Способ выявления первичной открытоугольной глаукомы Российский патент 2025 года по МПК G01N33/68 G01N33/52 G01N25/02 G16H50/20 

Настоящее изобретение относится к области медицины, в частности, к диагностике офтальмологических заболеваний, а именно к способу неинвазивной диагностики глазных болезней, основанному на выявлении отличительных особенностей в профиле термической денатурации белков в образцах слезной жидкости у пациентов с первичной открытоугольной глаукомой. Способ может применяться в клинической практике и массовом профилактическом скрининге для быстрой, дешевой и неинвазивной диагностики первичной открытоугольной глаукомы.

Болезни глаза и его придаточного аппарата, в особенности, затрагивающие сетчатку и зрительный нерв, широко распространены среди возрастных групп населения, причем возраст их дебюта неуклонно снижается. Несвоевременная диагностика этих заболеваний, и вследствие этого несвоевременное лечение может приводить к частичной, или полной потере зрения. В тоже время ранняя диагностика офтальмологических заболеваний затруднена из-за отсутствия клинической симптоматики на начальных стадиях. В связи с этим необходимо активно развивать новые подходы к обнаружению патологий зрения, способные сочетать в себе низкую стоимость анализа и возможность быстрого получения результатов. Одним из перспективных подходов является анализ профилей термической денатурации белков в слезной жидкости человека. Изменения в профиле плавления белков в образце слезной жидкости обеспечивается их денатурацией, т.е. процессом, в ходе которого белки теряют свою четвертичную/третичную/вторичную структуру. В общем случае исследование тепловой денатурации белков включает (1) нагревание раствора белка с постоянной скоростью, (2) регистрацию температурных зависимостей некоторых физических или химических свойств раствора белка и (3) определение температуры, при которой происходит разворачивание (денатурация) белка. Известен метод дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК), в котором измеряется разница в количестве тепла, необходимого для повышения температуры образца и эталона, как функция температуры. ДСК применяется для исследования структурной стабильности отдельных белков путем мониторинга их термической денатурации. Альтернативным вариантом мониторинга термической денатурации является применение дифференциальной сканирующей флуориметрии (ДСФ), позволяющей регистрировать температурную зависимость собственной флуоресценции белка. В общем случае собственная флуоресценция белка зависит от локального окружения остатков триптофана, определяемого третичной структурой. В процессе нагревания происходит разворачивание белка, что приводит к изменению положения триптофанов и, как следствие, к смещению пиков эмиссии флуоресценции и изменению интенсивности флуоресценции. Указанные изменения можно регистрировать с помощью флуориметра, оснащенного специализированным нагревательным элементом. Современный нано-формат ДСФ (наноДСФ) позволяет отслеживать изменения флуоресценции с высоким временным разрешением, в небольшом объеме (в микрокапиллярах, единицы мкл), в диапазоне температур от 25°С до 95°С и концентраций от 5 мкг/мл до 250 мг/мл.

Из уровня техники известны решения, использующие кривые плавления белков, полученные с помощью ДСК биологических образцов, содержащих смеси белков, для диагностических целей. Осуществление диагностики заболевания в этом случае обеспечивается путем сравнения кривой плавления белков, содержащихся в биологическом образце пациента, с эталонной кривой плавления, полученной путем анализа белков биологических образцов здоровых индивидуумов. Известно решение, в котором в различных вариантах реализации представлены системы и методы классификации пациентов по одной или нескольким категориям заболеваний или лечения (US 2011/0301860 A1 “Using differential scanning calorimetry (dsc) for detection of inflammatory disease”). В частности, описывается, как параметры термограмм ДСК (“сигнатур”) отбираемых биологических жидкостей, таких как кровь, плазма, спинномозговая жидкость и др., могут быть использованы для выявления положительной или отрицательной корреляции с течением воспалительных заболеваний, например, аутоиммунных заболеваний. В рамках указанного решения раскрыты методы обнаружения, диагностики и/или мониторинга воспалительного заболевания у субъекта на основе данных ДСК. Между тем, указанное решение не охватывает в качестве примеров офтальмологические патологии. Помимо этого, недостатком предлагаемого калориметрического метода (ДСК) является тот факт, что изначально он предназначен для изучения денатурации отдельных белков и соответствующие приборы не приспособлены для проведения рутинных массовых анализов. Так, анализ кривых плавления занимает длительное время (120 минут), а чувствительность метода ДСК к температурным настройкам ячейки дополнительно усложняет его применение для исследования многокомпонентных биологических жидкостей, в том числе, в рамках экспресс диагностики патологий.

