СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЭКСТРАКТОВ ИЗ АРКТИЧЕСКИХ БУРЫХ ВОДОРОСЛЕЙ, ОБЛАДАЮЩИХ БАКТЕРИОСТАТИЧЕСКИМИ И ФУНГИСТАТИЧЕСКИМИ СВОЙСТВАМИ Российский патент 2025 года по МПК A23L17/60 

Изобретение относится к медицинской, лечебно-профилактической, фармацевтической области, а именно к экстрактам бурых водорослей (БВ) вида Ascophyllum nodosum (A. nodosum) или Fucus Vesiculosus, которые обладают бактериостатическими и фунгистатическими свойствами.

Получаемые экстракты бурых водорослей могут быть использованы как перспективные безопасные для окружающей среды препараты биологического происхождения.

Бурые водоросли являются богатым источником биологически активных соединений, таких как белки, аминокислоты, полисахариды, жирные кислоты, витамины, микро- и макроэлементы, целлюлоза, пигменты, полифенолы и т.д., которые обладают широким спектром биологической активности: антиоксидантной, противовирусной, противоопухолевой, противовоспалительной и антибактериальной [Zhao, C., Yang, C., Liu, B., Lin, L., Sarker, S.D., Nahar, L., Yu, H., Cao, H., Xiao, J. Bioactive compounds from marine macroalgae and their hypoglycemic benefits. Trends Food Sci. Technol. 2018, 72, 1-12. Eunyoung Park, Hahyeong Yu, Jeong-Ho Lim, Jeong Hee Choi, Kee-Jai Park, Jihyun Lee. Seaweed metabolomics: A review on its nutrients, bioactive compounds and changes in climate change. Food Research International. - Volume 163. - 2023. P. -11222. https://doi.org/10.1016/j.foodres.2022.112221]. Таким образом, эти соединения обеспечивают высокий потенциал применения экстрактов бурых водорослей в различных областях. Однако, большинство исследователей уделяют внимание на способ экстракционного извлечения компонентов водорослей, направленный на избирательное выделение отдельных соединений или их узких групп [Katharina Nokling-Eide, Fangchang Tan, Shennan Wang, Qi Zhou, Mina Gravdahl, Anne-Mari Langeng, Vincent Bulone, Finn Lillelund Aachmann, Havard Sletta, Oystein Arlov. Acid preservation of cultivated brown algae Saccharina latissima and Alaria esculenta and characterization of extracted alginate and cellulose. Algal Research. Volume 71. 2023. 103057. https://doi.org/10.1016/j.algal.2023.103057. Dietz Carina, Shubham Sharma, Amit K. Jaiswal, Swarna Jaiswal/ Seaweeds polysaccharides in active food packaging: A review of recent progress. Trends in Food Science & Technology. -Volume 110. -2021. -P. 559-572. https://doi.org/10.1016/j.tifs.2021.02.022]. В то же время получение комплексных экстрактов, содержащих компоненты, обладающих различными ценными свойствами, остается без внимания.

Стоит обратить внимание на то, что в получении комплексных экстрактов, обладающих бактериостатическими и фунгистатическими свойствами, ключевым моментом является способ обработки биомассы водорослей. В настоящее время существуют множество подходов идентификации экстракционного извлечения, которые можно подразделять по нескольким категориям: физические и химические [Irianto Irianto, Agustien Naryaningsih, Ni Wayan Trisnawati, Astuti Astuti, Kokom Komariyah, Lailatul Qomariyah, Chaidir Chaidir, Ariyanti Saputri, Rika Wulandari, Dwila Nur Rizkiyah, Nicky Rahmana Putra. From sea to solution: A review of green extraction approaches for unlocking the potential of brown algae. South African Journal of Chemical Engineering. Volume 48. 2024. P. 1-21. https://doi.org/10.1016/j.sajce.2024.01.001; Viruja Ummat, Saravana Periaswamy Sivagnanam, Gaurav Rajauria, Colm O'Donnell, Brijesh Kumar Tiwari. Advances in pre-treatment techniques and green extraction technologies for bioactives from seaweeds. Trends in Food Science & Technology. Volume 110. 2021. P. 90-106. https://doi.org/10.1016/j.tifs.2021.01.018]. К физическим воздействиям можно отнести такие обработки как набухание, ультразвуковая обработка, микроволновая излучения и воздействие электрического поля. К химическим относятся обработка ферментами, добавка специфических реагентов, например, ПАВ.

