СПОСОБ ВЫРАЩИВАНИЯ ОБОГАЩЕННОГО АНТОЦИАНАМИ ЛИСТОВОГО САЛАТА Российский патент 2025 года по МПК A01C1/06 A01H3/02 A01G22/15 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в овощеводстве для обогащения листового салата антоцианами при выращивании в закрытых агроэкосистемах.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Салат листовой (Lactuca sativa L.) является одной из наиболее важных овощей в мире благодаря быстрому росту и коммерческой ценности, которая высоко ценится за питательные качества, низкую калорийность, высокое содержание волокон и как источник полезных биологически активных соединений [Song et al. 2020]. Актуальным является разработка способов обогащения растительной продукции питания, включая листовой салат, функциональными соединениями для профилактики и лечения заболеваний. В качестве компонентов функционального питания активно исследуются различные биологически активные соединения, среди которых особое внимание привлекают антоцианы [Yudina et al. 2021]. Антоцианы обладают антиоксидантной и антиканцерогенной активностью, противомикробными свойствами, полезны для здоровья глаз и профилактики метаболических, сердечно-сосудистых и нейродегенеративных заболеваний [Yudina et al. 2021].

Факторы окружающей среды в период выращивания оказывают прямое влияние на рост, урожайность и качество растений. Свет - ключевой фактор и важнейший элемент, ответственный за широкий спектр сигналов и информации для морфогенеза и многих других физиологических процессов, включая питание растений, биосинтез и накопление фитохимических соединений [Lastochkina et al. 2022]. Однако, реакция растений на свет различается в зависимости от условий освещения, времени года, генотипа, методов выращивания и многих других факторов [Kozai, Niu 2016]. Процессы фотосинтеза и биосинтеза пигментов, включая антоцианы, также чувствительны ко всем аспектам освещения. Быстрое развитие технологий освещения с использованием светоизлучающих диодов (LED) привело к увеличению применения этой технологии для освещения в закрытых садоводческих системах [Lastochkina et al. 2022]. Системы LED освещения имеют важные преимущества перед традиционным освещением (люминесцентными или натриевыми лампами) благодаря своему спектральному составу, долговечности, специфике длины волны, низкому тепловому излучению и энергоэффективности. Кроме того, в системах выращивания растений, светодиоды позволяют модифицировать спектр в соответствии с требованиями разных видов растений.

Направленная регуляция роста и развития растений также возможна за счет инокуляции полезными рост-стимулирующими эндофитными бактериями Bacillus subtilis - общепризнанными как безопасные для применения в пищевой промышленности [Lastochkina et al. 2022]. В научной литературе имеются сведения о положительном влиянии эндофитов B. subtilis на рост, урожайность разных видов растений и их качество (включая накопление антоцианов, витаминов, макро- и микроэлементов) посредством множества прямых и опосредованных механизмов [Lastochkina et al. 2022; Pusenkova et al. 2023]. Имеются данные о положительном влиянии на ростовые параметры растений салата при отдельном применении B. subtilis [Kalhor et al. 2018] и разных спектров света [Esmaili et al. 2020]. На примере цветочных культур показан положительный синергетический эффект применения B. subtilis в сочетании с разными LED спектрами света [Реут и др. 2023]. Исходя из вышеизложенного можно ожидать, что применение эндофитных бактерий B. subtilis в сочетании с LED спектрами света окажутся эффективными для выращивания листового салата с повышенным содержанием антоцианов.

В настоящее время существуют способы выращивания листового салата в закрытых агроэкосистемах. Известен способ повышения урожайности и качества салата листового в замкнутых агробиосистемах [патент РФ № 2705318, опубл. 06.11.2019], при котором используют биопрепарат Нива (экстракт гуминовых кислот, выделенных из вермикомпоста), содержащий ряд микроорганизмов, гумусовые компоненты и комплекс микро- и макроэлементов. Основной способ его использования некорневая подкормка в количестве 5 об.% водного раствора однократно в период вегетации в качестве некорневой подкормки на 18-20 день вегетации растений. Показано увеличение продуктивности листьев и некоторых показателей качества (содержание свинца, кадмия, общей антиоксидантной активности, витаминов группы В). Недостатком данного способа является предварительная организация процесса вермикомпостирования, получение из вермикомпоста препарата Нива и применение препарата на поздних стадиях выращивания растений в гидропонике. Нет данных об использованном освещении и о содержании в продукции фенольных соединений, включая антоцианы.

