СРЕДА ДЛЯ ОТТАИВАНИЯ КРИОКОНСЕРВИРОВАННОЙ СПЕРМЫ КОБЕЛЕЙ Российский патент 2024 года по МПК A61D19/02 

Изобретение относится к ветеринарии и биологии, а именно к направлению репродукции животных, включающей в себя искусственное осеменение и криоконсервацию спермы. Более конкретно, данное изобретение относится к составу сред для оттаивания спермы кобелей.

Существует изобретение, включающее метод искусственного осеменения и разработки сред для разбавления спермы собак при проведении криоконсервации [1]. В данном изобретении подробно описаны методы криоконсервации спермы кобелей, искусственного осеменения сук. Однако в технику оттаивания входит добавление к сперме от 0,3 до 1,5 мас. % раствора натрия хлорида. Недостатками является то, что раствор электролитов, включающий только натрия хлорид, является энергетически бедным с низкой плотностью.

Более богатая среда для оттаивания спермы животных производителей описана в изобретении [2]. Технологический процесс подразумевает к 100 мл раствора для криоконсервации добавляется 30 мг карнитина, а также в составе представлены такие вещества как лактоза, лимонная кислота, трис, глицерин, желток куриного яйца.

Данные среды предназначены для обработки спермы сельскохозяйственных животных. Кроме этого, рН сдвинута в щелочную сторону и в составах сред не учтены видовые особенности гамет псовых и других домашних животных.

В результате процессов криоконсервации - оттаивания, в сперматозоидах происходит ряд метаболических нарушений: накопление внутриклеточного кальция, изменение трансмембранного ионного потока. В связи с утечкой электронов, накопившихся в промежуточных звеньях дыхательной цепи (нуклеиновых кислот, белков и липидов), на клеточные структуры развивается атака активными формами кислорода, которая протекает по механизму свободно-радикального окисления [3], [4]. Свободные радикалы, которые образуются при неполном восстановлении кислорода, негативно влияют на функциональные свойства ферментов, белков, углеводов, в том числе ДНК (дезоксирибонуклеиновой кислоты) и РНК (рибонуклеиновой кислоты), в результате чего гамета теряет свои функции и инициируются деструктивные процессы [5]. Кроме этого, клетки становятся более подвержены прямому повреждающему действию кристаллизации и рекристаллизации [6], [4], [3].

Растворы для оттаивания спермы должны выполнять основные функции: инициировать подвижность спермиев, активировать и поддерживать дыхательную функцию и инактивировать токсическое воздействие криопротекторов.

Задачей предлагаемого изобретения является разработка среды для оттаивания криоконсервированной спермы собак, обладающей способностью стабилизировать их биологическую функцию, сохранять морфологическую структуру, поддерживать подвижность и выживаемость сперматозоидов более длительное время.

Техническим результатом заявленного изобретения является повышение показателей сроков выживаемости и подвижности сперматозоидов после их оттаивания за счет оптимального подбора компонентов среды по массе и объему.

Технический результат достигается за счет следующего состава компонентов среды: NaCl 0,5 г, KCl 0,035 г, MgSO₄ 7H₂O 0,005 г, KH₂PO₄ 0,005 г, CaCl₂ 2H₂O 0,03 г, NaHCO₃ 0,003 г, глюкоза 0,05 г, Na пируват 0,03 г, Na лактат 60% 0,4 г, пенициллин 10000 МЕ, сульфат стрептомицин 0,005 г, «Фенол ред» 5% - 0,02 мл, Canine Serum Albumin (ALB) 0,4 г, Hepes 2 ммоль, таурин 0,001 г и дистиллированная вода до 100 мл.

Оптимальное соотношение компонентов раствора определяли с использованием биологического метода, то есть, по показателям подвижности и выживаемости сперматозоидов после проведения криоконсервации спермы кобеля одним методом с использованием одной среды, а процедуру размораживания проводили в трех различных средах.

Для криоконсервации спермы использовали общепринятую технологию. Гранулы замораживали на сухом льду, соломинки (объемом 0,5 мл) - в парах жидкого азота. Для испытания всех вариантов сред использовали эякуляты от одних кобелей крупной породы, то есть был использован, так называемый метод расщепленного эякулята.

Криоконсервацию проводили двухэтапным методом при использовании растворов CaniRep Uppsala Equex II. Оттаивание криосоломинок проводили на водяной бане при температуре 37°С в течение 1 минуты и последующим смешиванием со средой для оттаивания, подогретой до 37°С. Оттаивание гранул проводили помещением их в небольшой объем раствора (0,5 мл раствора на одну гранулу), подогретый до 37°С, с дальнейшим немедленным помещением пробирки в термостат. Оттаивание проводили в трех растворах: среда патентуемая, Thaw Medium Uppsala Equex II и среда RU 2393816, C1 A61D 19/02.

Оценку спермы проводили методом микроскопии с использованием подогревающего столика. Временные интервалы после оттаивания были выбраны следующие: 20 минут, 1 час, 6 часов. Все образцы оттаянной спермы находились в термостате при температуре 38°С. Подсчитывали процент подвижных сперматозоидов с прогрессивным поступательным движением, табл. 1

Также, учитывая, что сперма кобелей консервируется и перевозится небольшими объемами, патентуемую среду есть возможность отправлять в тех же условиях и в том же температурном режиме, что и саму сперма. Для этого, мы проводили криоконсервацию патентуемый среды в объеме 0,5 мл в пробирке типа Эппендорф для оценки перспективы одновременной транспортировки среды со спермой кобеля (таблица испытаний №2).