Многие экстракты морских водорослей (ЭМВ) обладают фунгицидными, инсектицидными и антибактериальными свойствами. Показано, что ламинаран и сульфатированные фуканы из бурых водорослей вызывают множественные защитные реакции у люцерны (Medicago sativa L.) и табака (Nicotiana tabacum L.) [Kobayashi A., Tai A., Kanzaki H., Kawazu K. Elicitor-active oligosaccharidesfrom algal laminaran stimulate the production of antifungal compoundsin alfalfa // Z. Naturforsch. 1993. Vol. 48. P. 575-579; Klarzynski O., Descamps V., Plesse B., Yvin J.C., Kloareg B., Fritig B. Sulfated fucan oligosaccharides elicit defense responses in tobacco and local and systemic resistance against tobacco mosaic virus // Mol. Plant Microbe Interact. 2003. Vol. 16. P. 115-122]. Аналогично каррагинанам сульфатированные линейные галактаны являются эффективными элиситорами у растений табака [Mercier L., Lafitte C., Borderies G., Briand X., Esquerre-Tugaye M. T., Fournier J. The algal polysaccharide carrageenans can actas an elicitor of plant defence // New Phytol. 2001. Vol. 149. P. 43-51].

Ламинараны, фукоиданы и растворимые альгиновые кислоты бурых водорослей морей Дальнего Востока повышают устойчивость сои к бактериозу и грибковым болезням, на что указывает снижение пораженности растений почвенными патогенами и повышение урожая сои [Заостровных В.И., Трофимова Т.Ф., Шевченко Н.М., Чайкина Е.Л., Звягинцева Т.Н., Анисимов М.М. Влияние углеводсодержащих биополимеров из морских водорослей на устойчивость сои к заболеваниям // Защита и карантин растений. 2009. № 12. С. 24].

Опрыскивание листьев винограда экстрактом A. nodosum уменьшало зараженность фитофторой Phytophthora capsici у Capsicum и плазмопарой Plasmopara viticola [Lizzi Y., Coulomb C., Polian C., Coulomb P.J., Coulomb P.O. Seaweed and mildew: what does the future hold. Laboratory tests have produced encouraging results // Phytoma. 1998. Vol. 508. P. 29-30]. Показана эффективность применения бетаинов в низких концентрациях при поражении растений грибковой инфекцией [Blunden G. Betaines in the plant kingdom and their use in ameliorating stress conditions in plants // Acta Hortic. 2003. Vol. 597. P. 23-29].

При выращивании капусты внесение в почву жидких ЭМВ стимулировало рост и активность микроорганизмов, которые являются антагонистами Pythium ultimum, опасного грибкового патогена, возбудителя черной ножки у проростков капусты [Dixon G.R., Walsh U.F. Supressing Pythium ultimum induced damping-off in cabbage seedlings by biostimulation with proprietary liquid seaweed extracts // Acta Hortic. 2004. Vol. 635. P. 103-106].

В отношении насекомых - вредителей растений ЭМВ также находят эффективное применение. Так, питающиеся соком насекомые обычно избегают растений, обработанных ЭМВ. Распыление гидролизованных ЭМВ на яблони уменьшало популяции красных паутинных клещей, а применение экстрактов в течение 2-3 лет снижало их до уровня, наблюдаемого при применении акарицидов [Stephenson W.M. The effect of hydrolyzed seaweed on certain plant pests and diseases // Proc. Int. Seaweed Symp. 1966. Vol. 5. P. 405-415]. Также замечено, что использование экстракта Maxicrop на растениях клубники значительно сокращает популяцию обыкновенного паутинного клеща (Tetranychus urticae) [Hankins S. D., Hockey H.P. The effect of a liquid seaweed extract from Ascophyllum nodosum (Fucales, Phaeophyta) on the two spotted red spider mite Tetranychus urticae. Hydrobiologia. 1990. Vol. 204(205). P. 555-559].