Известен способ выращивания салата листового в закрытой агроэкосистеме [патент РФ № 2 791 555, опубл. 10.03.2023], заключающийся в культивировании растений в климатической камере с фотопериодом 12 часов свет/12 часов темнота, при температуре 20-22°С днем/15-17°С ночью, с использованием культуры навозных (компостных) червей Eisenia fetida, вносимых в субстрат (12-36 штук/кг) спустя неделю после приготовления; а через неделю после внесения червей высевают семена салата. Состав субстрата: раскисленный до рН 7.0 комплексный верховой торф с влажностью 80% смешанный со свежим бесподстилочным навозом крупного рогатого скота с влажностью 80-90% в соотношении 9:1. Источником света в климатической камере является люминесцентная лампа белого теплого света с интенсивностью освещения 87 мкмоль квантов/м²⋅с. Недостатком данного способа является трудоемкость предварительной подготовки и внесения Eisenia fetida в субстрат, использование люминесцентной лампы, которая уступает по эффективности и энергозатратам LED лампам. Не оценивались показатели качества продукции (только урожайность).

Вышеизложенные способы выращивания листового салата в основном сосредоточены на повышении урожайности растений путем обработки макро-микроэлементами, применения дождевых и навозных (компостных) червей, органических удобрений и биопрепаратов на основе микроорганизмов (но не эндофитных B. subtilis) и без уделения внимания освещению. Способы обогащения листового салата антоцианами с применением эндофитных бактерий B. subtilis в сочетании с LED освещением не описывались.

ЦЕЛЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Целью изобретения является разработка экологического и низкозатратного способа, позволяющего всесезонного выращивать растения листового салата и получать продукцию с повышенным содержанием антоцианов путем совместного использования бактерий-эндофитов B. subtilis и LED освещения в закрытых агроэкосистемах.

Поставленная задача решается предпосевной обработкой семян эндофитными бактериями B. subtilis 10-4 с последующим выращиванием растений салата под светодиодными лампами с красно-синим спектром света.

РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Для решения поставленной задачи в способе выращивания обогащенного антоцианами листового салата, включающему обработку семян перед посевом суспензией эндофитных бактерий Bacillus subtilis 10-4 в концентрации 10⁵ колониеобразующих единиц (КОЕ)/мл в течение 1 часа и выращиванием растений под светодиодными лампами с красно-синим спектральным составом света, достигаются наибольшие показатели накопления антоцианов в листьях.

Согласно предложенному способу, семена перед посевом раскладываются в марлю и стерилизуются путем погружения на 2 мин в 70% этиловый спирт, промываются стерильной водой 3-4 раза. Далее семена погружаются в суспензию B. subtilis 10-4 в концентрации 10⁵ KOE/мл на 1 час, затем семена подсушиваются при комнатной температуре и рассеваются в пластиковые контейнеры с почвогрунтом (влажностью 65%) на глубину 1-1.5 см. Засеянные семенами контейнеры ставятся для выращивания в контролируемые условия под светодиодные (LED) лампы с красно-синим (КС) спектром [70% красный (600-700 нм) + 30% синий (460 нм)], интенсивностью освещения 250±10 мкмоль м^-2с^-1, фотопериодом 12 час свет/12 час темнота, температурой воздуха 20-22°C, относительной влажностью воздуха 60±5%. Полив растений производится водой 2 раза в неделю и через день производится опрыскивание водой через пульверизатор.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На фигуре приведены репрезентативные фотографии влияния эндофитных бактерий Bacillus subtilis 10-4 и светодиодного освещения с красно-синим, красным, белым спектральным составом и люминесцентного дневного освещения на внешний вид растений салата в момент сбора урожая.

