СПОСОБ ПРОИЗВОДСТВА ПРОБИОТИЧЕСКОГО ПРЕПАРАТА НА ОСНОВЕ СПОРООБРАЗУЮЩИХ ШТАММОВ Bac. subtilis И Bac. licheniformis Российский патент 2011 года по МПК C12N1/20 A23K1/165 C12R1/07 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности способам производства пробиотических препаратов на основе штаммов бактерий Bac.subtilis и Bac.licheniformis. Подобные препараты обладают широким спектром действия и могут быть использованы для профилактики желудочно-кишечных заболеваний у с/х животных и птицы, предупреждения стрессовых воздействий, коррекции микрофлоры в кишечнике при нарушении процессов пищеварения.

Известен пробиотический препарат комплексного действия, обладающий антибактериальной активностью и способ его получения на основе биомассы штамма Вас. subtilis ВКПМ В-4759 и штамма Вас. licheniformis 2336/105, характеризующийся смешиванием живой биомассы указанных штаммов со стабилизатором при титре клеток соответственно 1×10⁷-1×10⁹ и 1×10⁸-10×10⁹. Препарат одновременно обладает антибактериальной и антивирусной активностями и успешно применяется в отношении широкого спектра патогенных и условно-патогенных микроорганизмов (RU 2159625, 2000).

Особенностью указанного препарата является наличие в его составе рекомбинантных штаммов микроорганизмов, что предъявляет особые условия к стабильности плазмидной ДНК и, в целом, к стабильности препарата и возможности достижения положительного эффекта от его применения.

Известен также препарат против вирусных и бактериальных инфекций, содержащий смесь биомассы штаммов Вас. subtilis ВКПМ В-7092, Вас. subtilis ВКПМ В-7048 и Вас. licheniformis ВКПМ В-7038 в споровой форме с титром не менее 3·10¹⁰ спор/г и стабилизатор - крахмал и сахар. Препарат получают смешиванием биомассы указанных штаммов со стабилизатором и высушиванием. Недостатком данного препарата является использование рекомбинантного штамма, содержащего плазмиду, детерминирующую устойчивость к антибиотикам (RU 2142287 D, 1999).

Наиболее близким к заявленному изобретению является способ получения пробиотического препарата, заключающийся в смешивании биомассы бактерий Bacillus subtilis В-2250 и/или Bacillus licheniformis B-2252 и вспомогательных веществ носителя-сорбента и влагоемкого наполнителя. В качестве носителя-сорбента он содержит аэросил гидрофильной марки А и гидрофобной марки AM, влагоемкого наполнителя - смолы-катиониты ионообменные марок КБ-4П-2 и КУ-2-8чс в заданном соотношении компонентов по массе сухого вещества. Сухую микрокапсулированную форму пробиотической добавки получают методом капиллярно-сорбционного высушивания смеси компонентов до содержания влаги в готовом продукте 8-25%. В результате получают микрокапсулированную форму пробиотической добавки, содержащую пробиотик, удобную в применении и употреблении, способную обеспечивать стабильность свойств на всех этапах приготовления (RU 2252956 С2, 2005).

Однако полученный вышеуказанным способом пробиотический препарат недостаточно эффективен в отношении коррекции микрофлоры кишечника в связи с невысоким содержанием пробиотических микроорганизмов. Кроме того, его производство энергозатратно и сложно.

По этой причине сохраняется потребность в высокоэффективных пробиотических препаратах, используемых для профилактики желудочно-кишечных заболеваний у животных и птицы, предупреждения различных стрессовых воздействий, корректирования микрофлоры в кишечнике при нарушении процессов пищеварения. Действие препарата должно приводить к увеличению привесов животных и птицы.

Техническим результатом данного изобретения является повышение эффективности пробиотической составляющей получаемого продукта, что обеспечивает благоприятную коррекцию микрофлоры кишечника животных и птицы, что приводит к привесам животных.