Наиболее близким к заявляемому изобретению является способ диагностики широкого спектра патологий у млекопитающих, включающий этапы сбора биологического образца, представляющего собой (включающего) белковую смесь, и получение профиля термической денатурации биологического образца с регистрацией сигнала оптическими методами (EP 3346262 A1 “Optical thermal method and system for diagnosing pathologies”). В частности, описывается метод ДСФ, позволяющий отслеживать термическое разворачивание белков по их собственной флуоресценции, а также другие оптические методы, использующие флуоресцентные красителя. Декларируется, что в рамках метода ДСФ интенсивность флуоресценции регистрируется как функция температуры с построением сигмоидальной кривой, которая отражает переход между фазовыми состояниями белков смеси. При этом наиболее удобный для анализа профиль денатурации можно получить, используя первую производную соответствующей функции. Отмечается возможность создания рутинного диагностического подхода на основе ДСФ, более быстрого, чем метод диагностики с использованием ДСК, а также обладающего рядом преимуществ по сравнению с последним. Однако в описанном решении заявляется достаточно длительное время проведения анализа (80 минут), а в качестве объектов исследования указываются биологические образцы крови, плазмы крови, сыворотки крови, костного мозга, спинномозговой жидкости, мочи, пота или слюны. Исследование только указанных объектов существенно ограничивает применение изобретения в офтальмологии, где в силу особенностей строения и иммунологической привилегированности глаза млекопитающего более релевантными биологическими образцами являются внутриглазная жидкость/водянистая влага (инвазивный отбор) и слезная жидкость (неинвазивный отбор).

Таким образом, техническая проблема, решаемая посредством заявляемого изобретения, заключается в создании быстрого, неинвазивного и недорогого диагностического метода, позволяющего на основе анализа слезной жидкости выявлять первичную открытоугольную глаукому в клинических условиях, в том числе в рамках масштабных скринингов.

Техническим результатом изобретения является разработка экспресс-диагностики наличия первичной открытоугольной глаукомы с помощью регистрации изменений состава слезной жидкости пациентов путем сравнения ДСФ-профилей, полученных для образцов пациентов с подозрением на офтальмологическое заболевание, с ДСФ-профилями термической денатурации белков слезной жидкости здоровых индивидуумов и пациентов с подтвержденным офтальмологическим заболеванием. Заявляемый способ позволяет за 17-20 минут проводить диагностику заболеваний глаза с целью выявления первичной открытоугольной глаукомы.

