Комбинированный препарат на основе штаммов Penicillium citrinum BKM F-4930D, Basillus subtilis BKM B-3171D и Bacillus licheniformis BKM B-3172D, способ его производства Российский патент 2025 года по МПК C12N1/20 A61K35/66 A61K35/74 C12R1/10 C12R1/125 C12R1/80 

Изобретение относится к биотехнологии и сельскому хозяйству, в частности к получению высокоактивных пробиотических кормовых добавок для сельскохозяйственных животных и птиц, и может быть использовано для повышения питательности кормов и увеличения коэффициента их конверсии, оптимизации процессов пищеварения, повышения продуктивности и сохранности свиней, крупного рогатого скота, сельскохозяйственной птицы, аквакультуры.

Учитывая современные тенденции развития сельского хозяйства в России, первостепенное значение приобретает обеспечение отрасли высококачественными и сбалансированными кормами и кормовыми добавками. Это обусловлено тем, что уровень кормления сельскохозяйственных животных и птиц является одним из основных факторов, оказывающих непосредственное влияние на полноценное развитие и рост скота и птицы, а также обеспечивающих оптимальное использование генетического потенциала продуктивности (3). Установлено, что наряду с физиологической ролью сбалансированного питания, первостепенное значение приобретает и нормальное функционирование микрофлоры желудочно-кишечного тракта, дисбаланс которой негативно влияет на ряд функций организма животных и птицы.

Болезни желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) занимают второе место после вирусных заболеваний и являются основной причиной гибели молодняка Животноводческие и птицеводческие предприятия в большинстве случаев с лечебной и профилактической целью применяют значительные количества антибиотических препаратов. Но, как известно, длительное использование антибиотиков, особенно широкого спектра действия, приводит к появлению у патогенной и условно-патогенной микрофлоры резистентности к данным лекарственным препаратам (4). В последние годы появились новые подходы к лечению и профилактики заболеваний ЖКТ, основанные на восстановлении естественной микрофлоры организма с помощью биологически активных продуктов - пробиотиков, эффективность которых не уступает некоторым антибиотикам и химиотерапевтическим средствам (1).

К настоящему времени известно достаточное число пробиотических препаратов, используемых для лечения и профилактики заболеваний ЖКТ (Патент на изобретение RU 2663720 С1; Патент на изобретение RU 2678978 С2; Патент на изобретение RU 2704479 С1). Как правило, такие препараты содержат бактериальные клетки, культуральную жидкость, дополнительные источники белков, жиров, витаминов, провитаминов, органические кислоты, сорбенты и др. Современным направлением, обеспечивающим получение более выраженного пробиотического эффекта, является применение препаратов на основе нескольких штаммов микроорганизмов, обладающих синергетическим эффектом.

Так, известна добавка на основе комбинации двух штаммов бактерий Bacillus mucilaginosus В-4901 и Bacillus subtilis 1-85 и органических кислот (Патент на изобретение RU 2759225). Добавка используется в кормлении животных и птиц для обеспечения прироста живой биомассы. К недостатку данной добавки можно отнести относительно невысокое содержание пробиотических штаммов - 1×10⁶.

Известен пробиотический препарат для жвачных животных и способ его получения (Патент на изобретение RU 2260043). Препарат представляет собой консорциум штаммов Clostridium cellobioparum КЭ-157, Ruminoccocus flavefaciens К-339, Lactobacillus acidophilus 1082 и Propionibacterium acnes-83, полученный при совместном культивировании, высушенный в защитной среде и смешанный с наполнителем. Недостатком такого препарата является его относительно невысокая биологическая активность, обусловленная дезактивацией микроорганизмов, входящих в состав биопрепарата, при их прохождении через верхние отделы ЖКТ, а также снижение пробиотических свойств добавки при ее длительном хранении.

Плесневые грибы, выращиваемые на среде с высоким содержанием глюкозы, образуют обильную мицелиальную биомассу, содержащую до 44% белка (микопротеин). При производстве микопротеина чаще всего используют штаммы Fusariun graminearum, Agaricus bisporus. Грибная белковая биомасса имеет хорошую перевариваемость в организме животных и низкий уровень содержания нуклеиновых кислот. Это дает возможность замены в кормах до 50% растительного белка на грибной.

В России для получения микопротеина используют штаммы Fusarium sumbucinum, синтезирующие разнообразные биологически активные соединения, обладающие, в том числе, пребиотическими свойствами. Предложен штамм Fusarium sambucinum ВКПМ F-1161, являющийся продуцентом белковой пищевой биомассы (Патент на изобретение RU 2511427). Изобретение позволяет с высокой скоростью роста в условиях жидкофазного глубинного культивирования накапливать высокобелковую биомассу с повышенным количеством ценных ненасыщенных жирных кислот, полноценных по составу.

Также известно использование в качестве продуцентов белковой биомассы штаммов рода Penicillium: Penicillium notatum и Penicillium chrysogenum (Патент на изобретение USA 3912825). Глубинное культивирование штаммов осуществляют на различном сырье растительного происхождения, например фуражной пшенице, гидролизате картофеля, мелассе, багассе и/или цитрусовых отходов.

Известен штамм гриба F. sambucinum ВКПМ №F-867, используемый в качестве продуцента белка пищевого и кормового назначения и физиологически активных веществ (Патент на изобретение RU 2259209). На основе культуральной жидкости гриба разработаны пребиотики АВИСТИМ и АВИСТИМ-ПЛЮС (2). К недостаткам препарата можно отнести отсутствие пробиотической (антагонистической) активности и низкая питательная ценность в случае использования его в качестве кормовой добавки.

Также известен симбиотический препарат Probioist® на основе биомассы Aspergillus niger (>5.0×10⁸ КОЕ/г), разработанный китайской компанией Guangzhou Insighter Biotechnology Co., Ltd. Благодаря содержанию ферментов, органических кислот и антибактериальных веществ, препарат предназначен для нормализации процессов пищеварения сельскохозяйственных животных. К недостаткам препарата можно отнести наличие в препарате жизнеспособных клеток Aspergillus niger, вызывающих заболевания человека, животных (аспергиллезы) и растений, что не отвечает требованиям безопасности.

Наиболее близким по технической сущности к заявляемой группе изобретений является препарат для профилактики и лечения желудочно-кишечных заболеваний, содержащий смесь стерильных культуральных жидкостей бактерий Lactobacillus plantarum штамм 8 РАЗ (ВКПМ №B-11007) и Bacillus subtilis штамм М-8 (ВКПМ №В-1948), взятых в объемном соотношении 1:1, в качестве пребиотика - жидкий стерильный автолизат мицелия гриба Fusarium sambucinum штамм MKF-2001-3 (ВКПМ №F-867), а в качестве сухой биологически активной добавки - сухую биомассу гриба Fusarium sambucinum штамм MKF-2001-3 (ВКПМ №F-867) (Патент на изобретение RU 2538116). Изобретение позволяет повысить продуктивность животных, естественную резистентность организма, компенсировать в рационах кормления животных и птицы дефицит аминокислот, витаминов, микроэлементов, повысить усвояемость кормов, нормализовать микрофлору желудочно-кишечного тракта. Недостатком указанного аналога является отсутствие антагонистической активности у используемых штаммов F. sambucinum. Кроме того, способ использования препарата также может вызывать ряд трудностей, поскольку необходимо вносить каждый компонент добавки по отдельности и в дозах, зависящих от вида и возраста животных.

