СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОМПОЗИЦИИ, СОДЕРЖАЩЕЙ ЗРЕЛЫЕ АДИПОЦИТЫ Российский патент 2025 года по МПК C12N5/77 A61K35/35 A61P9/00 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

[0001] Настоящее изобретение относится к способу получения композиции, содержащей зрелые адипоциты. В частности, настоящее изобретение относится к способу получения композиции, содержащей зрелые адипоциты, включающей зрелые адипоциты и кондиционированную среду (например, надосадочную жидкость зрелых адипоцитов), в которой срок выживаемости жирового трансплантата удлиняется путем повышения эффективности реваскуляризации жировой ткани для трансплантации.

ПРЕДПОСