекло без срезов, так, чтобы цианоакрилат полностью растёкся тонким слоем под покровным стеклом, сильно прижимают покровное стекло к предметному и микроскопируют методами световой или люминесцентной микроскопии, либо сразу после закрытия покровным стеклом, либо в необходимый момент времени.

Как показал эксперимент, после заключения препарата в среду цианоакрилата и накрытия покровным стеклом с последующим сильным прижиманием, происходит моментальное образование прочной прозрачной бесцветной плёнки, склеивающей стекла. Цвет и плотность окрашивания препарата при этом не меняются (рис. 1-4). Гистологические срезы могут быть как высушенные, так и слегка влажные, поскольку присутствие воды увеличивает скорость полимеризации цианоакрилата. Ультрафиолетовое облучение при исследовании препарата в люминесцентном микроскопе не вызывает дополнительного свечения цианоакрилата в видимом диапазоне. Препарат можно исследовать сразу же после его закрытия покровным стеклом, либо отложить микроскопирование до необходимого периода времени. Цветность препарата не меняется в течение минимум пяти месяцев со дня изготовления препарата при хранении без доступа света. При необходимости, препарат может быть размонтирован путём выдерживания в течение суток в диметилсульфоксиде или диметилформамиде, затем промыт водой и докрашен любым другим способом. Препарат, заключённый в цианоакрилат, не меняет своих тинкториальных свойств в течение минимум пяти месяцев с момента изготовления.

В лабораторных условиях выполнено закрепление гистологических срезов из различных типов тканей и органов (селезенки, почки и др.).

Пример 1

После посмертного взятия в Республиканском бюро судебно-медицинской экспертизы Минздрава Чувашии биологического материала для гистологического и других дополнительных исследований в соответствии с приказом Министерства здравоохранения РФ от 6 июня 2013 г. № 354н «О порядке проведения патолого-анатомических вскрытий» – кусочков массой 50 г селезёнки человека, поражённой амилоидозом, биологический материал был зафиксирован в нейтральном формалине, после чего отмыт, обезвожен и залит в парафин по стандартному протоколу. Полученные парафиновые блоки были нарезаны на парафиновом микротоме и исследованы специалистами в области судебно-медицинской экспертизы на предмет установления патогистологического диагноза. После этого парафиновые блоки были переданы нам для изготовления парафиновых срезов на парафиновом микротоме и дальнейшего гистологического изучения. Для достижения заявленного нами технического результата парафиновые гистологические срезы монтируют на обезжиренные, смазанные смесью белка с глицерином и запечённые предметные стекла, после чего срезы депарафинируют и насыщают водопроводной водой по стандартному гистологическому протоколу и затем окрашивают квасцовым гематоксилином по Караци и эозином, либо любым другим известным способом гистологического окрашивания, по стандартному гистологическому протоколу. На промытые и высушенные или слегка влажные срезы наносят необходимое количество (1-3 капли) цианокрилата (CA-500.200), после чего закрывают сухим или слегка влажным покровным стеклом, так, чтобы цианоакрилат полностью растёкся тонким слоем под покровным стеклом, сильно прижимают покровное стекло к предметному и микроскопируют с помощью светового микроскопа в проходящем свете. Результаты приведены на фиг. 1. Увеличение 10. Препарат селезёнки человека, системный амилоидоз, амилоидоз селезёнки. Характерная структура селезёночных долек не визуализируется. Синусы резко расширены, содержат эритроциты и клетки лимфоцитарно-лимфоидного ряда. В центре среза сосуд мышечного типа с резко утолщёнными tunica adventitia и tunica media, содержит агрегированные эритроциты и клетки лифоцитарного ряда. Справа на пять часов визуализируется утолщённая септа.