Настоящее изобретение относится к методам неинвазивной диагностики патологий глаза, а именно к технологиям, используемым для выявления отличительных особенностей в профиле плавления белков в образцах слезной жидкости у пациентов с первичной открытоугольной глаукомой. Способ диагностики включает следующие этапы: забор у пациента биологического образца слезной жидкости, включающей смесь белков путем проведения теста Ширмера; получение ДСФ-профиля термической денатурации смеси белков слезной жидкости, входящих в состав биологического образца; сравнение ДСФ-профиля термической денатурации белков слезной жидкости исследуемого образца с ДСФ-профилями термической денатурации белков слезной жидкости здоровых индивидуумов и пациентов с подтвержденным офтальмологическим заболеванием; диагностика патологии. Выделение слезной жидкости из полоски Ширмера проводят следующим образом: полоску переносят в пластиковую микроцентрифужную пробирку объемом 0,5 мл, проколотую в нижней части иглой G30, заливают деионизированной водой, взятой из расчета 1 мкл воды на 1 мм полоски, микроцентрифужную пробирку размещают в пробирку большего объема и проводят центрифугирование с получением и последующем отбором образца слезной жидкости, при этом после центрифугирования образец слезной жидкости с водой будет находиться в пробирке большего объема. Центрифугирование проводят при 14000×g в течение 5 мин при 4°С с допустимой величиной отклонения от указанных значений параметров не более чем на 5%. Определение ДСФ-профиля проводят с помощью прибора, позволяющего определить зависимость интенсивности флуоресценции от температуры, при непрерывном нагреве образца в диапазоне от 35 до 95°С с регистрацией интенсивности флуоресценции при 330 и 350 нм (F330 и F350). Для обработки результатов и диагностики заболевания проводят расчет температурных зависимостей интенсивностей F330, F350, и F350/F330, а также производных этих зависимостей. Вывод о наличии патологии делают путем сравнения результатов, полученных ДСФ-профилей термической денатурации белков слезной жидкости с ДСФ-профилями, полученными от здоровых индивидуумов и/или индивидуумов с первичной открытоугольной глаукомой, представленных в базе данных с использованием алгоритма машинного обучения AdaBoost с точностью более 80%.

Поставленная техническая проблема решается эффективно благодаря следующим обстоятельствам:

- предложенный способ диагностики первичной открытоугольной глаукомы включает простую процедуру забора биологического материала (слезной жидкости) у пациента, которая является неинвазивной и легко выполняемой в клинической практике;

- регистрация ДСФ-профилей термической денатурации смеси белков слезной жидкости занимает короткий период времени (7-10 минут), что существенно ускоряет процедуру диагностики;

- применение технологии наноДСФ в капиллярах позволяет одновременно регистрировать ДСФ-профили до 40 образцов, что существенно ускоряет и удешевляет процедуру диагностики.

Решение поставленной проблемы упрощается также за счет того, что предлагаемый способ выявления первичной открытоугольной глаукомы с помощью ДСФ-анализа включает использование базы данных, содержащей профили термической денатурации белков слезной жидкости. Профили, включенные в базу, получены путем сбора биологических образцов слезной жидкости в репрезентативных группах здоровых индивидуумов и пациентов, у которых были подтверждена первичная открытоугольная глаукома, с последующей регистрацией термической денатурации белков слезной жидкости методом ДСФ. В качестве примера можно привести базу профилей денатурации, созданную на основе анализа 82 пациентов с первичной открытоугольной глаукомой (ПОУГ) и 171 здорового индивидуума.

В рамках предлагаемого подхода ДСФ-профиль термической денатурации образца слезной жидкости, полученной от пациента с подозрением на офтальмологическую патологию, сравнивается с ДСФ-профилями термической денатурации образцов слезной жидкости здоровых индивидуумов, а также пациентов с подтвержденной первичной открытоугольной глаукомой. Патология диагностируется, если ДСФ-профиль термической денатурации слезной жидкости, полученной от анализируемого пациента, отличается от ДСФ-профилей термической денатурации слезной жидкости здоровых индивидуумов, но соответствует ДСФ-профилям термической денатурации слезной жидкости пациентов с подтвержденной первичной открытоугольной глаукомой. Сравнительный анализ данных осуществляется с помощью двухпараметрической кластеризации и/или классификации с применением алгоритмов машинного обучения.

Решение предлагается для диагностики первичной открытоугольной глаукомы. Указанное заболевание относится к дегенеративным заболеваниям сетчатки (нейродегенеративные патологии), характеризуется тяжелым течением и приводит к необратимой слепоте. Первичная открытоугольная глаукома на ранних стадиях является бессимптомной (что затрудняет ее диагностику), однако имеет системный характер и ее течение отражается на белковом составе жидкостей глаза, включая слезную жидкость.