Хлороформный и бензольный экстракты бурой водоросли Padina pavonica продемонстрировали нимфицидную активность и способность значительно сокращать или увеличивать период развития личинок красного хлопкового жука (Dysdercus cingulatus). Такой эффект связывают с содержанием в ЭМВ гормонов, препятствующих развитию вредителей на стадии зародыша [Sahayaraj K., Kalidas S. Evaluation of nymphicidal and ovicidal effect of a seaweed, Padina pavonica (Linn.) (Phaeophyceae) on cotton pest, Dysdercus cingulatus (Fab.) // Indian J. Geo-Marine Sci. 2011. Vol. 40. P. 125-129]. Имеются данные и о противовирусном действии ЭМВ. Так, у препарата SPS4, изготовленного из красной водоросли Hypnea musciformis, выявлена биологическая активность против вируса табачной мозаики [Grannam A., Abbas A., Alek H., Al-Waari Z., Al-Ktaifani M. Enhancement of local plant immunity against tobacco mosaic virus infection after treatment with sulphaned-carrageenan from red alga (Hypnea musciformis) // Physiol. Mol. Plant Pathol. 2013. Vol. 84. P. 19-27]

Известен способ получения экстрактов, проявляющих антимикробную активность, из растений рода василек (Centaurea L.) (Рахмаева А.М., Гумерова С.М., Теренжев Д.А., Шаронова Н.Л., Фицев И.М. Антимикробная активность и фитотоксичность экстрактов некоторых вида растений рода Centaurea // Вестник Казанского государственного аграрного университета. - 2020. Том 15. №3 (59). С. 37-42). Авторы данной работы получают экстракты методом мацерации, при экстракции в качестве экстрагента используют чистый этанол, притом соотношения растительного объекта к экстрагенту 1:5, продолжительности процесса 1,5 часа, после окончания процесса экстракт фильтровали и концентрировали в роторном испарителе.

Однако, в указанном способе есть недостатки. Во-первых, метод мацерации требует длительного времени для проведения процесса (1,5 часа), что может быть неэффективно в случае необходимости получения экстракта в сжатые сроки. Во-вторых, соотношение растительного объекта к экстрагенту 1:5 может быть неоптимальным для извлечения всех полезных веществ из растения, что возможно потребует использование большего количества экстрагента. В-третьих, постпроцессуальная обработка экстракта в роторном испарителе может потребовать дополнительного времени и усилий, что может быть неудобным или дорогостоящим. В-четвертых, чистый этанол, как экстрагент, может быть опасен при работе из-за его летучих и горючих свойств. Он также может повлиять на окончательный состав экстракта и его качество.

Известен способ получения экстрактов из дикорастущих растений, обладающих фунгистатической активностью (Сивцева С.В., Охлопкова Ж.М. Фунгистатическая активность экстрактов из некоторых дикорастущих растений Якутии // Ученые записки Петрозаводского государственного университета. - 2016. Том 159. № 6. С. 106-113.).

Способ состоит в том, что экстракцию дикорастущих растений проводят с использованием метилового спирта при продолжительности процесса 24-48 часов при периодическом перемешивании, по окончании процесса экстракт фильтруют через антибактериальный бумажный фильтр, жидкий экстракт перемещают в роторный испаритель и концентрируют в течение 4-5 часов, концентрат сушат в лиофилизаторе в течение 4-5 часов.

Недостатки такого метода включают в себя длительность процесса экстракции, использование метилового спирта, который может быть опасен для здоровья при неправильном использовании, а также необходимость специализированного оборудования для концентрации и сушки экстракта. Кроме того, такой метод может быть неэффективен для некоторых видов растений, что может привести к низкому выходу экстракта.

Известен способ получения экстрактов, обладающих противомикробным действием, из листьев Oncoba spinosa Forssk (Salicaceae) (Djouossi, M.G., Tamokou, JdD., Ngnokam, D. et al. Antimicrobial and antioxidant flavonoids from the leaves of Oncoba spinosa Forssk. (Salicaceae). BMC Complement Altern Med 15, 134 (2015). https://doi.org/10.1186/s12906-015-0660-1). Djouossi, M.G.), при котором обрабатывают 2 кг листьев Oncoba spinosa Forssk в метаноле методом процеживания в течение 3 дней при комнатной температуре. Метанол после обработки выпаривают при пониженном давлении. В результате из 2 кг образца получают 40 г экстракта.