Этот результат может быть реализован при использовании описываемого способа производства пробиотического препарата на основе спорообразующих штаммов Вас. subtilis и Вас. licheniformis, предназначенного для профилактики желудочно-кишечных заболеваний у животных и птицы и коррекции микрофлоры в кишечнике, включающего культивирование штаммов Вас. subtilis и Вас. licheniformis, смешивание биомасс клеток бактерий с протектором микробных клеток и последующее стерильное обезвоживание, причем используют штамм Вас. subtilis ВКМ B-2287D и штамм Вас. licheniformis BKM B-2414D, биомассы штаммов смешивают в соотношении 1:1, в качестве протектора микробных клеток используют лактозу в количестве, обеспечивающем титр клеток в готовом продукте после сушки не менее 1×10¹¹ КОЕ/г.

В способе производства используются новые штаммы бактерий Вас. subtilis и Вас. licheniformis. Штаммы депонированы в ВКМ под регистрационными номерами: Вас. subtilis ВКМ B-2287D и Вас licheniformis ВКМ B-2414D. Штаммы выделены из почвы Кировской области.

Далее приведены свойства каждого штамма.

Вас. subtilis ВКМ B-2287D

Культурально-морфологические признаки

Грамположительные палочки, длиной 3-5 мкм, подвижные. Образуют споры округлые, одиночные, центральный диаметр меньше диаметра спор. Почкование бинарное. На МПА образуют колонии белые. Пигмент не выделяют. Селективных сред нет.

Физиолого-биохимические признаки

Тест на оксидазу и каталазу положительный. Аэроб. Используемые источники углерода при аэробном росте: глюкоза, лактоза, мальтоза, маннит. Возможно использование сахарозы и нозита, сорбита, арабинозы, мальтозы, цитрат натрия с глюкозой. Окисляемые неорганические субстраты: сера, тиосульфат, железо, аммоний, нитрит. Газа не образует, кислоты не образует. Отношение к рН: 3,5-8,0. Отношение к NaCl: рост при содержании до 3%. Отношение к температуре: 10-47°С. Используемые среды: МПА, МПБ.

Вас. licheniformis BKM B-2414D

Культурально-морфологические признаки

Палочки размером 2-5 мкм. Грамположителен. Образует споры одиночные, центральные или овальные. На среде МПА образует колонии белого цвета.

Физиолого-биохимические признаки

Тест на оксидазу и каталазу положительный. Аэроб. Используемые источники углерода при аэробном росте: глюкоза, мальтоза. Окисляемые неорганические субстраты: сера, тиосульфат, железо, аммоний, нитрит. Сбраживаемые источники углерода: глюкоза, мальтоза, сахароза. Отношение к рН: 5,0-8,0. Отношение к NaCl: рост до 7% NaCl. Отношение к температуре: 50°С. Среды для культивирования: МПА, МПБ, ПЖА.

Способ осуществляют следующим образом: биомассу B.subtilis и B.licheniformis получают путем культивирования в качалочных колбах объемом 750 мл или в ферментационных аппаратах вместимостью от 500 л до 63 м³ на среде с глюкозой, пептоном, кукурузным экстрактом в стерильных условиях, отделяют биомассу на центрифуге, пасту смешивают с протектором-лактозой и высушивают в сушильном шкафу, размалывают на мельнице, фасуют.

Пример

Получение инокулята Bacillus subtilis BKM B-2287D и Bacillus licheniformis BKM B-2414D.

Культуру бактерий B.subtilis BKM B-2287D и B.licheniformis BKM B-2414D хранят на скошенной плотной среде МПА или ГРМ №1 в пробирках, закрытых ватными пробками. Оптимальная температура хранения 4-6°С. Для поддержания культуры в жизнеспособном состоянии один раз в 3 мес производят пересев на свежую питательную среду МПА или ГРМ и выращивают при t=37°C до спорообразования 16-24 ч.

Для получения посевного материала для засева 100 колб с ферментационной питательной средой готовят от 1 до 5 колб инокулята. Для получения инокулята используют 2 варианта:

- в качалочную колбу объемом 750 мл с жидкой питательной средой объемом 100 мл вносят кусочек размером 1×1 см² исходной культуры со скошенного плотного агара МПА;

- в качалочную колбу объемом 750 мл с жидкой питательной средой объемом 100 мл вносят 0,5-1 мл споровой взвеси, смытой с двух биологических пробирок с исходной культурой 20 мл физиологического раствора.