Краткое описание чертежей

Изобретение поясняется чертежами, на которых представлена общая схема этапов диагностики с использованием предлагаемого способа (фиг. 1), сравнение профилей денатурации белков слезной жидкости здоровых индивидуумов и пациентов с первичной открытоугольной глаукомой, полученных методом ДСФ в соответствии с изобретением (фиг. 2), результаты кластерного анализа профилей термической денатурации белков слезной жидкости, полученные с помощью наноДСФ, для первичной открытоугольной глаукомы и здоровых индивидуумов согласно изобретению (фиг. 3), а также результаты сравнения эффективности использования алгоритмов машинного обучения для классификации профилей термической денатурации белков слезной жидкости с целью диагностики первичной открытоугольной глаукомой согласно изобретению (фиг. 4).

Осуществление изобретения

При создании изобретения были получены профили термической денатурации белков слезной жидкости пациентов с первичной открытоугольной глаукомой (ПОУГ) и здоровых индивидуумов. Осуществление изобретения обеспечивалось путем последовательного выполнения этапов анализа. На фиг. 1 представлена схема этапов диагностики с использованием предлагаемого способа. Забор у пациента биологического образца слезной жидкости, включающей смесь белков, осуществлялся с помощью тест-полосок Ширмера (см. Тюлина В.В., Сенин И.И. Метод получения слёзной жидкости для изучения её антиоксидантных свойств. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 175(4), 494-499). Процедура является неинвазивной и не требует анестезии или стимуляции. После сбора тест-полоски Ширмера хранились в отдельных пробирках при температуре -80°С. Для извлечения образцов слезной жидкости из тест-полосок Ширмера использовался оригинальный подход, не требующий применения сложных экстракционных растворов. Полоску Ширмера полностью переносили в пластиковую микроцентрифужную пробирку объемом 0,5 мл с деионизированной водой (1 мкл воды на 1 мм полоски), проколотую в нижней части иглой G30. Пробирку помещали в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл, центрифугировали при 14000×g в течение 5 мин при 4°С, и собранный образец слезной жидкости использовали для дальнейшего анализа. Применение описанной процедуры позволило полностью сохранить состав белков и белковых комплексов слезной жидкости. По окончании процедуры образец слезной жидкости легко отбирался с использованием капилляров прибора наноДСФ. Профили денатурации слезной жидкости регистрировались в диапазоне от 35 до 95°С с помощью прибора Tycho NT.6 и включали температурные зависимости интенсивности флуоресценции при 330 и 350 нм (F330 и F350), отношения интенсивностей флуоресценции при 350 и 330 нм (F350/F330), а также их производные.

Классификацию профилей денатурации производили с применением кластерного анализа или алгоритмов искусственного интеллекта (машинного обучения). Кластерный анализ проводили на основе температурных зависимостей первой производной ∂(F350/F330)/∂T (фиг. 1) методом k-средних с использованием программы Mathematica версии 12.0 (Wolfram Research, Champaign, IL, USA). Соответствующие зависимости, полученные для образцов слезной жидкости пациентов с ПОУГ и контрольной группы, имели характерную форму с двумя основными пиками с максимумами при температурах около 65°С (T1m) и 78°С (T2m) (фиг. 2). Первичная классификация пациентов выполнялась с учетом только значений T1m и T2m. Проведенный анализ позволил выделить две отдельные популяции (кластер 1 и кластер 2), характеризующиеся средними значениями T1m/T2m, равными 67,9/77,7°С и 64,6/79,3°С, соответственно (фиг. 3). Для анализа методами машинного обучения использовалась вся совокупность данных наноДСФ, включая температурные зависимости F330 и F350, их отношения F330/F350, а также первые производные этих функций. В качестве алгоритмов использовались логистическая регрессия (LR), машина опорных векторов (SVM) и два различных ансамблевых метода – случайный лес (RF) и адаптивное улучшение (AdaBoost). Каждый алгоритм оценивался с помощью 5-кратной перекрестной валидации, при которой набор данных делится на 5 частей, алгоритмы обучаются на 4-х и оцениваются на 5-й, причем каждая папка используется один раз на тесте и входит в 4 обучающих набора. Таким образом, полученная точность является средним значением по результатам 5 экспериментов. Используемый код был написан на языке Python. Подготовка данных осуществлялась с помощью библиотеки Pandas версии 1.4.0 (https://pandas.pydata.org), а запуск алгоритмов машинного обучения - с помощью пакета инструментов Scikit-learn версии 1.1.0 (https://scikit-learn.org).