Данный способ содержит несколько недостатков. Так, использование большого количества растворителя может быть недостаточно экологически безопасным. Длительность процесса (процеживание в течение 3 дней) может быть излишне долгим, особенно при использовании комнатной температуры, что может повысить риск загрязнения образца или нежелательное разложение активных компонентов. Низкий выход экстракта (40 г экстракта из 2 кг образца) может указывать на недостаточную эффективность метода извлечения компонентов из листьев Oncoba spinosa Forssk.

Наиболее близким к заявленному является способ получения полифенольного комплекса (Патент RU №2741634, МПК A23L 17/60 от 2020 г.), обладающего бактериостатическим и фунгистатическим действиями, и представляющего собой продукт трехэтапной экстракции бурых водорослей. Способ заключается в следующем: на первом этапе биомассу водорослей обрабатывают хлороформом в аппарате Сокслета в течение 8 часов, по окончании экстракции отделяют водорослевой остаток, высушивают и измельчают. На втором этапе экстрагируют ацетоном в две стадий по 1 ч с гидромодулем 1:20, затем ацетоновый экстракт фильтруют через капроновый фильтр и центрифугируют для удаления остатков. На третьем этапе полученный экстракт концентрируют на роторном испарителе и добавляют воду, далее высушивают лиофильно и получают продукт.

Недостатки такого метода получения полифенольного комплекса могут включать сложность и длительность процесса, использование химических реагентов (хлороформ, ацетон), которые могут быть вредными для здоровья и окружающей среды. Также авторы сконцентрированы лишь на получении только одного продукта из биомассы бурых водорослей, тогда как бурые водоросли обладают более широким спектром биоактивных веществ.

Задачей и техническим результатом предлагаемого изобретения является получение сухих экстрактов арктических бурых водорослей, обладающих бактериостатическим и фунгистатическим эффектами при уменьшении продолжительности процесса и без использования опасных химических реагентов.

По заявленному способу воздушно-сухие талломы бурых водорослей Ascophyllum nodosum и/или Fucus Vesiculosus измельчают до размера фракций 0,25-0,50 мм. Полученную биомассу арктических бурых водорослей разбавляют дистиллированной водой с гидромодулем 1:12 для предварительного набухания перед основной экстракцией в течение 1 часа, что способствует увеличению доступности биологически активных веществ и облегчает процесс их извлечения. Затем добавляют органический растворитель - изопропаноловый спирт (для получения 40%-ной концентрации изопропанола) с гидромодулем 1:20 и подвергают ультразвуковому воздействию при мощности 10 ± 2 Вт в течение 30 минут при температуре 60°С для разрушения клеточной структуры биомассы водорослей и повышения выхода биологически активных веществ. После этого проводят основную экстракцию в термостатирующем устройстве при температуре 60°С в течение 1 часа. Полученный экстракт отделяют от водорослевого остатка путем декантации и центрифугированием. Затем экстракт концентрируют на роторном испарителе до густого состояния. После высушивают в вакуумном сушильном шкафу до сухого порошкообразного состояния. Полученный сухой экстракт представляет собой водорастворимый порошок светло-коричневого цвета.

Таким образом, время получения препарата высокоэффективного экстракта биологически активных веществ сокращается по отношению к прототипу в 4-5 раз.

Выбор изопропанолового спирта для получения сухих экстрактов обоснован следующим:

- изопропаноловый спирт не относится к спиртосодержащей продукции, т.е. законодательство по спиртосодержащей продукции (Закон от 22.11.1995 №171-ФЗ) на оборот этого спирта не действует;

- по степени воздействия на организм относится к веществам 3 -го класса опасности (умеренно опасные вещество) по ГОСТу 12.1.007;

- в медицине изопропаноловый спирт используется как эффективный антисептик;

- в косметологии используется при производстве кремов (до 5%).

Подтверждение возможности получения данным способом сухих экстрактов из биомассы арктических бурых водорослей, обладающих бактериостатическим и фунгистатическим свойствами, приводится в следующем примере 1.