Выращивание проводят в термостатируемой качалке при N=180-200 об/мин или в ферментационных аппаратах вместимостью от 500 л до 63 м³ при N=250-270 об/мин, с расходом воздуха 1:1, при t=37°C в течение 16-24 ч для культуры Bacillus subtilis BKM B-2287D и в течение 40-48 ч для Bacillus licheniformis ВКМ В-2414D. Чистоту культуры проверяют путем высева на чашки Петри с агаризованной средой МПА с последующим термостатированием при t=37°C. Отсутствие роста посторонней микрофлоры определяют визуально по виду колоний. Кроме этого, чистоту культуры определяют микроскопически. При отсутствии посторонней микрофлоры инокулят используют для засева колб с ферментационной средой.

Приготовление жидкой питательной среды для ферментации.

Состав питательной среды:

Пептон - 10 г/л

Глюкоза - 20 г/л NaCl -1 г/л

CaCl₂ -0,05 г/л

MgSO₄ - 0,25 г/л

MnSO₄ - 0,3 rAn

FeSO₄ - 0,01 г/л

Кукурузный экстракт - 30 г/л

рН среды 7,5 ±0,1 доводят 20 % раствором NaOH.

Разливают в качалочные колбы с отбойниками по 100-150 мл. Стерилизуют в паровом стерилизаторе ВК-75 при t=121±1°С в течение 25 мин.

Культивирование Bacillus subtilis BKM B-2287D и Bacillus licheniformis BKM B-2414D.

В качалочные колбы с отбойниками объемом 750 мл с жидкой питательной средой объемом 100-150 мл засевают инокулят в количестве 0,5-1 мл. Выращивание проводят в термостатируемой качалке N=200-220 об/мин или в ферментационных аппаратах вместимостью от 500 л до 63 м³ при N=250-270 об/мин, с расходом воздуха 1:1, при t=37°С в течение 16-24 ч для культуры Bacillus subtilis BKM B-2287D и в течение 40-48 ч для Bacillus licheniformis BKM B-2414D.

Окончание культивирования определяют по достижении рН 7,2-7,6 для Bacillus subtilis BKM B-2287D и рН 8,0-8,5 для Bacillus licheniformis BKM B-2414D; полному потреблению глюкозы и обильному спорообразованию. Количество бактерий определяют методом десятикратных разведений с высевом на чашки Петри. В 1 см³ должно быть не менее 10¹⁰ клеток.

Обработка полученной культуральной суспензии

Полученные культуральные жидкости B.subtilis BKM B-2287D и B.licheniformis ВКМ B-2414D смешивают по титру в соотношении 1:1. Центрифугирование культуральной суспензии имеет целью концентрирование культуральной жидкости. Центрифугирование проводят на центрифуге типа «Beckman» при N=6000-8000 об/мин, в течение 25 мин. Пасту бактерий B.subtilis ВКМ B-2287D и B.licheniformis ВКМ B-2414D выгружают в эмалированные или пластиковые емкости. Смешивают с протектором (лактоза) и раскладывают в поддоны слоем 1-2 см. Сушат в сушильном шкафу ШСС-500 при t=40°С в течение 2-3 ч до остаточной влажности не более 4%.

Надосадочную жидкость собирают в реактор-нейтрализатор, обеззараживают при температуре 100°С в течение двух часов, после чего сливают в канализацию. Центрифугу после сбора пасты обрабатывают 4% раствором хлорамина, затем промывают водой.

Сухой продукт измельчают на мельнице.

Фасовка, упаковка готового продукта.

Сухой продукт фасуют по 0,2-1 кг пакеты из полимерных материалов или по 5 г и 10 г в пенициллиновые флаконы, которые укупоривают резиновыми пробками и фиксируют алюминиевыми колпачками. На флаконы с препаратом наклеивают этикетки и укладывают в картонные коробки. Картонные коробки укладывают в ящики из гофрированного картона. Этикетку с названием препарата и датой изготовления вкладывают в коробку.