ПРИМЕР ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Пример иллюстрирует действие на накопление антоцианов в растениях салата сочетания эндофитных бактерий B. subtilis 10-4 и LED освещения с разным спектральным составом (красный, красный+синий, белый). Опыты проводились на растениях листового салата (Lactuca sativa) с антоциановой окраской среднеспелого сорта Кармен в лаборатории молекулярных механизмов устойчивости растений к стрессам ИБГ УФИЦ РАН.

Бактериальный штамм. Эндофитный бактериальный штамм В. subtilis 10-4 был ранее выделен из пахотного слоя почв Республики Башкортостан, детально охарактеризован [Lastochkina et al. 2017; 2021], идентифицирован и депонирован в БРЦ ВКПМ (рег. № В-12988 от 23.06.2019 г.), полногеномная последовательность депонирована в DDBJ/ENA/GenBank (рег. № JAVHKX0000000000). Штамм B. subtilis 10-4 безопасен для применения в пищевой промышленности, продуцирует ауксины, сидерофоры, фиксирует атмосферный азот, колонизирует внутренние ткани растений (эндофит), оказывает рост-стимулирующее и антистрессовое влияние на растения в условиях биотических (Lastochkina et al. 2020) и абиотических [Lastochkina et al. 2017; 2021] стресс-факторов среды.

Приготовление бактериального инокулюма. Для получения инокулюма штамм B. subtilis 10-4 культивировали на среде Луриа-Бертани (ЛБ) (1.0% триптон, 0.5% дрожжевой экстракт, 0.5% NaCl, pH 7.5) при 37°С, 180 об/мин в течение 24 часов (до достижения концентрации 10⁸ KOE/мл) и разбавляли стерильной водой до концентрации 10⁵ КОЕ/мл, отобранной ранее в качестве оптимальной в стимуляции роста и защите растений от стрессов [Lastochkina et al. 2017]. Концентрацию бактерий определяли при оптической плотности 600 нм с помощью спектрофотометра (Bio-RAD, США).

Инокуляция семян и условия выращивания. Семена растений салата перед посевом раскладывали в марлю и стерилизовали путем погружения на 2 мин в 70% этиловый спирт, промывали стерильной водой 3-4 раза. Далее семена погружали в суспензию B. subtilis 10-4 (10⁵ КОЕ/мл) (опыт) или воду (контроль) на 1 час, затем семена подсушивали при комнатной температуре и рассевали в пластиковые контейнеры (15×10×15 см) с универсальным почвогрунтом (pH=6.5, оптимальное соотношение NPK, влажность 65%, производитель ООО "Велторф", г. Великие Луки, Россия) на глубину 1-1.5 см. Засеянные семенами контейнеры ставили для выращивания в разные боксы (1.5×1.5×1.5 м) с встроенной вентиляцией и оснащенных красными (К) (660 нм), красно-синими (КС) [70%К (600-700 нм)+30%С (460 нм)], белыми (Б) [35%К (400-500 нм)+49%С (500-600 нм)+16%К (600-700 нм)] LED лампами (мощностью 24W) с интенсивностью света 250±10 мкмоль м^-2 с^-1. В качестве контрольного варианта использовали освещение люминесцентными лампами дневного света (Д) с интенсивностью освещения 200±10 мкмоль/м^-2с^-1. Интенсивность и спектры света измеряли с помощью спектрометра Sekonic C-7000 (Япония). Во всех вариантах растения выращивали при фотопериоде 12 час свет/12 час темнота, температуре воздуха 20-22°C и относительной влажности воздуха 60±5%. Полив растений производили водой два раза в неделю и через день производили опрыскивание водой через пульверизатор.

Оценку изменения параметров роста и содержания антоцианов производили через 6 недель после посева (фаза созревание) в момент уборки урожая. Ростовые параметры растений (длину корней, наземной части) оценивали классическим методом с использованием сантиметровой линейки. Сырую и сухую массу растений взвешивали с помощью лабораторных весов. Для измерения сухой массы свежесобранные листья и корни растений помещали в термостат при +65°С и высушивали до постоянного веса.