Задачей, стоявшей перед авторами, являлось создание нового комбинированного пробиотического препарата на основе двух симбиотических штаммов, а также биологически активной добавки в виде инактивированной биомассы гриба для повышения питательной ценности корма и обеспечения защитного и профилактического действия на организм животных и птицы.

Для получения комбинированного препарата проводят раздельное глубинное культивирование штаммов в ферментационных установках. Затем проводят концентрирование культуральной жидкости с последующим высушиванием полученной биомассы. К основным недостаткам получаемых препаратов следует отнести недостаточную эффективность вследствие потери пробиотических свойств штаммов в процессе получения готовой формы препарата, недостаточную термоустойчивость, относительно узкий спектр воздействия на организм.

Для решения поставленной задачи авторы использовали сухую инактивированную биомассу штамма Penicillium citrinum ВКМ F-4930D и смесь биомассы пробиотических штаммов бактерий Bacillus subtilis ВКМ В-3171D, Bacillus licheniformis ВКМ - 3172D.

Бактерии В. subtilis и В. licheniformis не относятся к составляющим элементами естественной нормофлоры человека и животных, но обладают свойствами, позволяющими организму поддерживать естественный уровень микрофлоры ЖКТ.

В. subtilis - является антагонистом таких патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, как сальмонелла, протей, стафилококки, стрептококки, дрожжевые грибки; вырабатывает ферменты, разлагающие продукты гниения тканей, способствует восстановлению численности бактерий, составляющих нормофлору ЖКТ, обеспечивая тем самым восстановление его нормального функционирования, принимают активное участие в обеспечении иммунного статуса и увеличении резистентности организма к патогенным бактериями и вирусам, синтезируют аминокислоты и витамины.

В. licheniformis - продуцирует ряд ферментов, участвующих в переваривании пищи и нейтрализации токсинов, витаминов, белков, пептидов, стимулирует выработку организмом интерферона, что в итоге приводит к подавлению роста и размножения патогенных микроорганизмов и вирусов, способствуя нормализации микрофлоры кишечника.

Инактивированная биомасса штамма P. citrinum ВКМ F-4930D содержит биологически активные вещества, в том числе низкомолекулярные белки и пептиды, проявляющие противомикробную активность в отношении патогенных микроорганизмов.

С помощью ненаправленного многоступенчатого УФ мутагенеза и селекции из штамма P. citrinum ВКПМ F-321 был получен штамм P. citrinum с индексом АВ 22-30 (депонированный во Всероссийской коллекции микроорганизмов ИБФМ им. Скрябина РАН под номером ВКМ F-4930D), обладающий более высокой противомикробной активностью при сравнении с исходным штаммом.

Кроме того, биомассу P. citrinum можно рассматривать как дополнительный источник белка, полноценного по аминокислотному составу (таблица 1).

Технический результат заключается в получении кормового продукта, обладающего набором полезных свойств, нормализующих процесс пищеварения и позволяющих интенсифицировать процесс откорма, что повышает продуктивность и сохранность сельскохозяйственных животных и птицы, при этом уменьшается расход потребляемого корма: 1. Комбинированный пробиотический препарат для использования в животноводстве, птицеводстве и рыбоводстве, содержащий сухую инактивированную биомассу гриба P. citrinum и смесь биомасс бактерий В. subtilis и В. licheniformis в споровой форме.

2. Способ получения комбинированной пробиотической добавки, предусматривающий раздельное культивирование указанных штаммов, концентрирование культуральных жидкостей, сушку концентратов и смешивание в соотношении:

- смесь (1:1) биомассы штаммов В. subtilis и В. licheniformis с содержанием жизнеспособных спор не менее 1,0×10⁸КОЕ/г каждого штамма;

- биомасса штамма P. citrinum ВКМ F-4930D в количестве 80%.

3. Способ получения биомассы P. citrinum ВКМ F-4930D, включающий культивирование штамма в биореакторах в жидкой питательной среде, содержащей сахарозу, соевую муку, триптон, нитрат натрия и сульфат магния, инактивирование культуральной жидкости путем нагревания при температуре 85°С в течение 40 минут, концентрирование путем центрифугирования и лиофильную сушку биомассы.

4. Способ получения биомассы В. subtilis ВКМ B-3171D и В. licheniformis ВКМ - 3172D, включающий культивирование штаммов в биореакторах на мелассно-кукурузной среде при рН 6,8-7,0, концентрирование культуральных жидкостей путем центрифугирования с последующей распылительной сушкой полученных концентратов, смешивании полученной биомассы штаммов В. subtilis B-3171D и В. licheniformis ВКМ - 3172D между собой в соотношении 1:1 добавкой мальтодекстрина до содержания жизнеспособных спор не менее 1,0x10⁸КОЕ/г каждого штамма.

5. Штамм P. citrinum ВКМ F-4930D, используемый для производства комбинированного пробиотического препарата, проявляющий противомикробную активность в отношении грамположительных аэробных и облигатно анаэробных бактерий - клостридий.

Важными свойствами нового комбинированного пробиотического препарата являются:

- широкий спектр действия по отношению к патогенным бактериям;

- термостабильность;

- высокое качество при хранении;

- экологическая безопасность;

- удобство в применении (как в составе комбикорма, так и при выпойке молоком, в составе заменителей).

Новый комбинированный препарат содержит штаммы В. subtilis ВКМ B-3171D и В. licheniformis ВКМ - 3172D в соотношении 1:1, с содержанием жизнеспособных спор не менее 1,0×10⁸ КОЕ/г, сухую инактивированную биомассу гриба P. citrinum ВКМ F-4930D в количестве 80%.

Проведено изучение патогенных свойств штамма P. chrysogenum ВКМ F-4930D по показателям: вирулентность (DV50), «пороговая» доза (Limbact), диссеминация во внутренние органы, токсичность и токсигенность в соответствии с методическими рекомендациями «Критерии оценки патогенных свойств штаммов-продуцентов, предлагаемых для использования в промышленности микробиологического синтеза» (М., 1992). Исследования выполнены совместно с ФГБОУ ВО РНИМУ им. Н.И. Пирогова МЗ РФ, сертификат аккредитации №СА 13.164 от 26.06.2014 г.

Оценку вирулентности штамма P. chrysogenum определяли по величине DV50 при однократном внутрибрюшинном введении суспензии 4-суточной культуры в физиологическом растворе беспородным белым мышам в дозах 2×10¹⁰, 2×10⁹ и 2×10⁸ КОЕ/жив. На каждую дозу использовали по 7 животных.

В период наблюдения (1 месяц) гибели животных не наблюдалось (DV50>2×10¹⁰ КОЕ/жив.), лишь в первые сутки наблюдались апатия и снижение двигательной активности подопытных животных при введении большой дозы. «Пороговую» дозу (Limbact) определяли как минимальную при высевании штамма из крови хвостовой вены через 30 мин после введения, которая составила 2×10¹⁰ КОЕ/жив.