ПРИМЕР 1

Исследование выполнялось по трем группам. В каждой группе было по 35 голов птицы. Содержание цыплят - клеточное, при рекомендуемых параметрах микроклимата. Срок выращивания - 39 дней.

Птица получала полнорационные рассыпные корма с питательностью, соответствующей нормам.

СХЕМА ОПЫТА Группа Особенности кормления 1-контрольная Полнорационный комбикорм с питательностью,   соответствующий нормам 2-опытная Основной рацион + первые 5 дней жидкий препарат в дозе 1,5   мл 100 голов в день, затем сухой препарат в дозе 1 кг на 1т   корма 3-опытная Основной рацион + первые 5 дней жидкий препарат в дозе 1,5   мл 100 голов в день, затем с 14 по 21 день (период вакцинации)   сухой препарат в дозе 2 кг на 1 т корма

Жидкий препарат разводили в 10%-ном растворе глюкозы до необходимого объема и выпаивали в вакуумных поилках. Раствор с пробиотиком использовали в течение 8 ч.

УЧИТЫВАЕМЫЕ ПОКАЗАТЕЛИ

1. Сохранность поголовья

2. Живая масса бройлеров, в суточном 28 - и 39-дневном возрасте.

3. Потребление корма птицей по группам за сутки и период выращивания

4. Затраты корма на 1 кг прироста живой массы.

РЕЗУЛЬТАТЫ ОПЫТА Показатель   Группа   0 контрольная 2-опытная 3-опытная Посажено на выращивание голов 35 35 35 Сохранность поголовья, % 100 100 100 Живая масса, г в суточном 43,9± 0,82 41,9±0,65 42,0±0,57 возрасте       В 28-дневном возрасте 1330,3±20,3 1382,6±18,9 1358,0±14,0 % к контролю 100 103,9 102,1 В 39-дневном возрасте 2195,3 2282,1 2254,6 % к контролю 100 104,0 102,7 В т.ч курочки 2053,8±44,5 2151,7132,6 2141,1 ±39,1 % к контролю 100 104,8 104,3 В т.ч. петушки 2336,8±43,3 2412,4±29,1 2368,1±36,0 % к контролю 100 103,2 101,3 Среднесуточный привес 55,2 57,4 56,7 живой массы, г       Расход корма за период 141,8 138,5 138 откорма(кг) всего       На 1 голову (кг) 4,05 3,96 3,94 На 1 голову в сутки, г 103,8 101,5 101,0 Затраты корма на 1 кг 1,88 1,77 1,78 прироста живой массы, кг       % к контролю 100 94,1 94,7

Исследования показали, что благодаря использованию пробиотика улучшились результаты откорма бройлеров.

Сохранность птицы в опыте была 100%-ной. Живая масса цыплят 28-дневного возраста была выше на 3,9% в опытной группе 2, получавшей в начале жидкий, а затем сухой препарат на всем протяжении периода выращивания.

В опытной группе 3, получавшей жидкий пробиотик первые 5 дней, а затем сухой в период вакцинации (14-21 день), она также превысила контроль на 2,2%.

К концу периода откорма данная закономерность сохранилась. Так, в группе 2 живая масса бройлеров оказалась выше, чем в контрольной группе 1, на 4,0%. Наиболее высокой живой массой по сравнению с контролем отличились курочки (на 4,8%), у петушков различия составили 3,2%.

В опытной группе 3 живая масса цыплят была выше, чем в контрольной группе, на 2,7%. При этом наблюдались тенденция к большему увеличению живой массы курочек (на 4,3%) по сравнению с петушками (на 1,3%).

Среднесуточный прирост живой массы бройлеров был высоким - 55,2-57,4 г.В опытных группах, получавших пробиотик, он был выше, чем в контроле, на 2,2 г. (группа 2) и на 1,5 г (группа 3).

Птица опытных групп потребляла меньше корма по сравнению с контрольной группой. Различия составили 2,2% (группа 2), 2,7%(группа 3). Это свидетельствует о лучшей перевариваемости и использовании бройлерами данных групп питательных веществ корма.