Пример 1

Воздушно-сухие талломы водорослей вида фукуса Ascophyllum nodosum и/или Fucus Vesiculosus измельчают до размера фракций 0,25-0,50 мм. В колбу вносят 2,5 г измельченной навески водорослей. Перед основной экстракцией колбу с навеской предварительно оставляют на набухание в дистиллированной воде при гидромодуле 1:12 в течение 1 часа. Затем добавляют органический растворитель (для получения 40%-ной концентрации изопропанола) при гидромодуле 1:20, после устанавливают в ультразвуковую ванну (100 Вт, частота 35 кГц; Сапфир, Россия) при температуре 60°С, мощности ультразвука 10 ± 2 Вт, времени воздействия 30 минут. По прошествии обработки колбу с образцом помещают в термостат и проводят основную процедуру экстракции при температуре 60°С в течение 60 минут. После экстракции смесь центрифугируют при 9000 об/мин 5 мин (Universal 320, Hettich, Германия). Экстракт отделяют от водорослевого осадка методом декантации. Полученный изопропаноловый экстракт концентрируют на роторном испарителе до густого состояния. Водный экстракт высушивают в вакуумном сушильном шкафу (Binder VD 23, Binder, Германия) при температуре 40°С и давлении в системе ≤ 500 Па. Сухие экстракты растирают в фарфоровой ступке до порошкообразного состояния.

Новый продукт представляет собой сухой водорастворимый экстракт биологически активных веществ арктических бурых водорослей, который в отличие от прототипа обладает бактериостатическим и фунгистатическим свойствами.

Были проведены испытания бактериостатической и фунгистатической активности сухих экстрактов, полученных по примеру 1.

Изучена бактериостатическая активность экстракта водорослей Ascophyllum nodosum с использованием микроорганизмов, выделенных из биологического материала больных с воспалительными процессами. Средние результаты экспериментального исследования получены при испытании не менее 20 культур каждого штамма; оценку эффективности бактериостатического влияния производили в %. В качестве испытуемого субстрата использовали водную суспензию экстракта 100, 250, 500 мкг /мл.

Бактериостатический и фунгистатический эффекты выявляли по наличию зоны задержки роста микроорганизмов на плотной питательной среде; гноеродные кокки (St. aureus и St. pneumoniae) высевали на сывороточный агар, клебсиеллы (Klebsiella pneumoniae), кишечную палочку (E. coli) и фекальные стрептококки (Streptococcus faecalis) - на мясопептонный агар, для получения роста дрожжеподобных грибов рода Саndida (C. albicans) использовали агаровую сахарную среду Сабуро. Для посева 200 млн микроорганизмов в объеме 1 мл равномерно распределяли шпателем по поверхности плотной питательной среды чашки Петри; засеянные чашки Петри закрытыми выдерживали при комнатной температуре в течение 5 минут, после чего 0,02 мл водной суспензии испытуемого субстрата наносили на поверхность посева. Посевы бактерий инкубировали при температуре 37°С в течение суток, посевы грибов выдерживали при 30°С в течение 2-х дней. За положительный бактерицидный эффект принимали наличие задержки роста микроорганизмов не менее 1,5 см в диаметре по месту нанесения экстракта. Каждая доза исследованной суспезии проверена на 20-25 штаммах микроорганизмов.

По результатам проведенных исследований установлен значимый бактериостатический эффект по отношению к культурам бактерий (грамположительных) St. aureus, St. pneumoniae, Str. faecalis, Bac. Subtilis и (грамотрицательных) E. coli, E. cloacae, Kl. pneumoniae. А также показана фунгистатическая активность к подавлению роста дрожжеподобных и нитчатых грибов (Candida albicans, Candida tropicalis) и (Aspergillus niger, Mucor mucosa) соответственно.

Бактериостатический и фунгистатический эффекты экстракта Ascophyllum nodosum представлены в табл.1 и табл.2 соответственно.