На 2-й, 4-й, 8-й и 12-й дни после введения проводили высевание штамма из внутренних органов методом отпечатков на агаризованную среду Чапека-Докса. Диссеминация штамма не выявлена.

Токсичность штамма изучали при внутрибрюшинном введении белым мышам прогретой (800С, 1 час) и отмытой физиологическим раствором 4-суточной культуры в наибольшей дозе 1011 кл/жив. и ее разведениях. Гибель животных в течение срока наблюдения не отмечена (DL50>10¹¹ кл/жив.). Токсигенность штамма изучали при внутрибрюшном введении стерильных фильтратов 4-суточных бульонных культур в 3 разведениях: 0.5 мл каждого разведения вводили 3 мышам. Контрольным животным вводили стерильный питательный бульон или физраствор. Гибель животных в течение срока наблюдения не отмечена.

Штамм не обладал раздражающим действием при однократном внесении 50 мкл суспензии в концентрации 10⁹ КОЕ/мл в конъюнктивальный мешок глаза и нанесении на кожу кролика породы Шиншилла.

Таким образом, штамм P. chrysogenum является невирулентным, нетоксичным, нетоксигенным, не способен к диссеминации во внутренние органы, не обладает раздражающим действием. Он относится к непатогенным штаммам для теплокровных животных и может быть рекомендован к использованию в биотехнологиях.

Токсикологические свойства кормового пробиотического препарата были изучены в условиях острого эксперимента при однократном внутрижелудочном введении и хронического эксперимента при длительном (в течение 90 дней) внутрижелудочном введении лабораторным аутбредным крысам.

Определение острой пероральной токсичности, согласно ГОСТ 32644-2014, осуществляли поэтапно с использованием на каждом этапе по 1 группе крыс, состоящей из 3 животных. Начальная доза препарата составила 5000,0 мг/кг.

Установлено, что однократное внутрижелудочное ведение дозы пробиотического препарата, равной 5000,0 мг/кг, не привело к гибели крыс. Общее состояние животных опытной группы было удовлетворительным. Признаков интоксикации не наблюдалось. Целостность и эластичность кожного и шерстного покрова сохранены, окраска видимых слизистых оболочек соответствовала норме. Частота и глубина дыхательных движений не изменены. Координация движений не была нарушена, реакция на тактильные, болевые, звуковые и световые раздражители была адекватной. Изменений в поведении не отмечено.

На 14 сутки эксперимента крысы были выведены из опыта и подвергнуты аутопсии, в результате которой патологоанатомические изменения выявлены не были. Проводимый контроль массы тела животных опытных групп при изучении хронической токсичности также не показал каких-либо отклонений от контрольных животных.

Для изучения хронической пероральной токсичности на лабораторных крысах-самках были сформированы 2 опытных и 1 контрольная группы животных по 10 голов в каждой. Исследуемые дозы препарата составляли 500 мг/кг и 1000 мг/кг. Продолжительность эксперимента - 90 дней. Водную суспензию испытуемого препарата вводили лабораторным животным ежедневно per os с помощью атравматического желудочного зонда в объеме 1 мл/100 г массы тела. Животным контрольной группы в течение 90 суток перорально вводили питьевую воду.

К контролируемым в процессе исследования хронической токсичности пробиотического препарата показателям относили следующее - величина массы тела крыс, смертность, характер, тяжесть и продолжительность признаков интоксикации, результаты общего клинического и биохимического анализов крови, значения массовых коэффициентов внутренних органов, патологоанатомические изменения.

Введение крысам препарата в дозах 500 мг/кг и 1000 мг/кг в течение 90 суток не вызвало гибели животных или каких-либо признаков интоксикации. Общее состояние крыс оставалось удовлетворительным, изменений в поведении не отмечено, аппетит и жажда не были изменены, судороги не наблюдали; координация движений не была нарушена; тонус скелетных мышц соответствовал норме; реакция на тактильные, болевые, звуковые и световые раздражители была адекватной; целостность и эластичность кожного покрова сохранены, гиперемия отсутствовала; окраска видимых слизистых оболочек соответствовала норме; частота и глубина дыхательных движений не изменены; каловые массы в течение эксперимента имели темно-коричневый цвет, плотную консистенцию, характерной овально-продолговатой формы со специфическим запахом.

Анализ состояния внутренних органов при вскрытии животных контрольной и опытной групп через 24 ч после завершения эксперимента не выявил каких-либо отличий. Грудная и брюшная полости выпота не содержали. Положение внутренних органов грудной и брюшной полостей животных обеих групп анатомически правильные. Париетальный и висцеральный листки плевры и брюшины тонкие, блестящие, гладкие.

В результате установлено, что 90-дневное курсовое внутрижелудочное введение в организм животных кормового пробиотического препарата в дозах 500 мг/кг и 1000 мг/кг не оказывает токсического эффекта.

Таким образом, данные, полученные при изучении острой и хронической токсичности пробиотического препарата на лабораторных животных, позволили сделать заключение, что ее LD₅₀ превышает 5000,0 мг/кг, что соответствует 5 классу токсичности согласно СГС (ГОСТ 32644-2014). По классификации ГОСТ 12.1.007-76 кормовая добавка относится к 4 классу опасности (вещества малоопасные).

Практическое применение.

Кормовую добавку применяют для оптимизации процессов пищеварения, повышения продуктивности и сохранности у свиней, крупного рогатого скота, сельскохозяйственной птицы. Применяют индивидуально в смеси с основным кормом или групповым методом в составе комбикормов и кормовых смесей, с водой, используя существующие технологии смешивания, обеспечивающие равномерное распределение.

При групповом скармливании нормы ввода:

Поросята на доращивании - 0,5-1,0 кг/т корма;

Для бройлеров - 0,5-1 кг/т корма;

Для КРС - 0.5-1.0 кг/т корма

Сущность заявляемой группы изобретений иллюстрируются, но не ограничивается следующими примерами.

Пример 1.

Получение штамма P. citrinum ВКМ F-4930D.

Путем ненаправленного УФ-мутагенеза и селекции из штамма P. citrinum ВКПМ F-321 был получен штамм P. citrinum ВКМ F-4930D, обладающий более высокой антибактериальной активностью по отношению к тест-культурам при сравнении с исходным штаммом.

УФ-мутагенез.

Полученную путем смыва с агаровой среды суспензию, содержащую споры (1×10⁷ спор/мл) и обрывки мицелия, фильтровали через стерильный ватный фильтр или через воронку Шотта (размер пор 100 мкм). Затем, суспензию помещали в открытую чашку Петри и подвергали облучению УФ-лучами с длиной волны в диапазоне 250-280 нм (эксимерная лампа XeBr, модель BD P, мощность 12,5 Вт). Расстояние от чашки до лампы составляло 40 см, время экспозиции - 20 мин. После облучения, споровую суспензию (100-200 мкл) переносили на поверхность агаризованной среды и равномерно распределяли с помощью стерильного шпателя. Затем, чашки Петри помещали в термостат с температурой 24°С и культивировали в течение 10 суток. Из выросших на агаризованной среде колоний отбирали 7-10 изолятов, отличающихся от контрольных по внешним признакам (цвет, форма колонии). Отобранные изоляты отсевали на свежие агаризованные среды, инкубировали еще 10 суток, а затем высевали в ферментационную среду и культивировали глубинным методом в колбах (50 мл) в течение 4 суток.

