Способ отбора и пробоподготовки шерсти собак для скрининга микроэлементного состава Российский патент 2025 года по МПК A61D99/00 

Изобретение относится к ветеринарии, а именно к ветеринарной диагностике, и может быть использовано при отборе проб шерстного покрова собак для оценки особенностей метаболизма химических элементов в организме.

Волосяной (шерстный) покров служит одним из объективных показателей приспособленности животного к условиям среды. Шерсть является второй по порядку метаболически активной тканью организма, их микроэлементный статус соответствует определенному периоду накопления элемента, а не моменту взятия пробы (Степанова, М.В. Содержание тяжелых металлов и мышьяка в окружающей среде и биосубстратах диких и экзотических птиц и млекопитающих в условиях зоопарков: дис. доктора биологических наук: 06.02.05 Ветеринарная санитария, экология, зоогигиена и ветеринарно-санитарная экспертиза (биологические науки): диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук / Степанова Марина Вячеславовна. - Ярославль, 2021. - 477 с.). В этой связи неинвазивные методики взятия и оценки химического состава шерсти позволяют разрабатывать индивидуальные программы профилактики и коррекции элементозов.

Волос (шерсть), как биосубстрат, не требует специального оборудования для хранения и транспортировки, может храниться практически неограниченное время, не теряя своей информационной ценности. При этом следует учесть, что концентрация химических элементов в волосах значительно выше, чем в физиологических жидкостях традиционно используемых в клинической практике при проведении биохимических анализов, что позволяет существенно расширить набор химических элементов, доступных для аналитического определения (Харламов, А.В. Информативность биосубстратов при оценке элементного статуса сельскохозяйственных животных (обзор) / А.В. Харламов, А.Н. Фролов, О.А. Завьялов, A.M. Мирошников // Вестник мясного скотоводства. 2014. №4 (87). С. 53-58).

За последнее десятилетие численность домашних животных в различных странах мира существенно выросла. Кожа является самым крупным и обширным органом тела, составляющим от 12 до 24% массы тела собаки, в зависимости от ее вида, размера и возраста. Большая часть внешнего слоя кожи собаки покрыта шерстью, которая обеспечивает эффективную защиту организма от воздействия неблагоприятных факторов внешней среды, образуя барьер. Важно отметить, что состояние кожи и шерсти собаки может служить надежным критерием общего состояния здоровья животного (Баюров, Л.И. Свойства собачьей шерсти и возможные пути ее использования / Л.И. Баюров, К.Д. Михеева // Политематический сетевой электронный научный журнал Кубанского государственного аграрного университета. - 2022. - №176. - С. 16-35. - DOI 10.21515/1990-4665-176-002).

В ветеринарии до настоящего времени не существует унифицированной комплексной методики отбора волос (шерсти) собак и подготовки проб для исследований на элементный состав. Не определен порядок, место на теле животного для отбора образцов шерсти.

Известен способ отбора проб шерсти у племенных каракульских овец серой окраски, характеризующийся тем, что у ягнят при рождении и 30 дневном возрасте берут образцы шерсти с 1 см² кожи на крестце и холке с последующим определением степени пигментированности волосков методом электронно-парамагнитной резонансной спектрометрии (Пат. №23604 Республика Казахстан, МПК А01К 67/00 (2010.01). Способ отбора каракульских овец серой масти [Текст] / Байбеков Е., Омбаев A.M., Ескара М.А., Алибаев Н., Саденов А., Абуов Г., Байбеков М.Е.; заявитель и патентообладатель ТОО «Юго-Западный НИИ жив-ва и растениеводства». - №2008/0876.1; заявл. 28.07.2008; опубл. 15.10.2010, Бюл. №12. - 4 с.). Однако данный способ не предназначен для отбора образцов с целью их исследования на элементный состав. Опыт проведен на ягнятах 30-дневного возраста, которые отличаются от собак по морфологии, особенностям строения и формированию волосяного покрова на различных участках тела, в том числе на гриве и хвосте. Животные имеют разные анатомические и физиологические характеристики.