Таким образом, из эксперимента следует, что заявляемое изобретение по сравнению с другими известными средами обладает рядом преимуществ, а именно:

- при оттаивании получено большее количество подвижных сперматозоидов;

- более длительная выживаемость сперматозоидов после оттаивания в температурном режиме, приближенном к физиологической температуре репродуктивных органов самки;

- среда может подвергаться криоконсервации без потери качеств, что дает возможность к ее длительному хранению;

- дает возможность одновременного хранения и транспортировки среды для оттаивания со спермой кобеля.

Пример осуществления изобретения: для проведения процедуры искусственного осеменения поступила криоконсервированная сперма кобеля (породы американская акита, возраст 2 года) в количестве одной дозы, расфасованная в 4 криосоломинки, объемом по 0,5 мл (общий объем дозы 2 мл). В приложенном сертификате, заявленные показатели спермы при оттаивании были следующие: концентрация - 208 млн/мл, процент подвижных сперматозоидов после оттаивания - 59. Была проведена ее разморозка в термобане при 37°С в течение 60 секунд. Далее, содержимое двух соломинок вылили в пробирку типа Эппендорф с патентуемой средой в объеме 1 мл и содержимое двух соломинок вылили в пробирку типа Эппендорф со средой для оттаивания Thaw Medium Uppsala Equex II в объеме 1 мл. Через 15 минут произвели оценку размороженной спермы. Показатели подвижности сперматозоидов были следующие: при оттаивании в патентованной среде - 79%, при оттаивании в среде Thaw Medium Uppsala Equex II - 57%. В результате мы получили увеличение процента подвижных сперматозоидов при оттаивании в патентуемой среде, соответственно, во всей спермадозе, что дает больше шансов успешного оплодотворения.

Список литературы

1. Пат. RU 2259809 С2 Российская Федерация, МПК A61D 19/02 Композиция для замораживания спермы собак / Сон Хва Суб; заявитель и патентообладатель Сон Хва Суб (KR); заявл. 26.04.2000; опубл. 10.09.2005; начало действия: 26.04.2000 - 8 с.

2. Пат. RU 2393816 С1 Российская Федерация, МПК A61D 19/02 СПОСОБ ПОДГОТОВКИ СПЕРМЫ ЖИВОТНЫХ-ПРОИЗВОДИТЕЛЕЙ К ЕЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЮ/ Алфимцев Николай Афанасьевич (RU), Алфимцев Владимир Николаевич (RU), Букреев Юрий Михайлович (RU) Иванов Геннадий Павлович (RU); заяв. и патентообладатель Алфимцев Николай Афанасьевич (RU), Алфимцев Владимир Николаевич (RU), Букреев Юрий Михайлович (RU) Иванов Геннадий Павлович; заявл. 17.02.2009; опубл. 10.07.2010; начало действия: 17.02.2009 - 6 с.

3. Erdem Öztürk A. et al. Cryobiology and Cryopreservation of Sperm // Cryopreservation - Current Advances and Evaluations. IntechOpen, 2020.

4. Kim S.-H., Yu D.-H., Kim Y.-J. Effects of cryopreservation on phosphatidylserine translocation, intracellular hydrogen peroxide, and DNA integrity in canine sperm // Theriogenology. 2010. Vol. 73, №3. P. 282-292.

5. Sicherle C.C. et al. Effects of the cryopreservation process on dog sperm integrity // Anim. Reprod. 2020. Vol. 17, №1.

6. Khan I.M. et al. Impact of Cryopreservation on Spermatozoa Freeze-Thawed Traits and Relevance OMICS to Assess Sperm Cryo-Tolerance in Farm Animals // Front. Vet. Sci. 2021. Vol. 8.

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к направлению репродукции животных, включает в себя искусственное осеменение и криоконсервацию спермы. Среда для оттаивания криоконсервированной спермы кобелей включает: NaCl 0,5 г, KCl 0,035 г, MgSO₄ 7H₂O 0,005 г, KH₂PO₄ 0,005 г, CaCl₂ 2H₂O 0,03 г, NaHCO₃ 0,003 г, глюкозу 0,05 г, пируват натрия 0,03 г, лактат натрия 60% 0,4 г, пенициллин 10000 МЕ, сульфат стрептомицина 0,005 г, «Фенол ред» 5% - 0,02 мл, Canine Serum Albumin (ALB) 0,4 г, Hepes 2 ммоль, таурин 0,001 г и дистиллированную воду до 100 мл. Изобретение позволяет повысить показатели сроков выживаемости и подвижности сперматозоидов после их оттаивания за счет оптимального подбора компонентов среды по массе и объему. 2 табл.

Среда для оттаивания криоконсервированной спермы кобелей, включающая NaCl 0,5 г, KCl 0,035 г, MgSO₄ 7H₂O 0,005 г, KH₂PO₄ 0,005 г, CaCl₂ 2Н₂О 0,03 г, NaHCO₃ 0,003 г, глюкозу 0,05 г, пируват натрия 0,03 г, лактат натрия 60% 0,4 г, пенициллин 10000 МЕ, сульфат стрептомицина 0,005 г, «Фенол ред» 5% - 0,02 мл, Canine Serum Albumin (ALB) 0,4 г, Hepes 2 ммоль, таурин 0,001 г и дистиллированную воду до 100 мл.