Для оценки противомикробной активности полученной культуральной жидкости изолятов был проведен диффузионный тест в чашках Петри. В качестве тест-культур использовали Micrococcus luteus ВКПМ В-4876, Staphylococcus aureus АТСС - 6538Р. Для этого готовили суточные тест-культуры М. luteus и S. aureus. Из полученной тест-культуры готовили бактериальную клеточную суспензию с концентрацией, соответствующей стандарту мутности МакФарланда №3, и добавляли суспензию в расплавленную агаризованную среду из расчета 3 мл на 100 мл среды, перемешивали и разливали среду на чашки Петри.

Культуральные жидкости отобранных изолятов лиофильно высушивали. Перед экспериментом готовили 1-0,5-0,1%-ные водные растворы образцов.

После застывания агара, в нем стерильным сверлом вырезали лунки (d=0.8 см). Вносили в лунки по 100 мкл образцов. В качестве контроля использовали стерильную ферментационную среду.

Чашки инкубировали в течение суток при температуре роста тест-культуры, после чего оценивали результат по наличию и размерам зон подавления роста.

Колонию с максимальной противомикробной активностью по отношению к тест-культурам подвергали новому этапу мутагенеза и селекции. В результате серии последовательных этапов мутагенеза был получен новый штамм, формирующий войлочные колонии с неровным краем серо-желтого цвета. Зона подавления роста тест-культуры Staphylococcus aureus 1%-ным раствором высушенной КЖ штамма АВ 22-30 оказалась в 2.16 раза выше, чем исходного штамма P. citrinum ВКПМ F-321. Зона подавления роста тест-культуры Micrococcus luteus В-7845 1%-ным раствором высушенной КЖ штамма АВ 22-30 оказалась в 2 раза выше, чем у исходного штамма P. citrinum ВКПМ F-321 (таблица 2). Полученному штамму был присвоен лабораторный индекс АВ 22-30 (депонированный во Всероссийской коллекции микроорганизмов ИБФМ им. Скрябина РАН под номером ВК М F-4930D).

Идентификация штамма P. citrinum АВ 22-30.

Для уточнения видовой принадлежности штамма была проведена молекулярная идентификация выделенного образца.

Для проведения ПЦР и дальнейшего секвенирования ПЦР-фрагментов гена 18SPHK были использованы универсальные праймерные системы ITS5-LR5, позволяющая апмлифицировать участок ДНК, включающий в себя межгенную область, 5.8S РНК и участок 28SPHK.

Объем амплификационной смеси составлял 50 мкл и имел следующий состав: 1хбуфер ДНК полимеразы BioTaq (17 мМ (NH₄)₂SO₄, 67 MMTris-HCl, рН 8.8, 2 MMMgCl₂); по 12.5 нмоль каждого из dNTP, 50 нг ДНК-матрицы; по 5 пмоль соответствующих праймеров и 3 ед. ДНК полимеразы BioTaq (Диалат ЛТД, Россия).

Температурно-временной профиль ПЦР: первый цикл - 94°С × 9 мин, 55°С × 1 мин, 72°С × 2 мин; последующие 30 циклов - 94°С × 1 мин, 55°С × 1 мин, 72°С × 2 мин; завершающий цикл - 72°С × 7 мин.

Анализ продуктов ПЦР проводили при помощи электрофореза в 2% геле агарозы при напряженности электрического поля 6 В/см.

Выделение и очистку продуктов ПЦР проводили из легкоплавкой агарозы с применением набора реактивов WizardPCRPreps (Promega, США), согласно рекомендациям производителя.

Секвенирование полученных ГЩР-фрагментов проводили по методу Сэнгера с соавт.с помощью набора реактивов BigDyeTerminator v.3.1 (AppliedBiosystems, Inc.,USA) на генетическом анализаторе 3730 (AppliedBiosystems, Inc.,USA) ЦКП "Биоинженерия" ФИЦ Биотехнологии РАН согласно инструкциям производителя.

Филогенетический анализ полученных нуклеотидных последовательностей проводили на основе программы BLAST в базе данных NCBI GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Сборку и редактирование полученных последовательностей осуществляли с использованием программы BioEdit (http://jwbrown.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.html).

Частичная последовательность (616 нуклеотидов) амплификата гена Р. citrinum, кодирующего консервативную область 18S рРНК (Праймерная система 18S F566-18S R1200r) и последовательность (526 нуклеотидов), кодирующая межгенную область рибосомного оперона (праймерная система (ITS4-ITS5)), представлены в приложении 1.

К роду P. citrinum отнесен на основании исследования морфологии, физиолого-биохимических свойств (Bergey's manual, 1993), секвенирования генов 18S рРНК. Культура идентифицирована в лаборатории молекулярной диагностики Института Биоинженерии РАН (ЦКП «Биоинженерия») Уровень сходства с ближайшими типовыми штаммами P. citrinum strain MF408 -100%, P. strain MF399 - 100%, P. citrinum strain MF396 - 100%.

Культурально-морфологические: при культивировании на агаризованной среде штамм P. citrinum АВ 22-30 образует густой, плотный субстратный мицелий светло-желтого цвета с большим количеством темно-зеленых спор на поверхности мицелия. Споры подвижны, имеют шарообразную форму с гладкой поверхностью.

При глубинном культивировании с использованием питательной среды Реп-2, культура образует удлиненные плотные гифы, сплетенные в плотные глобулы.

Физиолого-биохимические: Аэроб. Штамм не растет при температуре ниже 22°С и выше 42°С, оптимум 24°С. Штамм растет в диапазоне значений рН 6,0 - 11,0, с оптимум роста при рН 6,5. Штамм выдерживает до 1,0% (вес/объем) NaCl. Обладает протеолитической активностью. Гидролизует крахмал, казеин, разжижает желатин, свертывает молоко, восстановливает нитраты до нитритов. Молоко не пептонизирует, не разлагает целлюлозу, не образует меланин.

Штамм P. citrinum АВ 22-30 хорошо утилизирует сахарозу, крахмал, фруктозу, глюкозу, монозу, глицерин; умеренно - рамнозу, ксилозу, арабинозу; не утилизирует - раффинозу, лактозу, целлюлозу.

Отобранный в результате УФ - мутагенеза и селекции штамм Р. citrinum АВ 22-30 депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов ИБФМ им. Скрябина РАН под номером ВКМ F-4930D.

Поддержание штамма гриба осуществляется на твердой агаризованной среде (Pen-1) следующего состава (г/л): агар-агар - 20,0; глюкоза - 30,0; глицерин - 70,0; пептон - 10,0; соевая мука - 10,0; натрия нитрат - 0,2; магния сульфат - 0,1; агар - 20,0 (рН до стерилизации 6.5±0.1), время инкубации 8-10 суток при температуре 24°С. Штамм хранится при температуре 4°С, пересев 1 раз в месяц.