Известны несколько способов отбора шерсти крупных сельскохозяйственных животных:

- способ диагностики хронических микроэлементов сельскохозяйственных копытных животных, характеризующийся отбором образцов шерсти путем настрига ее с кисти хвоста (RU 2477483 С1, опубл. 10.03.2013, Бюл. №7, МПК G01N 33/50 (2006.01));

- способ отбора и подготовки проб шерсти крупного рогатого скота (КРС) для исследований на элементный состав, включающий настриг требуемого образца по массе не менее 0,4±0,01 г с длиной остатка шерсти на корне 0,5 мм, который производится с верхней части холки животного с участка кожи размером 5×5 см в зимний и 10×10 см в летний периоды (RU 2607751 С2, опубл. 10.01.2017, Бюл. №1, МПК G01N 33/48, G01N 33/50);

- способ отбора образцов шерсти для исследования элементного статуса крупного рогатого скота в различные временные периоды (RU 2611755 С1, опубл. 28.02.2017, Бюл. №7, МПК А61В 5/107);

- способ отбора проб волос лошадей для исследования на элементный состав (RU 2675584 С1, опубл. 19.12.2018, Бюл. №35, МПК А61В 5/107, G01N 33/48).

Известен способ отбора проб шерсти у грызунов, характеризующийся тем, что у животных берут образцы шерсти с холки с последующим определением микроэлементов методом атомно-абсорбционной масс-спектрометрии (Пат. №2750749 РФ, МПК G01N 33/48 (2006.01). Способ отбора и пробоподготовки проб шерсти грызунов для определения микроэлементного состава [Текст] / Степанова М.В., Остапенко В.А., Тимаков А.В., Тимакова Т.К.; заявитель и патентообладатель Степанова М.В., Остапенко В.А., Тимаков А.В., Тимакова Т.К. - №2020126630; заявл. 07.08.2020; опубл. 02.07.2021, Бюл. №19. - 10 с.). Опыт проведен на грызунах, которые отличаются от собак по морфологии, особенностям строения и формированию волосяного покрова на различных участках тела, в том числе на гриве и хвосте. Животные имеют разные анатомические и физиологические характеристики.

Очевидно, что указанные выше способы неприемлемы для собак, а изученные химические элементы не дают полной оценки состояния животных. Поэтому основным отличием заявленного способа от известных является то, что шерсть для исследований отбирается с участка кожи спины животного, располагающегося ниже проекции лопаток, а не с разных участков кожи животного. Кроме того, выборка химических элементов, изученных в прототипе, не дает полного представления об уровне обменных процессов по сравнению с предлагаемым способом (n=109), что значительно снижает эффективность способа. Способ проведен на 14 породах собак.

Существенным недостатком прототипа является то, что он не учитывает скорость отрастания волос собак и не предоставляет возможности оценить элементный состав волос в различные возрастные периоды, по участку волоса, сформировавшемуся за соответствующий период времени, что важно в практической работе.

Основным отличием заявленного способа от прототипа является то, что отбор образцов волос производится с участка кожи спины животного, располагающегося ниже проекции лопаток.

Целью нашего изобретения является разработка способа отбора и подготовки проб волос собак для исследования на элементный состав.

Задача настоящего изобретения - определение участка тела собаки для отбора проб шерсти, последовательности этапов пробоподготовки для определения содержания в биосубстрате микроэлементов, установление скорости роста волоса шерстного покрова животного.

Технический результат состоит в повышении эффективности и точности оценки элементного статуса собак и возможности своевременной корректировки дисбаланса обменной концентрации химических элементов в организме животного, а также в предупреждении развития заболеваний.

Поставленная задача решается, а технический результат достигается благодаря способу отбора и пробоподготовки проб шерстного покрова собак для исследования скрининга на микроэлементный состав, включающему настриг требуемого образца волос с участка кожи спины животного, располагающегося ниже проекции лопаток, площадью 1 см² массой от 1 до 3 г ножницами медицинскими в течение всего года, механическую очистку полученного образца, включающую заливку образца ацетоном в объемном соотношении 1:3, соответственно, при постоянном перемешивании в течение 10 минут, дальнейшее перемешивание на протяжении 1 ч и последующую выдержку в ацетоне на протяжении 24 ч, многократную промывку образца дистиллированной водой, высушивание в течение 12 ч для определения сухого веса образца перед анализом, определение длины L шерсти в определенный временной период года, которая рассчитывается с учетом скорости их отрастания от корня по формуле: L=S×I, где

L - дистальное расстояние, отмеряемое от корня волос, мм;

S - скорость роста волос, мм/сут;

I - изучаемый временной период - сутки,

при этом скорость отрастания волос от корня составила S=0,35±0,09 мм/сут.