Пример 2

После посмертного взятия в Республиканском бюро судебно-медицинской экспертизы Минздрава Чувашии биологического материала для гистологического и других дополнительных исследований в соответствии с приказом Министерства здравоохранения РФ от 6 июня 2013 г. № 354н «О порядке проведения патолого-анатомических вскрытий» – кусочков массой 50 г почки человека, поражённой амилоидной болезнью, биологический материал был зафиксирован в нейтральном формалине, после чего отмыт, обезвожен и залит в парафин по стандартному протоколу. Полученные парафиновые блоки были нарезаны на парафиновом микротоме и исследованы специалистами в области судебно-медицинской экспертизы на предмет установления патогистологического диагноза. После этого парафиновые блоки были переданы нам для изготовления парафиновых срезов на парафиновом микротоме и дальнейшего гистологического изучения. Для достижения заявленного нами технического результата парафиновые гистологические срезы монтируют на обезжиренные, смазанные смесью белка с глицерином и запечённые предметные стекла, после чего срезы депарафинируют и насыщают водопроводной водой по стандартному гистологическому протоколу и затем окрашивают квасцовым гематоксилином по Караци и 1% водным раствором конго красного (Bennhold H., 1922), либо любым другим известным способом гистологического окрашивания, по стандартному гистологическому протоколу. На промытые и высушенные или слегка влажные срезы наносят необходимое количество (1-3 капли) цианокрилата (CA-500.200), после чего закрывают сухим или слегка влажным покровным стеклом, так, чтобы цианоакрилат полностью растёкся тонким слоем под покровным стеклом, сильно прижимают покровное стекло к предметному и микроскопируют с помощью светового микроскопа в проходящем свете. Результаты приведены на фиг. 2. Увеличение 40. Препарат почки человека, системный амилоидоз, амилоидоз почки. Слева визуализируется почечный клубочек. Между капиллярами визуализируется бесструктурная масса, окрашенная оксифильно (конго красный). Структура канальцев не визуализируется. Слева – визуализируется большое число окрашенных базофильно ядер лимфоцитов (лимфоцитарная инфильтрация).

Пример 3

После посмертного взятия в Республиканском бюро судебно-медицинской экспертизы Минздрава Чувашии биологического материала для гистологического и других дополнительных исследований в соответствии с приказом Министерства здравоохранения РФ от 6 июня 2013 г. № 354н «О порядке проведения патолого-анатомических вскрытий» – кусочков массой 50 г почки человека, поражённой амилоидозом, биологический материал был зафиксирован в нейтральном формалине, после чего отмыт, обезвожен и залит в парафин по стандартному протоколу. Полученные парафиновые блоки были нарезаны на парафиновом микротоме и исследованы специалистами в области судебно-медицинской экспертизы на предмет установления патогистологического диагноза. После этого парафиновые блоки были переданы нам для изготовления парафиновых срезов на парафиновом микротоме и дальнейшего гистологического изучения. Для достижения заявленного нами технического результата парафиновые гистологические срезы монтируют на обезжиренные, смазанные смесью белка с глицерином и запечённые предметные стекла, после чего срезы депарафинируют и насыщают водопроводной водой по стандартному гистологическому протоколу и затем окрашивают квасцовым гематоксилином по Караци и 1% водным раствором конго красного (Bennhold H., 1922), либо любым другим известным способом гистологического окрашивания, используемым для люминесцентной микроскопии, по стандартному гистологическому протоколу. На промытые и высушенные или слегка влажные срезы наносят необходимое количество (1-3 капли) цианокрилата (CA-500.200), после чего закрывают сухим или слегка влажным покровным стеклом, так, чтобы цианоакрилат полностью растёкся тонким слоем под покровным стеклом, сильно прижимают покровное стекло к предметному и микроскопируют на люминесцентном микроскопе сразу после закрытия покровным стеклом. Результаты приведены на фиг. 3. Увеличение 20. Препарат почки человека, системный амилоидоз, амилоидоз почки. По центру в почечном клубочке визуализируется люминесценция окрашенных конго красным амилоидных масс, расположенных между петлями капилляров (не окрашены конго красным и потому не визуализированы). Слева внизу на семь часов наблюдается люминесценция конго красного в стенке сосуда, возможно, артериола.

Пример 4

После посмертного взятия в Республиканском бюро судебно-медицинской экспертизы Минздрава Чувашии биологического материала для гистологического и других дополнительных исследований в соответствии с приказом Министерства здравоохранения РФ от 6 июня 2013 г. № 354н «О порядке проведения патолого-анатомических вскрытий» – кусочков массой 50 г почки человека, биологический материал был зафиксирован в нейтральном формалине, после чего отмыт, обезвожен и залит в парафин по стандартному протоколу. Полученные парафиновые блоки были нарезаны на парафиновом микротоме и исследованы специалистами в области судебно-медицинской экспертизы на предмет установления патогистологического диагноза. После этого парафиновые блоки были переданы нам для изготовления парафиновых срезов на парафиновом микротоме и дальнейшего гистологического изучения. Для достижения заявленного нами технического результата парафиновые гистологические срезы монтируют на обезжиренные, смазанные смесью белка с глицерином и запечённые предметные стекла, после чего срезы депарафинируют и насыщают водопроводной водой по стандартному гистологическому протоколу и затем окрашивают 0,1% водным раствором тиофлавина. На промытые и высушенные или слегка влажные срезы наносят необходимое количество (1-3 капли) цианокрилата (CA-500.200), после чего закрывают сухим или слегка влажным покровным стеклом, так, чтобы цианоакрилат полностью растёкся тонким слоем под покровным стеклом, сильно прижимают покровное стекло к предметному и микроскопируют на люминесцентном микроскопе сразу после закрытия покровным стеклом, либо по мере необходимости, но не позже, чем после полного выгорания тиофлавина (обычно пять месяцев при хранении препаратов в темноте). Результаты приведены на фиг. 4. Препарат почки человека, системный амилоидоз, амилоидоз почки. По центру в почечном клубочке визуализируется люминесценция окрашенных тиофлавином амилоидных масс, расположенных между петлями капилляров. Вокруг клубочка визуализируются окрашенные тиофлавином амилоидные депозиты в почечных канальцах.