Важным показателем экономической эффективности выращивания бройлеров являются затраты кормов на 1 кг прироста живой массы. Результаты опыта показали, что наиболее низкие затраты корма на единицу продукции были получены в опытной группе 2, которые оказались меньше, чем в контрольной группе, на 5,9%. В опытной группе 3 данный показатель был ниже, чем в контрольной группе, на 5,3%.

ПРИМЕР 2

Опыт в профилактических целях (на 40 голов) без использования антибиотиков

Путем выпаивания жидким пробиотиком по 2 мл на голову один раз в день в течение 3 дней подряд (новорожденным поросятам) с целью предотвращении диареи. Среди новорожденных поросят были гипотрофики (массой меньше 1 кг).

Диареи в опытной группе впоследствии не наблюдалось по сравнению с контрольной группой, у которой диарея наблюдалась у 70% поросят.

Гипотрофики в опытной группе набрали вес, как и нормотрофики около 8-8,5 кг.

Вывод:

1) в условиях хозяйства без применения пробиотика, но с применением антибиотика, исходя из результата опыта на 1500 голов в среднем предприятие недополучает 157 500 кг мяса

2) при использовании пробиотика хозяйство получило бы дополнительно

вышеуказанный объем мяса, что в денежном отношении составляет 7 875 000 руб.

В лечебных целях больным поросятам (с признаками диареи) путем выпаивания назначают жидкий пробиотик по 3 мл на голову один раз в день в течение трех дней подряд с целью прекращения диареи. После курса лечения диарея у поросят прекратилась и они не отставали в росте и развитии по сравнению с контрольной группой.

Опыты были проведены с пробиотиком с титром не менее 10⁹.

Способ производства пробиотика с титром 10¹¹ уменьшает расход препарата в сто раз, что в конечном счете сказывается на прибыли сельхозпредприятия.

Препарат производится в стерильных условиях и на современном оборудовании, что позволяет получить очищенный от посторонней микрофлоры продукт.

Рекомендуемые нормы ввода пробиотика для птицы яичного направления (несушек): Период Дозировка, г на 1 Курс Комментарии   голову (сутки)   Престарт 0,015 5 Задача препарата: заселение       организма нормальной       микрофлорой, что особенно       важно в первые дни жизни.       Ожидаемый эффект:       повышение сохранности и       достижение оптимальной       однородности стада Старт 0,025 5-7 Задача препарата:       локализация       постантибиотического и       поствакционального стрессов,       восстановление нормобиоза       кишечника после применения       антибиотиков, повышение       иммунного статуса. Особенно       важно после вакцинаций       против болезни Ньюкасла и       инфекционного       ларинготрахеита. Рост 0,05 1 -3 курса по 5-7 Задача препарата: локализация кормового     дней стресса, получаемого птицей в       результате резкой смены       структуры и питательности       рациона, профилактика       желудочно-кишечных       заболеваний инфекционной       (кокцидиозы, кол и       бактериозы, сальмонеллез и       пр.) и алиментарной орироды       (ацидоз, дисбактериоз и др.).       Оптимальный промежуток       между курсами - 3 недели. Предкладка 0,075 5-7 Задача препарата;       локализация кормового       стресса, получаемого птицей       в результате резкой смены       структуры и питательности       рациона, профилактика Перевод в 0,1 5-7 Задача препарата; промышленную     локализация последствий зону     технологических и кормовых       стрессов, обеспечение       оптимального срока выхода       на пик продуктивности,       профилактика Предпик - Пик 0,1 5-7 Задача препарата: улучшение       конверсии корма, обеспечение       оптимального срока выхода       на пик продуктивности,       улучшение использования       кальция и фосфора, снижение       патогенной микрофлоры       толстого отдела кишечника в       результате улучшения       переваримости протеина и       клетчатки корма,       профилактика 2-я фаза яйценоскости 0,1 5-7 Задача препарата: локализация кормового       стресса, получаемого птицей       в результате резкой смены       структуры и питательности       рациона, профилактика Период 0,1 2 курса Задача препарата: падения   по 3 дня максимальное замедление яйценоскости     падения продуктивности,       связанного с физиологией       птицы, профилактика.       Оптимальный промежуток       между курсами - 3 недели. При длительном сроке использования птицы возможен дополнительный курс (3 дня по 0,1 г)