Для длительного хранения культуру замораживают при - (50-70°С) в 50% глицерине, данные условия позволяют хранить культуру в течение 1 года без потери активности. Также штамм хранят в ампулах в лиофилизированном состоянии (защитная среда - обезжиренное молоко).

Пример 2.

Получение сухой инактивированной биомассы штамма P. citrinum ВКМ F-4930D.

Посевной материал получают на питательной среде (Реп-2) следующего состава (г/л): сахароза - 100,0; соевая мука - 20,0; триптон - 10, 0; натрия нитрат - 2,0; магния сульфат - 1,0 (рН до стерилизации 6.5±0.1). Полученную среду разливают в 1 л качалочные колбы Эрлейнмейера по 100 мл среды и стерилизуют при 121°С в течение 30 мин.

После охлаждения в колбы вносят споровую суспензию P. citrinum, помещают на качалочную установку при 250 об/мин (эксцентриситет 5 см) и 24°С на 48-72 часа. Полученный посевной материал объединяют в асептических условиях и передают на следующую стадию для засева ферментационной установки объемом 15 л.

Для культивирования штамма P. citrinum в ферментационной установке объемом 15 л готовят питательную среду Pen-2 объемом не более 10 л.

Выращивание посевного материала в ферментере ведут при следующих условиях:

• Температура - 24°С;

• Исходная скорость вращения мешалки - 250 об/мин;

• Аэрация - 5 - 10 л/мин;

• Давление в ферментере - 0,03 - 0,05 МПа;

• рН среды - 6,8 - 7,0;

• скорость перемешивания в течение процесса культивирования увеличивают до 500 - 600 об/мин для поддержания необходимого уровня растворенного кислорода; концентрация растворенного кислорода поддерживается на уровне 30% от насыщения до окончания процесса.

• рН регистрируется

• В случае интенсивного ценообразования варьируют скорость перемешивания или применяют пеногаситель.

В процессе культивирования 1 раз в сутки отбирают пробу для контроля стерильности процесса.

Через 48 ч роста полученный посевной материал в 15 л аппарате по стерильной посевной линии передают для засева биореактора объемом 100 л.

Для культивирования штамма P. citrinum в биореакторе объемом 100 л готовят питательную среду Pen-3 следующего состава (г/л): сахароза - 100,0; соевая мука - 30,0; триптон - 10,0; натрия нитрат - 2,0; магния сульфат - 1,0 (рН до стерилизации 6.5±0.1). Объем питательной среды 70 л.

Выращивание штамма в ферментере ведут в следующих условиях:

• температура - 24°С;

• исходная скорость перемешивания - 100 об/мин;

• скорость перемешивания в течение процесса культивирования увеличивают до 500 - 600 об/мин для поддержания необходимого уровня растворенного кислорода; концентрация растворенного кислорода поддерживается на уровне 50% от насыщения до окончания процесса.

Накопление биомассы сопровождается самопроизвольным снижением рН до 4,5 - 5,0 и дальнейшим подъемом на стадии культивирования до 6,5-7,0.

Налипание мицелия на вал мешалки и стенки ферментера устраняют путем изменения (увеличением или уменьшением) скорости перемешивания среды.

В случае нежелательного пенообразования также варьируют скорость перемешивания среды или применяют пеногаситель.

Продолжительность ферментации составляет от 72 до 96 часов. Момент окончания процесса определяется по результатам предварительного анализа на содержание целевого вещества в культуральной жидкости и накоплению биомассы. Ориентиром также служит резкое снижение дыхания культуры и повышение рН до 7,5, сопровождающееся пенообразованием.

В процессе культивирования 1 раз в сутки отбирают пробу для микробиологического и биохимического контроля.

По окончании культивирования биомассу P. citrinum инактивируют в ферментере при температуре 85°С в течение 40 мин. Культуральную жидкость сливают в приемник и передают на стадию центрифугирования. Центрифугирование культуральной жидкости проводят при скорости вращения ротора - 15000 об/мин. Скорость подачи культуральной жидкости 130-150 л³/ч. Содержание сухих веществ в полученном концентрате биомассы - 35-40%.

Полученную биомассу замораживают в камере сублиматора в течение 18 часов при температуре (-50 - 80°С). Далее запускают процесс сушки согласно инструкции по сушке продукта на лиофильной сушилке. В результате получается продукт, характеристика которого представлена в таблице 3.

Пример 3.

Получение сухой биомассы штаммов В. subtilis ВКМ B-3171D и В. licheniformis ВКМ - 3172D.

Штаммы В. subtilis ВКМ B-3171D и В. licheniformis ВКМ B-2999D культивируются раздельно в биореакторе объемом 100 л.

Выращивание посевного материала для ферментера осуществляют в одну генерацию в колбах емкостью 1 л или 2 л. Для получения посевного материала используют жидкую вегетативную среду следующего состава (г/л): аминопептид - 60 мл/л; гидролизат казеина - 5 г/л; соевый пептон - 1 г/л; дрожжевой экстракт - 1 г/л. Для получения посевного материала в колбах используют рабочую партию культуры на агаризованной среде в пробирках, прошедшую контроль, в котором отсутствует посторонняя микрофлора, морфологически однороден, со сроком хранения не более 15 дней с момента приготовления. Колбы помещают на качалочную установку «Innova 44» при 220 об/мин (эксцентриситет 5 см) и 37°С на 24 часа. В живом препарате должна быть масса подвижных и неподвижных палочек с закругленными краями без признаков дифференциации. В окрашенном препарате - масса палочек, протоплазма которых, окрашена нейтрально. Посевной материал (1 л) передается в ферментер по посевной линии.

Культивирование В. subtilis, В. licheniformis ведут в ферментационной установке объемом 100 л с рабочим объемом не более 70 л на среде следующего состава: (г/л)

меласса 25.0 кукурузный экстракт 12.5 дрожжевой экстракт 1.0 MgSO₄ 0.25 MnSO₄ 0.03 CoCl₂ 0.046 CaCl₂ 1.0 рН 6.8-7.0

Режим в ферментере перед посевом представлен в таблице 4.

Выращивание В. subtilis, В. licheniformis в ферментере ведут при рН 6.8-7.0 и температуре 37С, расход воздуха 35 - 70 л/мин, скорости перемешивания - до 500 об/мин, pO2 - 30 - 50%. Продолжительность ферментации - 28 ч.

Процесс считается законченным, если концентрация клеток в споровой форме составляет 93-95%.

По окончании инкубации В. subtilis и В. licheniformis культуральную жидкость концентрируют на высокоскоростной центрифуге с периодической выгрузкой концентрата. Центрифугирование культуральной жидкости проводят при скорости вращения ротора - 15000 об/мин. Скорость подачи культуральной жидкости 130-150 л³/ч. Содержание сухих веществ в полученном концентрате биомассы - 35-40%). Сушка жидких концентратов В. subtilus и В. licheniformis производится на распылительной сушилке.