Заявленный способ осуществляется следующим образом:

1. Отбор образцов волос осуществляется с участка кожи спины животного, располагающегося ниже проекции лопаток, площадью 1 см² массой от 1 до 3 г ножницами медицинскими.

2. Для исследований выбирается участок, отмеряемый от корня волоса, соответствующий дистальному отрастанию за изучаемый возрастной период, который рассчитывается по формуле:

L=S×I,

где L - дистальное расстояние, отмеряемое от корня волос, мм;

S - скорость роста волос, мм/сут;

I - изучаемый возрастной период, сут.

Для реализации предлагаемого способа был проведен эксперимент на собаках, находящихся у частных владельцев и обратившихся в ветеринарную клинику г. Москвы. Исследования выполнены на базе ФГБОУ ВО «Российский биотехнологический университет (РОСБИОТЕХ)» на микро популяциях физиологически здоровых животных следующих пород: длинношерстные - йоркширский терьер (n=12), Английский кокер-спаниель (n=6),чихуахуа (n=5); среднешерстные - аляскинский кли-кай (n=6), аляскинский маламут (n=10), немецкая овчарка (n=9), черный терьер (n=6), бернский зенненхунд (n=7), австралийская овчарка (n=10), метис (n=12); короткошерстные - аргентинский дог (n=6), французский бульдог (n=6), американский стаффордский терьер (n=8), такса (n=6). Все животные находились в половозрелом возрасте.

Исследования проводились в 2022-2023 годах с помощью комплекса современных экологических, биологических и статистических методов на разных породах собак.

Скорость отрастания шерсти определялась на участке кожи спины животного, располагающемся ниже проекции лопаток, площадью 1 см² поверхности тела животного. Поверхность тела выбривалась на участках 1,0×1,0 см. С периодичностью 10 суток производились замеры вновь отрастающей шерсти по массе и длине волокон.

В пробах проводилась оценка уровня содержания микроэлементов и токсичных тяжелых металлов - цинка, меди, железа, кадмия и свинца. Анализ металлов выполнен с помощью атомно-абсорбционной масс-спектрометрии на атомно-абсорбционном спектрометре «Аквилон А-2». Исследования были выполнены в условиях повторяемости и промежуточной прецизионности. При расчете концентраций определяемых элементов в пробах осуществлялась метрологическая обработка результатов в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений».

Полученные результаты обрабатывали статистически. Определяли средние арифметические величины (М), средние ошибки (m) и среднеквадратичное отклонение (δ). Для выявления статистически значимых различий в сравниваемых группах и сопряженности между признаками, характера распределения данных совместимости, были использованы непараметрический критерий W, критерий Шапиро-Уилка, t - тест Стьюдента и коэффициент корреляции Спирмена. Были сформированы базы данных в программах «Microsoft Office Excel» 2010, «Statistica» версия 10.0 в среде Windows ХР.

Пробы отбирались настригом с участка кожи животного массой около от 1 до 3 г (в зависимости от породы собак) ножницами медицинскими в течение всего года. В начале исследований определялся период накопления микроэлементов в отобранных участках шерсти по длине волоса. Для этого с участка кожи спины животного, располагающегося ниже проекции лопаток, площадью 1 см² отбиралась проба шерсти массой от 1 до 3 г. Отобранные таким образом пробы помещались в специальные конверты, которые затем запечатывали и маркировали с указанием вида, пола, года рождения животного и датой взятия пробы.

Далее в лаборатории проводилась очистка волос следующим образом.

1. Пробы помещались в стеклянные емкости с притертой крышкой.

2. Пробы заливались ацетоном в объемном соотношении 1:3 (проба : ацетон) при постоянном перемешивании в течение 10 минут.

3. Затем шерсть выдерживали в ацетоне на протяжении 24 часов.

4. После механической очистки шерсти, пробу многократно (несколько раз) промывали дистиллированной водой и вновь высушивали в течение 12 часов для определения сухого веса образца перед анализом.