Рекомендуемые нормы ввода пробиотика для бройлеров: г на голову в сутки) Престарт 0,015 Старт 1 неделя 0,025 Старт 2 неделя 0,050 P JCT 0,075

Рекомендуемые курсы и нормы ввода для поросят (профилактика): Для поросят-сосунов в целях 3-5 дней по 3-5 г на голову профилактики:   При отъеме в целях локализации стресса: 3-5 дней по 5-7 г на голову На доращивании единовременно в целях 3-5 дней по 7-10 г на голову профилактики   - Гипотрофикам для приближения к стандартам: до 10 дней 5 дней по 3-5 г на голову от 10 до 30 дней 5 дней по 5-7 г на голову   старше 30 дней 5 дней по 7-10 на голову   (ежемесячно)  

Рекомендуемый курс и нормы ввода для свиноматок (профилактика): 1 цикп; за 4 недели до опороса 5-7 дней по 10 г на голову 2 цикл: за 1 неделю до опороса 5-7 дней по 10 г на     голову 3 цикл: после опороса 5-7 дней по 10 г на     голову

Рекомендации по использованию сухого водорастворимого пробиотика для крупного рогатого скота

- Новорождённым телятам применяют жидкий пробиотик перорально ежедневно с молоком, молозивом, их заменителями, прокипяченной водой или 5-10% водным раствором глюкозы/декстрозы в дозе 7-10 мл на 1 голову 2 раза в сутки с первого дня после рождения в течение 3-5 дней;

- впоследствии для профилактики дисбактериоза, а также в качестве естественного стимулятора роста слабым телятам пробиотик назначают с кормом, молоком или водой в дозе 10 г на 1 голову в течение 3-5 дней (по показаниям). Через 3 недели курс профилактики может быть повторен;

- для лечения желудочно-кишечных инфекций, дизбактериоза и диареи суточную дозировку препарата необходимо увеличить в 1,5-2 раза (по показаниям);

- в целях профилактики и лечения легочных инфекций применяется аэрозольная обработка ноздрей теленка водным раствором препарата (10 мл на 1000 мл воды);

- для получения здорового приплода пробиотик назначают с кормом или водой глубокостельным коровам и нетелям по 10 1 раз в сутки в течение 5-10 дней за 3-4 недели до отела, курс необходимо повторить непосредственно перед отелом (не менее 3 дней до и 3 дней после отела).

Способ производства пробиотического препарата на основе спорообразующих штаммов Bac.subtilis и Вас.licheniformis предусматривает культивирование штаммов, смешивание биомасс клеток бактерий с протектором микробных клеток и последующее стерильное обезвоживание. При этом в способе используют штамм Bac.subtilis BKM B-2287 D и штамм Bac.licheniformis BKM B-2414D. Биомассы штаммов смешивают в соотношении 1:1. В качестве протектора микробных клеток используют лактозу в количестве, обеспечивающем титр клеток в готовом продукте после сушки не менее 1×10¹¹ КОЕ/г. Способ позволяет получить препарат, обладающий широким спектром действия и который может быть использован для профилактики желудочно-кишечных заболеваний у с/х животных и птицы, предупреждения стрессовых воздействий, коррекции микрофлоры в кишечнике при нарушении процессов пищеварения. 6 табл.

Способ производства пробиотического препарата на основе спорообразующих штаммов Bac.subtilis и Bac.licheniformis, предназначенного для профилактики желудочно-кишечных заболеваний у животных и птицы, включающий культивирование штаммов Bac.subtilis и Bac.licheniformis, смешивание биомасс клеток бактерий с протектором микробных клеток и последующее стерильное обезвоживание, отличающийся тем, что используют штамм Bac.subtilis BKM B-2287D и штамм Bac.licheniformis BKM B-2414D, биомассы штаммов смешивают в соотношении 1:1, в качестве протектора микробных клеток используют лактозу в количестве, обеспечивающем титр клеток в готовом продукте после сушки не менее 1×10¹¹ КОЕ/г.