Содержание антоцианов измеряли с помощью спектрофотометрического метода [Islam et al. 2019]. Навеску листьев экстрагировали в темноте в 5 мл 95% этанола/1.5N HCl (85:15) в течение 24 часов при 4°C. Оптическую плотность экстрактов измеряли при длине волны 530 нм с использованием спектрофотометра Shimadzu (Япония). Суммарное содержание антоцианов рассчитывали по формуле [Islam et al. 2019].

Все опыты проводили в 3 биологических и 3 аналитических повторах. Статистическую обработку выполняли с использованием компьютерной программы STATISTICA 6.0 (StatSoft Inc., США). На рисунках представлены средние значения и их стандартные отклонения (±SD) при Р=0.95.

Результаты показали, что предпосевная обработка семян эндофитными бактериями B. subtilis 10-4 оказывала стимулирующий эффект (в разной степени) на параметры роста растений салата во всех исследованных вариантах освещения (К, Б, КС, Д) по сравнению с необработанными бактериями растениями, растущими в тех же условиях (Таблица), что находило отражение во внешнем виде растений (Фигура), показателях длины, а также сырой и сухой массы наземной части и корней растений салата (Таблица). Так, длина наземной части и корней у обработанных B. subtilis 10-4 растений к зрелому возрасту (момент сбора урожая) увеличилась (в сравнении с необработанными и произрастающими в тех же условиях), соответственно, на 105% и 120% (К), 158% и 153% (KC), 108% и 145% (Б), 113% и 108% (Д). Сырая и сухая масса листьев увеличилась на 118% и 120% (К), 219% и 200% (KC), 138% и 136% (Б), 132% и 158% (Д), соответственно. Кроме того, наблюдалось увеличение сырой и сухой массы корней, соответственно, на 110% и 128% (К), 288% и 358% (KC), 193% и 125% (Б), 106% и 175% (Д). Выявленный рост-стимулирующий эффект, очевидно, связан с продукцией штаммом B. subtilis 10-4 регулирующих рост соединений фитогормональной природы и других биологически активных веществ, способствующих улучшению питания растений [Lastochkina et al. 2017; 2021].

Установлено, что обработка эндофитными бактериями B. subtilis 10-4 при всех исследованных освещениях (К, КС, Б, Д) по-разному увеличивала содержание антоцианов по сравнению с необработанными растениями, растущими в тех же условиях (Таблица). В частности, содержание антоцианов в листьях салата под влиянием B. subtilis 10-4 относительно контрольных необработанных бактериями растений повышалось на 104% (14.9 мг/100 г при контроле 14.3 мг/100 г) (К), 104% (51.4 мг/100 г при контроле 53.5 мг/100 г) (КС), 128% (20.2 мг/100 г при контроле 15.8 мг/100 г) (Б), 133% (20.0 мг/100 г при контроле 15.0 мг/100 г) (Д). Однако, максимальное повышение содержания антоцианов достигалось в варианте с применением B. subtilis 10-4 в сочетании с КС спектром света, где прибавка составила +357% (53.5 мг/100 г сырой массы листьев) в сравнении с контрольными растениями салата, растущими под Д светом и без обработки бактериями (15 мг/100 г сырой массы листьев) (Табл.).

Таким образом, КС спектральный состав света в отдельности и в особенности в сочетании с B. subtilis 10-4 оказывал наиболее эффективное влияние на накопление антоцианов в листьях по сравнению с другими исследованными вариантами освещения (Б, К, Д) (Табл.). Это может быть связано с тем, что совокупность красного и синего спектров имеет большое влияние на рост растений вследствие повышения фотосинтетической фиксации углекислого газа (CO₂) в растениях. Из данных литературы известно, что для процессов фотосинтеза и роста растений наиболее эффективны красный, синий и совместно красный+синий светодиодные лампы [Wang et al. 2016], поскольку они являются основными источниками энергии для фотосинтетической ассимиляции CO₂ растениями. Кроме того, имеются сведения о положительном влиянии и эндофитных бактерий B. subtilis на фотосинтетический аппарат растений [Lastochkina et al. 2021]. Поэтому не удивительно, что растения салата, обработанные B. subtilis 10-4 и выращенные под К и КС спектром света, отличались наибольшей сухой биомассой (Таблица), поскольку именно фотосинтез участвует в накоплении сухого вещества растений. Кроме того, выявленный эффект дополнительного накопления антоцианов в растениях салата, обработанных B. subtilis 10-4 и выращенных под КС спектром света, очевидно, обусловлен способностью штамма 10-4 также участвовать в регуляции биосинтеза антоцианов. В пользу этого свидетельствуют и результаты полногеномного секвенирования, которые показали наличие у штамма 10-4 генов, участвующих в разнообразных биологических процессах, в том числе, вовлеченных в синтез антоцианов. Кроме того, антоцианы могут синтезироваться растением под влиянием продуктов метаболизма B. subtilis 10-4.