Пример 5

После посмертного взятия в Республиканском бюро судебно-медицинской экспертизы Минздрава Чувашии биологического материала для гистологического и других дополнительных исследований в соответствии с приказом Министерства здравоохранения РФ от 6 июня 2013 г. № 354н «О порядке проведения патолого-анатомических вскрытий» – кусочков массой 50 г интактной почки человека, биологический материал был зафиксирован в нейтральном формалине, после чего отмыт, обезвожен и залит в парафин по стандартному протоколу. Полученные парафиновые блоки были нарезаны на парафиновом микротоме и исследованы специалистами в области судебно-медицинской экспертизы на предмет установления патогистологического диагноза. После этого парафиновые блоки были переданы нам для изготовления парафиновых срезов на парафиновом микротоме и дальнейшего гистологического изучения. Для достижения заявленного нами технического результата парафиновые гистологические срезы монтируют на обезжиренные, смазанные смесью белка с глицерином и запечённые предметные стекла, после чего срезы депарафинируют и насыщают водопроводной водой по стандартному гистологическому протоколу. На промытые и высушенные или слегка влажные не окрашенные срезы наносят необходимое количество (1-3 капли) цианокрилата (CA-500.200), после чего предметное стекло с высушенными или слегка влажными срезами укладывают поверх цианоакрилата (1-2-3 капли), нанесённого на предметное стекло без срезов и сильно прижимают покровное стекло к предметному и микроскопируют на люминесцентном микроскопе сразу после закрытия покровным стеклом, либо по мере необходимости, но не позже, чем после полного выгорания срезов (обычно пять месяцев при хранении препаратов в темноте). Результаты в зависимости от способа монтажа срезов (сразу на предметное стекло или сначала на покровное) не различаются и приведены на фиг. 5. Индуцированная ультрафиолетом при люминесцентной микроскопии аутолюминесценция среза интактной почки человека. По центру расположен почечный клубочек со слабо люминесцирующими капиллярами, в центре клубочка правильная круглая тень – отверстие (зонд 0,5) в дихроичном зеркале люминесцентного объектива. Вокруг клеточка расположены слабо люминесцирующие эпителиальный клетки почечных канальцев. Слева на девять часов от клубочка – интенсивная аутолюминесценция эпителия почечного канальца. Темные пятна слева на одиннадцать часов и справа на один час от клубочка – просветы артериол. Увеличение 20.

Изобретение относится к медицине и биологии. Раскрыт способ заключения гистологических срезов в нелюминесцирующую прозрачную среду, включающий нанесение 1-3 капли цианоакрилата поверх гистологических срезов, смонтированных на предметном стекле, после чего их закрывают покровным стеклом или укладывают покровное стекло с размещёнными на нем срезами поверх цианоакрилата, нанесённого на предметное стекло без срезов так, чтобы цианоакрилат полностью растёкся под покровным стеклом, прижимают покровное стекло к предметному и микроскопируют методами световой или люминесцентной микроскопии, при этом в качестве цианоакрилата используют СА-500.200. Изобретение обеспечивает отсутствие собственной люминесценции среды для заливки гистологических срезов, сокращение сроков изготовления гистологических срезов и расширение арсенала средств аналогичного назначения. 5 ил., 5 пр.

Способ заключения гистологических срезов в нелюминесцирующую прозрачную среду, включающий нанесение 1-3 капли цианоакрилата поверх гистологических срезов, смонтированных на предметном стекле, после чего их закрывают покровным стеклом или укладывают покровное стекло с размещёнными на нем срезами поверх цианоакрилата, нанесённого на предметное стекло без срезов так, чтобы цианоакрилат полностью растёкся под покровным стеклом, прижимают покровное стекло к предметному и микроскопируют методами световой или люминесцентной микроскопии, при этом в качестве цианоакрилата используют СА-500.200.