Режимы сушки:

Температура на входе в сушильную камеру-125-130°С; Температура на выходе из сушильной камеры - 70-75°С; Производительность по испаренной влаге - до 8 кг/ч; Концентраты В. subtilus и В. licheniformis должны удовлетворять следующим требованиям:

Содержание влаги в концентратах - не более 5%;

Содержание жизнеспособных спор В. subtilus и В. licheniformis - не менее5×10¹¹КОЕ/г.

Пример 4.

Получение кормового пробиотического препарата.

Для получения 1 тонны кормового пробиотического препарата с содержанием жизнеспособных спор каждого штамма В. subtilis ВКМ В-3171D и В. licheniformis ВКМ - 3172D не менее 1×108 КОЕ/г и биомассы штамма P. citrinum ВКМ F-4930D в количестве 80% используют смеситель периодического действия.

В смеситель вносят сухие концентраты биомассы штаммов В. subtilis и В. licheniformis в количестве 200 г каждой культуры, 199,6 кг мальтодекстрина, используемого в качестве наполнителя. Перемешивают в течение 30 минут, затем добавляют 800 кг сухой биомассы P. citrinum ВКМ F-4930D, перемешивают еще в течение 30 мин. Полученную смесь фасуют во влагонепроницаемые бумажные пакеты.

Пример 5.

Изучение стабильности кормового пробиотического препарата.

Изучена стабильность кормового пробиотического препарата методом естественного хранения при температуре 37±2°С во влагонепроницаемом бумажном пакете с полимерным покрытием через 3, 6, 9, 12 и 24 месяца хранения. В указанные периоды времени определяли количество жизнеспособных клеток бактерий (КОЕ/г) путем высева соответствующего разведения пробы на агаризованную среду LA. Результаты представлены в таблице 5. Установлено, что в течение хранения кормового пробиотического препарата не происходит снижение заявленного титра живых пробиотических культур штаммов В. subtilis и В. licheniformis.

Пример 6.

Изучение эффективности in vitro новой кормовой пробиотической добавки на подавление роста анаэробных клостридий.

Проведен микробиологический анализ пробы кала, отобранной от коровы породы Черно-пестрая голштинизированная.

Анализируемый показатель-анаэробные клостридии по ГОСТ Р 54653-2011.

Вариант 1. Контроль. Среда для высева по ГОСТ Р 54653-2011.

Вариант 2. Среда для высева по ГОСТ Р 54653-2011 с добавлением в среду нового пробиотического препарата препарата в количестве 1 г на 100 мл среды.

Результаты представлены в таблице 6.

В результате применения нового кормового пробиотического препарата содержание анаэробных клостридий уменьшилось в 3000 раз, что показывает эффективность действия препарата против возбудителей тяжелых заболеваний животных (клостридиоза).

Пример 7.

Практическое применение на курах бройлерах.

Изучение эффективности нового кормового пробиотического препарата выполняли в отделе питания ФНЦ «ВНИТИП» и в СГЦ «Загорское ЭПХ».

Научно-производственный опыт проводили на бройлерах кросса «Росс 308» с суточного до 35-дневного возраста. Цыплят содержали в клеточных батареях типа R-15, по 30 голов в каждой группе. Плотность посадки, световой, температурный, влажностный режим, фронт кормления и поения, а также другие зоогигиенические требования во всех возрастных периодах птицы соответствовали рекомендациям для кросса и для всех групп были одинаковыми. Корм и воду цыплята получали вволю.

Кормление бройлеров осуществляли в две фазы (6-21 день - первый период и с 22 дня до конца выращивания - второй период). Первые 5 дней цыплята всех групп получали одинаковые гранулированные престартерные комбикорма. Схема опыта представлена в таблице 7.

Пробиотический препарат давали с первого дня выращивания птицы. Для изучения переваримости и использования питательных веществ корма бройлерами в конце периода выращивания был проведен физиологический (балансовый опыт) на трех петушках от каждой группы Результаты научно-производственного опыта представлены в таблице 8.

Согласно полученным данным, сохранность поголовья во всех группах составляла 100%-ной. Добавка пробиотического препарата в комбикорма отразилась на живой массе цыплят, увеличив ее по сравнению с контрольной группой, причем полученные результаты зависели от используемой дозировки добавки. Вследствие того, что бройлеры получали добавку с первого дня выращивания, разница в живой массе наблюдалась уже в 7-дневном возрасте. Так, в опытных группах она была выше на 3,9 и 4,4% (Р<0,01) по отношению к контрольной группе 1. В 21-дневном возрасте цыплят разница в живой массе несколько сгладилась. Так, в опытных группах 2 и 3 она была выше по сравнению с контролем на 3,0 и 2,5%. К концу периода выращивания средняя живая масса цыплят в опытной группе 2, получавшей кормовую добавку в количестве 1,8 кг на 1 т корма была выше на 3,3% по сравнению с контрольной группой. В опытной группе 3, которую кормили комбикормом, обогащенным пробиотиком в количестве 1,0 кг на 1 т корма, она была выше на 2,7%. Причем, в большей степени на использование пробиотического препарата отреагировали курочки, увеличив живую массу по сравнению с контрольной группой на 6,5 и 4,6%. Разница в живой массе петушков опытных групп 2 и 3 по отношению к контролю была менее значительна и составила 0,5 и 1,0%. Среднесуточный прирост живой массы в опытных группах 2 и 3 был выше на 3,3 и 2,8% соответственно. Затраты корма на 1 кг прироста живой массы в опытных группах 2 и 3 были ниже, чем в контрольной группе 1, на 4,5 и 4,0%. Результаты изучения перевариваемости и использования питательных веществ корма цыплятами-бройлерами представлены в таблице 9.

Согласно полученным данным, при использовании пробиотического препарата в количестве 1,8 кг на 1 т корма (опытная группа 2) цыплята лучше переваривали сухое вещество корма на 2,9%, протеина - на 1,6%, жира - на 1,8%, клетчатки - на 4,5%, чем аналоги контрольной группы. Использование азота корма было выше на 2,7%, лизина - на 1,4%, метионина - на 1,9%. В опытной группе 3, которая получала кормовую добавку в количестве 1,0 кг на 1 т корма, разница с контролем по переваримости бройлерами сухого вещества корма была выше на 2,1%, протеина - на 1,2%, жира - на 1,5%, клетчатки - на 3,0%, использованию азота - на 1,8%, лизина - на 0,9%, метионина - на 1,3%. По использованию кальция и фосфора значительных различий между группами не выявлено.

Проведенное исследование мясных качеств бройлеров (таблица 10) показали, что в опытных группах был выше убойный выход потрошеных тушек (на 0,2 - 0,3%) и выход наиболее ценной части тушек - грудных мышц (на 0,4 - 0,5%).

Масса некоторых внутренних органов бройлеров (мышечный желудок, печень, сердце) во всех группах была в пределах физиологической нормы и не зависела от уровней ввода пробиотического препарата в комбикорма.