После подготовки определялась длина волоса, сформировавшегося в определенный возрастной период, отражающий уровень обменных процессов химических элементов в аналогичный возрастной интервал с учетом даты отбора пробы. Волосы, отобранные с животного, с учетом установленной средней скорости отрастания (10,6±2,4 мм/мес.) (см. табл. 1), разделялись, на участки, соответствующие дистальному отрастанию за зимний и летний период времени.

Дистальное отрастание для каждого участка рассчитывалось по формуле:

L=S×I,

где L - дистальное расстояние, отмеряемое от корня волос, мм;

S - скорость роста волос, мм/сут;

I - изучаемый возрастной период, сут.

Согласно схеме эксперимента продолжительность изучаемых сезонов составила 90 суток. Применив приведенную выше формулу, было рассчитано дистальное отрастание волос за один месяц.

L=0,35 мм/сут × 30 суток = 10,6 мм (короткошерстные: L=0,115 мм/сут × 30 суток = 3,45 мм ≈ 3,5; средняя длинна шерсти: L=0,37 мм/сут × 30 суток = 11,1 мм и длинношерстные: L=0,59 мм/сут × 30 суток = 17,7 мм ≈ 17,5).

Данные по уровню содержания исследуемых микроэлементов в шерсти пород собак представлены в табл. 2.

В зависимости от даты взятия пробы, длины образца шерсти полученных результатов измерения уровня накопления тяжелых металлов были разделены на два периода накопления: летний и зимний сезон. Данные о колебаниях элементного состава шерстного покрова собак за соответствующий период их формирования представлены в табл. 3.

Как видно из таблицы, участки волос, сформировавшиеся в различные сезоны, отличались по концентрации в них химических элементов. Статистически значимые различия отмечались в шерстном покрове собак установлены по железу, свинцу и кадмию (р меньше 0,05). Большинство элементов кумулируются в биосубстратах в более высоких концентрациях за летний период времени, что согласуется с уровнем потребления этих элементов из окружающей среды, с пищей, особенностями физиологических процессов.

Таким образом, применение данного способа позволит повысить эффективность и точность оценки элементного статуса собак и своевременно скорректировать дисбаланс обменной концентрации химических элементов в организме животного, предупредить развитие заболеваний (например, таких как паранеопластические офтальмопатии).

Изобретение относится к ветеринарии и может быть использовано при отборе проб шерстного покрова собак для оценки особенностей метаболизма химических элементов в организме. Для отбора проб шерстного покрова собак для исследования на элементный состав проводят настриг требуемого образца волос длиной L, которую рассчитывают с учетом скорости их отрастания от корня по формуле: L=S×I, где L - дистальное расстояние, отмеряемое от корня волос (мм), S - скорость роста волос (мм/сут), I - изучаемый временной период (сут). Отбор образцов производится с участка кожи спины животного, располагающегося ниже проекции лопаток, при этом скорость отрастания волос от корня S=0,35±0,09 мм/сут. Способ дает информацию о скорости отрастания волоса собак в зависимости от типа шерстного покрова, повышает эффективность и точность оценки элементного статуса собак, позволяет своевременно скорректировать дисбаланс обменной концентрации химических элементов в организме животного, а также учитывает сезонные колебания исследуемых элементов. 3 табл.

Способ отбора и пробоподготовки проб шерстного покрова собак для скрининга на микроэлементный состав, включающий настриг требуемого образца волос с участка кожи спины животного, располагающегося ниже проекции лопаток, площадью 1 см² массой от 1 до 3 г ножницами медицинскими в течение всего года, деление волоса на дистальные участки от корня в соответствии с сезоном отрастания, механическую очистку полученного образца, включающую заливку образца ацетоном в объемном соотношении 1:3 соответственно, при постоянном перемешивании в течение 10 минут, дальнейшее перемешивание на протяжении 1 ч и последующую выдержку в ацетоне на протяжении 24 ч, многократную промывку образца дистиллированной водой, сушку в течение 12 ч для определения сухого веса образца перед анализом, определение длины L шерсти в определенный временной период года, которая рассчитывается по формуле:

L=S×I,

где L - дистальное расстояние, отмеряемое от корня волос, мм;

S - скорость роста волос, мм/сут;

I - изучаемый временной период - сутки,

при этом скорость роста волос от корня составила у короткошерстных собак 0,115 мм/сут, со средней длиной шерсти - 0,37 мм/сут и длинношерстных собак - 0,59 мм/сут.