СИНТЕТИЧЕСКАЯ СРЕДА ДЛЯ РАЗБАВЛЕНИЯ И ЗАМОРАЖИВАНИЯ СПЕРМЫ БАРАНОВ Российский патент 2003 года по МПК A61D19/02 

Изобретение относится к области сельского хозяйства, в частности к искусственному осеменению сельскохозяйственных животных, например овец.

Известно, что в устойчивости сперматозоидов к замораживанию первостепенную роль играют прочность и характер межмолекулярных связей белков и липидов, водородные связи мембран.

При замораживании вследствие фазового перехода воды и липидов происходит нарушение этих связей, окисление Н-групп. Это приводит к дестабилизации мембранных белков, потере и инактивации ферментов, переокислению липидов и нарушению метаболизма. Этому способствует также предшествующее замораживанию разбавление нативной спермы, ведущее к существенному уменьшению концентрации химических веществ плазмы спермы.

Известны среды для разбавления и замораживания спермы баранов, включающие в свой состав дисахара (сахароза, лактоза), полисахариды (декстрин), желток куриного яйца, трис-(оксиметил)-аминометан, трилон-Б, гуммиарабик, глицерин [1, 2, 3].

Однако эти среды не обладают достаточным криозащитным действием из-за отсутствия в их составе специализированных ингредиентов, способных эффективно структировать воду вокруг сперматозоидов. Это приводит к образованию кристаллов льда, разрушающих целостность мембран, снижению активности сперматозоидов.

Наиболее близка по технической сущности к предлагаемой среде ГЖУК-трис-буферная среда для разбавления и замораживания спермы баранов: вода дистиллированная - 100 см³, лактоза - 8,4 г, декстрин кукурузный - 5 г, ксилит - 0,26 г, трис-(оксиметил)-аминометан -0,105 г, трилон-Б - 0,135 г, глицерин - 6,0 см³, желток куриного яйца - 20 см³ [2].

Однако эта среда не обладает достаточным холодозащитным действием, т. к. декстрин, являющийся полисахаридом и основным экстрацеллюлярным криопротектором, недостаточно эффективно структурирует околоклеточную воду и особенно ту, которая входит в состав мембран сперматозоидов, слабо воздействует на снижение электрической точки кристаллизации солей в растворах.

Целью изобретения является повышение эффективности синтетической среды. При разработке лучшей синтетической среды мы использовали более эффективный натуральный экстрацеллюлярный криопротектор животного происхождения, который лучше декстрина (полисахарида) нейтрализует вредное воздействие на сперматозоиды глубокого замораживания.

Цель достигается за счет увеличения продолжительности сохранения биологической полноценности сперматозоидов барана после криоконсервации вследствие структурирования воды вокруг спермиев, обезвоживания клеток, снижения электрической точки замерзания воды и кристаллизации солей.

Сущность изобретения заключается в использовании костного клея (ГОСТ 2067-80) - коллагена, сложного белкового образования, относящегося к группе склеропротеидов.

Для костного клея (коллагена) характерно высокое содержание протеидов: глицина (26%), пролина (14%), оксипролина (12%) и 2% полисахаридов [4].

Костный клей, имея высокий молекулярный вес - 300000, при включении в состав сред существенно не изменяет осмотическое давление даже при значительных (20-25%) концентрациях. В водных растворах костный клей хорошо поглощает воду, образует несколько видов гелей [4].

Эти свойства хорошо объясняют его роль в регуляции водного обмена различных соединений.

Пример приготовления среды.

В чистую химическую колбу вносят по рецепту лактозу, костный клей, ксилит, трис-(оксиметил)-аминометан, трилон-Б, глицерин. Заливают прокипяченной дистиллированной водой (+80)-(+90^oС) и полностью растворяют все компоненты. Затем раствор охлаждают до 40^oС, вносят туда желток куриного яйца, тщательно размешивают и вносят антибиотики.

Свежеприготовленная среда перед разбавлением спермы должна исследоваться по внешнему виду, цвету, периодически по показателю рН и осмотическому давлению.

Предлагаемая синтетическая среда по физико-химическим свойствам должна отвечать следующим требованиям: внешний вид - однородная эмульсия, без осадка и механических примесей; цвет - желто-серый, без запаха; рН при температуре 20^oС - 6,8±0,15; осмотическое давление среды без глицерина при температуре 0^oС - 10,0±0,5 атм.

Приготовленную среду используют для разбавления спермы в течение 4 ч с момента приготовления. Хранят при температуре 0 -(+ 4)^oС, перед употреблением нагревают до 28-30^oС.

При использовании среды к одному объему спермы добавляют 2-3 объема среды, в зависимости от концентрации сперматозоидов.

Предлагаемая среда имеет более высокие протективные свойства в сравнении с прототипом и повышает биологическую полноценность спермы при криоконсервации и оттаивании. Подвижность сперматозоидов при оттаивании после криоконсервации (-196^oС) составляет 4-5±0,04 балла, а абсолютный показатель выживаемости при 0^oС составляет 374+12,3 условных единиц, против соответственно - 4,2 балла и 315 условных единиц в контроле (прототип).