Химический состав грудных и ножных мышц бройлеров представлен в таблице 11. Значительных различий по всем изученным показателям между контрольной и опытными группами не выявлено.

На основании результатов опыта по использованию нового кормового пробиотического препарата с комбикормами для бройлеров можно сделать заключение, что включение ее в обеих дозировках - 1,8 и 1,0 кг на 1 т корма способствовало улучшению роста птицы и снижению затрат корма.

Пример 8.

Практическое применение кормового пробиотического препарата на поросятах.

Физиологические исследования проводились на базе лаборатории иммунобиотехнологии и микробиологии и виварии Всероссийского научно-исследовательского институт физиологии, биохимии и питания животных - филиала Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Федеральный исследовательский центр животноводства - ВИЖ имени академика Л.К. Эрнста» (ВНИИФБиП) ВИЖ им. Л.К. Эрнста.

В исследование было включено 15 голов помесных боровков (F-1:(Д×JI) в период откорма с начальной живой массой 20-25 кг в возрасте 45 дней. Животные были равномерно распределены по 3 группам - 1 контрольная и 2-е опытные по 5 животных в каждой. Продолжительность исследования составила 45 суток. Схема опыта представлена таблице 12.

Для определения влияния вариантов испытуемой препарата на поедаемость кормов проводился ежедневный индивидуальный учет задаваемых кормов и их остатков на протяжении всего учетного периода. После окончания опыта средние пробы кормов, кала и мочи были подвергнуты химическому анализу в лаборатории иммунобиотехнологии и микробиологии ВНИИФБиП по общепринятым методикам.

Полученные в результате экспериментального кормления данные (таблица 13) свидетельствуют об интенсивном росте подопытных животных в период проведения опыта.

По результатам, представленным в таблице 13, можно сделать заключение, что данные по живой массе перед постановкой на опыт у животных подопытных групп достоверно не отличались. Но при этом наблюдалась тенденция к увеличению живой массы боровков опытных групп под воздействием скармливаемого фактора: максимальный прирост был у животных 3-й опытной группы, который был выше на 3,6% по сравнению с аналогами из 1-й контрольной группы.

Для проведения балансового опыта животные каждой группы по истечении предварительно периода были переведены в специальные клетки, оборудованных индивидуальными кормушками и средствами для сбора кала и мочи. Продолжительность эксперимента - 5 дней. Результаты представлены в таблице 14.

У растущего молодняка свиней опытных групп, получавших пробиотический препарат в составе комбикормов в различных вариантах, повысились коэффициенты переваримости сухого вещества - на 0,24% во второй группе и на 2,4% в третьей группе, органического вещества - на 0,6 и 1,27% соответственно, протеина - на 0,17 и 2,34% по сравнению с контрольными животными.

Анализ данных, полученных в результате проведения балансового опыта, свидетельствует о том, что включение в рационы растущего откармливаемого молодняка свиней опытных групп пробиотического препарата способствовало лучшему усвоению и использованию азота, кальция и фосфора.

Результаты анализа неспецифической резистентности животных опытных и контрольной групп представлены в таблице 15.

Как демонстрируют данные таблицы 15, у животных опытных групп были выше показатели фагоцитарной активности, фагоцитарный индекс, фагоцитарное число. Повышение критериев определяющий иммунологический статус животных, является ключевым значением для сохранности поголовья и интенсивности прироста.

Определение микробиологического профиля кишечного содержимого свиней проводилось по методу Коха. Результаты представлены в таблице 16.

В ходе исследования было достоверно зафиксировано уменьшение в опытных группах количество сальмонелл и энтерококков, что подтверждает эффективность применения пробиотического препарата. Таким образом, при введении в рацион пробиотического препарата происходит существенное изменение состава кишечного микробиоценоза, особенно в уменьшении количественных показателях условно-патогенной микрофлоры.

Пример 9.

Практическое применение кормового пробиотического препарата на телятах молочного периода выращивания.

Физиологические исследования проводились на базе лаборатории иммунобиотехнологии и микробиологии и виварии Всероссийского научно-исследовательского институт физиологии, биохимии и питания животных - филиала Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Федеральный исследовательский центр животноводства - ВИЖ имени академика Л.К. Эрнста» (ВНИИФБиП) ВИЖ им. Л.К. Эрнста.

В исследование было включено 15 голов телят молочного периода откорма со средней живой массой 56,3 - 56,5 кг в возрасте 30 дней. Животные были равномерно распределены по 3 группам - 1 контрольная и 2-е опытные по 5 животных в каждой. Продолжительность исследования составила 45 суток. Схема опыта представлена таблице 17. В таблице 18 представлены основные зоотехнические показатели, полученные в результате эксперимента.

По результатам индивидуального взвешивания были определены валовой и среднесуточный приросты (ССП). У телят молочного периода наблюдается интенсивный рост и ССП, в 2-х месячном возрасте разница по среднесуточному приросту в опытных группах была больше на 6,25%, 14,6% (р<0,05) соответственно. Валовой прирост был выше в 3 группе на 2% (р<0,01), во второй на 1,4%. Сохранность во всех группах была 100%. В контрольной группе наблюдался падеж 1 головы, диагноз - атония рубца. Результаты определения гематологических и биохимических показателей представлены в таблице 19.

У телят опытных групп наблюдалось повышение уровня эритроцитов на 12,3%, 16,4% (р<0,05), относительно показателей в контрольной группе. По аналогичной тенденции наблюдается повышение уровня гемоглобина на 3,6%, 9,8% (р<0,05) в опытных группах. Повышение уровня гемоглобина и увеличение эритроцитов свидетельствует об интенсификации эритропоэза на фоне интенсивного роста, что перекликается с достоверным увеличения валового и среднесуточного прироста на фоне применения пробиотической добавки.

У телят всех групп содержание лейкоцитов находилось на уровне референсных значений клинически здоровых животных данной возрастной категории. Уровень лимфоцитов - один из факторов естественного иммунитета, в опытных группах был больше на 36%, 36% (р<0,05) соответственно относительно телят контрольной группы.

- показатели белкового обмена: нарастание концентрации общего белка за счет увеличения фракции альбуминов и глобулинов (р<0,05); увеличение соотношения А/Г в конце молочного периода, коррелирующее с ОБ к росту мочевины. Повышение с возрастом уровня белкового обмена тесно связано и положительно коррелирует с живой массой;

Показатели жирового обмена: увеличение холестерина к концу молочного периода,

Показатели углеводного обмена и буферная емкость крови - к концу молочного периода откорма наблюдалось повышение ЩФ (р<0,05) и снижение уровня глюкозы (р<0,05).

Показатели минерального обмена - увеличение концентрации Са (р<0,05), увеличение железа (р<0,05), повышение концентрации Mg к концу молочного периода (р<0,05).

Анализ показателей неспецифической резистентности (таблица 20) у телят опытных групп превысили аналогичные показатели фагоцитарной активности контрольных животных.

При изучении экспрессии генов, ассоциированных с формированием естественного иммунитета, применение пробиотика оказывать значительное влияние на противовоспалительную активность (IL4) и снижает экспрессию провосполительных цитокинов (IL6) (таблица 21).