Двухпараметрическая кластеризация профилей по максимумам пиков позволила выявить ПОУГ в 70% случаев, однако ограничением было большое количество ложноположительных идентификаций. Использование алгоритмов машинного обучения позволило значительно повысить точность идентификации. Так, в паре "ПОУГ против контроля" все алгоритмы дали достоверность 75-80% (фиг. 4), однако наиболее эффективным оказался алгоритм AdaBoost (достоверность 81,4%), при использовании которого правильная идентификация больных ПОУГ была достигнута в 70% случаев, при том, что количество ложноположительных контролей не превышало 13,5% (табл. 1). Выделенные группы истинно положительных и ложноотрицательных больных ПОУГ не различались по среднему возрасту, полу и лечению, что указывает на зависимость проведенной классификации именно от биохимических изменений в слезной жидкости, связанных с заболеванием. Примечательно, что группы ПОУГ-положительных пациентов, определенные с помощью двухпараметрической кластеризации k-means и алгоритма AdaBoost на 80% состояли из одних и тех же пациентов.

Таблица 1

Распределение пациентов по группам, определенным различными алгоритмами классификации

Группа Параметры Двухпараметрическая кластеризация по методу K-средних AdaBoost алгоритм
(Контроль vs ПОУГ) Отриц. Полож. Отриц. Полож. Контроли Пациенты, % 53.2 46.8 86.5 13.5 Средний возраст ± SD, годы 27.3 ± 9.9 35.6 ± 22.2 30.0 ± 17.13 47.9 ± 22.1 Пол (м/ж), % 42.8/57.2 33.7/66.3 40.6/59.4 30.5/69.5 Точность ± CI *, % - - ПОУГ Пациенты, % 28.0 72.0 30.0 70.0 Средний возраст ± SD, годы 63.3 ± 12.6 71.0 ± 8.7 63.2 ± 12.0 71.3 ± 8.15 Пол (м/ж), % 47.8/52.2 33.9/66.1 35.1/64.9 44.0/56.0 Лечение, % β-блокаторы 52.2 55.9 52.0 57.9 CA ингибиторы 56.5 44.1 48.0 49.1 PG аналоги 34.8 28.8 36.0 29.8 нет лечения 26.0 32.2 28.0 29.8

Валидацию заявляемого способа осуществляли на валидационной выборке, включающей результаты сравнение профилей плавления слезной жидкости пациентов с ПОУГ (82 пациента) и соответствующих профилей здоровых индивидуумов (171 контрольный образец). С использованием алгоритма AdaBoost (AB) и применением метода кросс-валидации правильная идентификация больных с ПОУГ была достигнута в 70% случаев (Фиг. 4, метод АВ, оранжевый сектор), при том, что количество ложноположительных контролей не превышало 13,5% (Фиг. 4, метод АВ, синий сектор).

Пример 1. Диагностика ПОУГ

Пациент Х, 76 лет, мужского пола в ноябре 2022 г. проходил хирургическое лечение катаракты в НМИЦ ГБ имени Гельмгольца. Пациенту был проведен тест Ширмера. Полученную тест-полоску перенесли в пластиковую микроцентрифужную пробирку объемом 0,5 мл, проколотую в нижней части иглой G30, залили 40 мкл деионизированной воды, разместили в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл, пробирки центрифугировали при 14000×g в течение 5 мин при 4°С. По окончании процедуры образец слезной жидкости оставался на дне пробирки объемом 1,5 мл, откуда его легко отобрали с использованием капилляров прибора наноДСФ. Профили денатурации слезной жидкости регистрировались в диапазоне от 35 до 95°С с помощью прибора Tycho NT.6 и включали температурные зависимости интенсивности флуоресценции при 330 и 350 нм (F330 и F350), отношения интенсивностей флуоресценции при 350 и 330 нм (F350/F330). По результатам проведенного исследования был получен профиль термической денатурации белков слезной жидкости, который после сравнения с созданной базой данных был классифицирован как соответствующий глаукоме. Пациенту было предложен пройти стандартное обследование для подтверждения диагноза, которое включало тонометрию, периметрию и оптическую когерентную томографию. В результате был установлен диагноз первичной открытоугольной глаукомы 3 стадии, и назначено соответствующее лечение.