Защитное действие костного клея в составе сконструированной синтетической среды проявляется в том, что, являясь природным поверхностно-активным веществом, он адсорбируется на поверхности сперматозоидов и как биологический полимер выполняет роль криопротектора - способствует обезвоживанию сперматозоидов, поглощению и витрификации воды непосредственно вокруг них, предохраняет сперматозоиды от соприкосновения с кристаллами льда, значительно снижает эвтектическую точку солей.

Таким образом, его защитное действие более направленное, чем у других криопротекторов (гуммиарабик, декстрин и др.). Предлагаемая среда позволит повысить биологическую полноценность спермиев после криоконсервации и оттаивания (активность - на 6,8%, абсолютный показатель выживаемости - на 15,4%), а также увеличить оплодотворяемость овцематок на 10,5% по сравнению с контролем (среда с декстрином).

Оптимальная концентрация костного клея в составе ГЖУК-трис-буферной среды была установлена в лабораторных опытах, проведенных во ВНИИплем, научно-производственные опыты по изучению эффективности новой среды были проведены в овцеводческом спецхозе им. Ватутина Шебекинского района Белгородской области.

Пример 1. Сперму для исследований получали с помощью искусственной вагины от взрослых баранов. В каждом эякуляте определяли его объем, подвижность и концентрацию сперматозоидов в соответствии с методическими рекомендациями (1).

Для изучения криозащитных свойств костного клея в составе ГЖУК-трис-буферной среды без декстрина разбавленную сперму баранов расфасовывали в пронумерованные пробирки и вместе с контрольным образцом подвергали эквилибрации (охлаждению) в течение 2-х ч при температуре (+2)-(+4)^oС. Далее, сперму замораживали на фторопластовой пластине в парах жидкого азота, в лунках по 0,2 мл.

Для биологического контроля подопытных образцов замороженную сперму оттаивали в 3-х процентном растворе цитрата натрия при 42^oС, затем определяем подвижность сперматозоидов через каждый час до полной их гибели. Абсолютный показатель выживаемости сперматозоидов определяли при температуре инкубации +38^oС. Данные исследований криозащитных свойств костного клея (коллагена) в составе среды на сперматозоиды барана показаны в табл. 1.

Проведенные исследования показали (табл. 1), что самые высокие результаты после оттаивания криоконсервированной спермы были получены в 3-й группе, при содержании 2,5 г костного клея в 100 мл ГЖУК-трис-буферной среды: подвижность - 4,54 балла, абсолютный показатель живучести 354 у. е. Это выше, чем имели в контрольной группе, соответственно на 8% и 26%.

Полученная в пользу опыта разница статистически высоко достоверна при значениях td₁= 8,l и td₂=3,9. Таким образом, проведенные исследования показали, что криозащитные свойства предлагаемого протектора - костного клея - выше, чем у декстрина (контроль), по подвижности на 8%, а по абсолютному показателю выживаемости - на 26%.

Пример 2. Синтетическая ГЖУК-трис-буферная среда с предлагаемым криопротектором - костным клеем была испытана в научно-производственном опыте на предмет изучения оплодотворяющей способности криоконсервированной спермы баранов.

Результаты этих исследований представлены в таблице 2.

Проведенные научно-производственные опыты по искусственному осеменению овец (табл. 2) свидетельствуют о более высокой оплодотворяющей способности спермы, замороженной в ГЖУК-трис-буферной среде с костным клеем, где подвижность сперматозоидов была равна 4,5 балла, выживаемость - 374 у. ед., а оплодотворяющая способность - 55,3%. Это выше, чем в контрольной, соответственно на 7,0%, 18,7% и 10,5%.

Таким образом, применение в составе ГЖУК-трис-буфкрной среды предлагаемого криопротектора - костного клея обеспечивает при криоконсервации спермы баранов повышение биологической полноценности сперматозоидов после оттаивания (по подвижности на 7%; абсолютному показателю выживаемости - на +18,7%) и повышение оплодотворяющей способности спермы при искусственном осеменении овец - на 10,5%.

Источники, принятые во внимание
1. Методические рекомендации по технологии взятия, глубокого замораживания и использования спермы баранов-производителей при искусственном осеменении овец. М., 1986.

2. Наставление по применению ГЖУК-трис-буферной среды для разбавления, замораживания, хранения и использования спермы баранов-производителей. ВНИИплем, Лесные поляны, 1992.

3. Патент 2028796, Бюллетень 33, 1995. Синтетическая среда для замораживания спермы баранов.

4. Большая медицинская энциклопедия. 1985.

Изобретение относится к животноводству и может быть использовано при искусственном осеменении баранов. Среда содержит, мас.%: лактоза 6,0, костный клей 1,8, ксилит 0,18, трис-(оксиметил)-аминометан 0,07, трилон Б 0,1, глицерин 4,3, желток куриного яйца 14,2, вода дистиллированная - до 100. Среда позволяет повысить биологическую полноценность спермиев после криоконсервации и оттаивания. 2 табл.

Синтетическая среда для разбавления и криоконсервации спермы баранов, включающая лактозу, ксилит, трис-(оксиметил)-аминометан, трилон-Б, глицерин, желток куриного яйца, дистиллированную воду, отличающаяся тем, что среда дополнительно содержит костный клей при следующем соотношении ингредиентов, мас. %: лактоза 6,0, костный клей 1,8, ксилит 0,18, трис-(оксиметил)-аминометан 0,07, трилон-Б 0,1, глицерин 4,3, желток куриного яйца 14,2, вода дистиллированная до 100.