В результате исследования кишечной микрофлоры телят в конце опыта установлено влияние изучаемой добавок на ее состав (таблица 22). Количество лактобактерий и бифидобактерий было выше на порядок в группе телят, получавших кормовой пробиотической препарат. Достоверно снизилось количество сальмонелл и энтерококков у животных опытной группы.

Таким образом, при введении в рацион телят кормового пробиотического препарата происходит существенное изменение состава кишечного микробиоценоза, выраженное преимущественно в уменьшении количественных показателей условно-патогенной микрофлоры.

Приложение 1.

Частичная последовательность (616 нуклеотидов) амплификата гена Penicillium citrinum, кодирующего консервативную область 18S рРНК (Праймерная система 18S F566-18S R1200r).

GCGGTAATTCCAGCTCCAATAGCGTATATTAAAGTTGTTGCAGTTAAAAAGCTCGTAGTTGAACCTTGGGCCTGGCTGGCCGGTCCGCCTCACCGCGAGTACTGGTCCGGCTGGGCCTTTCCTTCTGGGGAACCTCATGGCCTTCACTGGCTGTGGGGGGAACCAGGACTTTTACTGTGAAAAAATTAGAGTGTTCAAAGCAGGCCTTTGCTCGAATACATTAGCATGGAATAATAGAATAGGACGTGCGGTTCTATTTTGTTGGTTTCTAGGACCGCCGTAATGATTAATAGGGATAGTCGGGGGCGTCAGTATTCAGCTGTCAGAGGTGAAATTCTTGGATTTGCTGAAGACTAACTACTGCGAAAGCATTCGCCAAGGATGTTTTCATTAATCAGGGAACGAAAGTTAGGGGATCGAAGACGATCAGATACCGTCGTAGTCTTAACCATAAACTATGCCGACTAGGGATCGGACGGGATTCTATGATGACCCGTTCGGCACCTTACGAGAAATCAAAGTTTTTGGGTTCTGGGGGGAGTATGGTCGCAAGGCTGAAACTTAAAGAAATTGACGGAAGGGCACCACAAGGCGTGGAGCCTGCGGCTTAATTTGA

Последовательность (526 нуклеотидов), кодирующая межгенную область рибосомного оперона (праймерная система (ITS4-ITS5)).

ATTACCGAGTGCGGGCCCCTCGGGGCCCAACCTCCCACCCGTGTTGCCCGAACCTATGTTGCCTCGGCGGGCCCCGCGCCCGCCGACGGCCCCCCTGAACGCTGTCTGAAGTTGCAGTCTGAGACCTATAACGAAATTAGTTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAACTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAGTCTTTGAACGCACATTGCGCCCTCTGGTATTCCGGAGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTGCTGCCCTCAAGCCCGGCTTGTGTGTTGGGCCCCGTCCCCCCCGCCGGGGGGACGGGCCCGAAAGGCAGCGGCGGCACCGCGTCCGGTCCTCGAGCGTATGGGGCTTCGTCACCCGCTCTAGTAGGCCCGGCCGGCGCCAGCCGACCCCCAACCTTTAATTATCTCAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGG

Приложение 2

Список литературы

1. Волкова И. Пробиотики как альтернатива кормовым антибиотикам. Комбикорма. 2014. №2. С 63-64.

2. Неминущая Л.А., Павленко И.В., Казаку А.А., Скотникова Т.А., Фролов Ю.Д. Инновационные синбиотики для сельского хозяйственных животных и птицы. Ветеринарный врач. 2023. №1. С.42-50.

3. Adedokun S.A., Olojede О.С.Optimizing Gastrointestinal Integrity in Poultry: The Role of Nutrients and Feed Additives. Front Vet Sci. 2019. V. 31. Is. 5. P. 348

4. Alvarez-Martinez F.J., Barrajon-Catalan E., Micol V. Tackling antibiotic resistance with compounds of natural origin: A comprehensive review. Biomedicines. 2020. V. 8. P. 405.

Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложены комбинированный пробиотический препарат для использования в животноводстве и птицеводстве, содержащий биомассу штамма Penicillium citrinum ВКМ F-4930D и в качестве пробиотической добавки - биомассы бактерий Bacillus subtilis ВКМ B-3171D и Bacillus licheniformis ВКМ В-3172D, смешанных между собой в соотношении 1:1, и способ его получения; способ получения биомассы Penicillium citrinum ВКМ F-4930D и способ получения биомассы Penicillium citrinum ВКМ F-4930D, используемых для производства комбинированного пробиотического препарата;

штамм Penicillium citrinum ВКМ F-4930D, используемый для производства комбинированного пробиотического препарата. Изобретения обеспечивают расширение арсенала пробиотических препаратов для повышения продуктивности и сохранности сельскохозяйственных животных и птицы. 5 н.п. ф-лы, 22 табл., 9 пр.

1. Комбинированный пробиотический препарат для использования в животноводстве, птицеводстве, содержащий биомассу штамма Penicillium citrinum ВКМ F-4930D, и в качестве пробиотической добавки - биомассы бактерий Bacillus subtilis ВКМ B-3171D и Bacillus licheniformis ВКМ В-3172D, смешанных между собой в соотношении 1:1.

2. Способ получения комбинированного пробиотического препарата по п. 1, предусматривающий раздельное культивирование указанных штаммов, концентрирование культуральных жидкостей, сушку концентратов и смешивание в соотношении, %:

- смесь (1:1) биомассы штаммов Bacillus subtilis ВКМ В-3171 D и Bacillus licheniformis ВКМ B-3172D с содержанием жизнеспособных спор не менее 1,0×10⁸ КОЕ/г каждого штамма в количестве 20%;

- биомасса штамма Penicillium citrinum ВКМ F-4930D в количестве 80%.

3. Способ получения биомассы Penicillium citrinum ВКМ F-4930D, используемой для производства комбинированного пробиотического препарата по п. 1, включающий культивирование штамма в биореакторах в жидкой питательной среде, содержащей сахарозу, соевую муку, триптон, нитрат натрия и сульфат магния, инактивирование культуральной жидкости путем нагревания при температуре 85°С в течение 40 мин, концентрирование путем центрифугирования и лиофильную сушку биомассы.

4. Способ получения биомассы Bacillus subtilis ВКМ B-3171D и Bacillus licheniformis BKM-3172D, используемой для производства комбинированного пробиотического препарата по п. 1, включающий культивирование штаммов в биореакторах на мелассно-кукурузной среде при рН 6,8-7,0, концентрирование культуральных жидкостей путем центрифугирования с последующей распылительной сушкой полученных концентратов, смешивании полученной биомассы штаммов Bacillus subtilis B-3171D и Bacillus licheniformis BKM-3172D между собой в соотношении 1:1 и добавкой мальтодекстрина до содержания жизнеспособных спор не менее 1,0×10⁸ КОЕ/г каждого штамма.

5. Штамм Penicillium citrinum ВКМ F-4930D, используемый для производства комбинированного пробиотического препарата по п. 1, проявляющий противомикробную активность в отношении грамположительных аэробных и облигатно анаэробных бактерий - клостридий.