Таблица - Влияние предобработки эндофитными бактериями Bacillus subtilis 10-4 (BS) в сочетании с разными светодиодными спектрами света [белый (Б), красный (К), красный+синий (КС)] и люминесцентного дневного (Д) освещения на параметры роста растений и содержание антоцианов в листьях салата на момент сбора урожая Вариант Длина корня, см Длина наземной части, см Сырая масса корней/
листьев, г Сухая масса корней/листьев, г Содержание антоцианов в листьях, мг/100 г свежей массы Контроль + Д 7.2 10.8 0.53 / 1.72 0.035 / 0.141 15.0 BS + Д 7.8 12.2 0.56 / 2.27 0.072 / 0.224 20.0 Контроль + Б 10.2 7.9 0.98 / 2.37 0.119 / 0.259 15.8 BS + Б 14.8 8.5 1.90 / 3.27 0.151 / 0.353 20.2 Контроль + К 9.6 12.0 0.94 / 2.81 0.120 / 0.419 14.3 BS + К 11.5 12.6 1.03 / 3.31 0.154 / 0.505 14.9 Контроль + КС 7.5 4.8 0.56 / 1.22 0.074 / 0.198 51.4 BS + КС 11.5 7.6 1.61 / 2.67 0.265 / 0.396 53.5

Изобретение относится к сельскому хозяйству. Способ выращивания обогащенного антоцианами листового салата характеризуется тем, что семена листового салата перед посевом раскладывают в марлю и стерилизуют путем погружения на 2 мин в 70% этиловый спирт, промывают стерильной водой 3-4 раза, далее семена погружают в суспензию Bacillus subtilis 10-4 в концентрации 10⁵ KOE/мл на 1 час, затем семена подсушивают при комнатной температуре и рассевают в пластиковые контейнеры с почвогрунтом влажностью 65% на глубину 1-1.5 см, засеянные семенами контейнеры ставят для выращивания под светодиодные (LED) лампы с красно-синим (КС) спектром: 70% красный 600-700 нм + 30% синий 460 нм с интенсивностью освещения 250±10 мкмоль м^-2с^-1, фотопериодом 12 час свет/12 час темнота, температурой воздуха 20-22°C, относительной влажностью воздуха 60±5%, полив растений производят водой 2 раза в неделю и через день производят опрыскивание водой через пульверизатор. Изобретение позволяет разработать способ всесезонного выращивания листового салата и получать продукцию с повышенным содержанием антоцианов. 1 ил., 1 табл., 1 пр.

Способ выращивания обогащенного антоцианами листового салата, характеризующийся тем, что семена листового салата перед посевом раскладывают в марлю и стерилизуют путем погружения на 2 мин в 70% этиловый спирт, промывают стерильной водой 3-4 раза, далее семена погружают в суспензию Bacillus subtilis 10-4 в концентрации 10⁵ KOE/мл на 1 час, затем семена подсушивают при комнатной температуре и рассевают в пластиковые контейнеры с почвогрунтом влажностью 65% на глубину 1-1.5 см, засеянные семенами контейнеры ставят для выращивания под светодиодные (LED) лампы с красно-синим (КС) спектром: 70% красный 600-700 нм + 30% синий 460 нм с интенсивностью освещения 250±10 мкмоль м^-2с^-1, фотопериодом 12 час свет/12 час темнота, температурой воздуха 20-22°C, относительной влажностью воздуха 60±5%, полив растений производят водой 2 раза в неделю и через день производят опрыскивание водой через пульверизатор.