Таблица 1. Бактериостатический эффект экстракта Ascophyllum nodosum

Штаммы бактерий Чувствительность бактерий к экстрактам (%) в зависимости от концентрация (мкг/мл) 100 250 500 St. aureus 12 20 28 Str. pneumoniae 95 80 95 Str. faecalis 44 52 72 Bac. subtilis 55 65 75 Средний, % Грам+ 47.14±4.9 58.57±3.2 ³ 68.85±3.3 ³ E. coli 16 60 64 E. cloacae 55 65 75 Kl. pneumoniae 45 60 60 Средний, % Грам- 36.9±4.5 61.5±2.6 ³ 66.1±3.8 ³

1 - p<0.05, 2 - p<0.01, 3 - p<0.001

Экстракт Ascophyllum nodosum обладает антисептическими свойствами, вызывая бактерицидное и бактериостатическое влияние в условиях in vitro на грамотрицательные и грамположительные бактерии. Частота выявления задержки роста микроорганизмов находилась в пределах 36-69% и зависела от концентрации экстракта. Дозозависимость бактериостатической активности экстракта Ascophyllum nodosum статистически достоверна при использовании концентраций 250 и 500 мкг/мл.

Таблица 2. Фунгистатический эффект экстракта Ascophyllum nodosum

Штаммы бактерий Чувствительность грибов к экстрактам (%) в зависимости от концентрация (мкг/мл) 100 250 500 C. albicans 5 15 15 C. tropicalis 10 30 45 Средний, % дрожжеподобных 7.5±3.1 15.0±2.8 ³ 30.0±2.8 ³ A. niger 16 12 20 M. mucosa 15 15 35 Средний, % плесеней 15.6±2.2 13.3±2.6 26.7±2.5 ³

1 - p <0.05, 2 - p <0.01, 3 - p <0.001

Субстанция обладает достаточно значимом фунгистатическим эффектом на испытуемых штаммах грибов. Частота выявления задержки роста грибов находилась в пределах 7-30% и зависела от концентрации экстракта. Дозозависимость бактериостатической активности экстракта Ascophyllum nodosum статистически достоверна при повышении концентраций до 100 и 500 мкг/мл.

Применение экстракта Ascophyllum nodosum в качестве антисептика может быть полезным для борьбы с инфекциями, вызванными вышеуказанными патогенами. Этот природный комплекс может использоваться в качестве альтернативы синтетическим антисептикам для лечения различных воспалительных процессов.

Данные исследования позволяют выделить Ascophyllum nodosum как потенциальный источник природных средств для борьбы с бактериальными и грибковыми инфекциями.

Таким образом, заявленное изобретение обеспечивает достижение указанного технического результата, а именно получение сухих экстрактов арктических бурых водорослей, обладающих бактериостатическим и фунгистатическим свойствами.

Изобретение относится к производству экстрактов бурых водорослей (БВ) вида Ascophyllum nodosum (A. nodosum) или Fucus Vesiculosus, которые обладают бактериостатическими и фунгистатическими свойствами. Способ получения водорастворимых порошкообразных экстрактов биологически активных веществ арктических бурых водорослей Ascophyllum Nodosum или Fucus Vesiculosus включает предварительное набухание биомассы бурых водорослей при гидромодуле 1:12 в течение 1 часа при комнатной температуре, ультразвуковую обработку при температуре 60°С, мощности ультразвука 10 ± 2 Вт в течение 30 мин. После чего проводят экстракцию водорослей 40%-ным по массе раствором изопропанола при 60°С в течение 1 часа при гидромодуле 1:20 и центрифугируют при 9000 об/мин в течение 5 минут. Осуществляют декантирование полученных экстрактов, высушивание при температуре 40°С и давлении ≤500 Па и измельчение до порошкообразного состояния. Изобретение направлено на получение сухих экстрактов арктических бурых водорослей, обладающих бактериостатическим и фунгистатическим эффектами при уменьшении продолжительности процесса и без использования опасных химических реагентов. 2 табл., 1 пр.

Способ получения водорастворимых порошкообразных экстрактов биологически активных веществ арктических бурых водорослей Ascophyllum Nodosum или Fucus Vesiculosus, включающий предварительное набухание биомассы бурых водорослей при гидромодуле 1:12 в течение 1 часа при комнатной температуре, ультразвуковую обработку при температуре 60°С, мощности ультразвука 10 ± 2 Вт в течение 30 мин, последующую экстракцию водорослей 40%-ным по массе раствором изопропанола при 60°С в течение 1 часа при гидромодуле 1:20, центрифугирование при 9000 об/мин в течение 5 минут, декантирование полученных экстрактов, высушивание при температуре 40°С и давлении ≤500 Па и измельчение до порошкообразного состояния.