Заявленный способ выявления патологий глаза, нашел воплощение в продукте, который представляет собой компьютерно-реализуемую систему, содержащую блок, включающий базу профилей денатурации здоровых индивидуумов и пациентов с подтвержденными патологиями глаз.

Изобретение относится к медицине, а именно к офтальмологии, и может быть использовано для выявления первичной открытоугольной глаукомы (ПОУГ). Проводят отбор образца слезной жидкости с помощью тест-полоски Ширмера, выделение слезной жидкости из полоски Ширмера, с последующим определением профилей термической денатурации белков в слезной жидкости методом дифференциальной сканирующей флуориметрии (ДСФ). Вывод о наличии ПОУГ делают по результатам сравнения полученных ДСФ-профилей термической денатурации белков слезной жидкости с ДСФ-профилями, полученными от здоровых индивидуумов и индивидуумов с ПОУГ. При обнаружении отличий от ДСФ-профилей здоровых индивидуумов выявляют ПОУГ. Способ обеспечивает возможность экспресс-диагностики наличия первичной открытоугольной глаукомы за счет регистрации изменений состава слезной жидкости пациентов путем сравнения ДСФ-профилей, полученных для образцов пациентов с подозрением на офтальмологическое заболевание, с ДСФ-профилями термической денатурации белков слезной жидкости здоровых индивидуумов и пациентов с подтвержденным офтальмологическим заболеванием. 6 з.п. ф-лы, 4 ил., 1 табл., 1 пр.

1. Способ выявления первичной открытоугольной глаукомы (ПОУГ), включающий отбор образца слезной жидкости с помощью тест-полоски Ширмера, выделение слезной жидкости из полоски Ширмера, с последующим определением профилей термической денатурации белков в слезной жидкости методом дифференциальной сканирующей флуориметрии (ДСФ), при этом вывод о наличии ПОУГ делают по результатам сравнения полученных ДСФ-профилей термической денатурации белков слезной жидкости с ДСФ-профилями, полученными от здоровых индивидуумов и индивидуумов с ПОУГ, и при обнаружении отличий от ДСФ-профилей здоровых индивидуумов выявляют ПОУГ.

2. Способ по п.1, характеризующийся тем, что выделение слезной жидкости из тест-полоски Ширмера проводят центрифугированием.

3. Способ по п.2, характеризующийся тем, что для выделения слезной жидкости из тест-полоски Ширмера полоску переносят в пластиковую микроцентрифужную пробирку объемом 0,5 мл, проколотую в нижней части иглой G30, заливают деионизированной водой, взятой из расчета 1 мкл воды на 1 мм полоски, размещают в пробирку большего объема и проводят центрифугирование с получением и последующем отбором образца слезной жидкости.

4. Способ по п.2, характеризующийся тем, что центрифугирование проводят при 14000×g в течение 5 мин при 4°С с допустимой величиной отклонения от указанных значений параметров не более чем на 5%.

5. Способ по п.1, характеризующийся тем, что определение ДСФ-профиля проводят с помощью прибора, позволяющего определить зависимость интенсивности флуоресценции от температуры при непрерывном нагреве образца в диапазоне от 35 до 95°С с регистрацией интенсивности флуоресценции при 330 (F330) и 350 нм (F350).

6. Способ по п.1, характеризующийся тем, что вывод о наличии патологии делают путем сравнения данных температурных зависимостей интенсивностей F330, F350, соотношения F350/F330, а также производных этих зависимостей, полученных для исследуемого индивидуума с данными, полученными от здоровых индивидуумов и/или индивидуумов с ПОУГ.

7. Способ по п.6, характеризующийся тем, что сравнение данных осуществляется с помощью двухпараметрической кластеризации и/или классификации с применением алгоритмов машинного обучения.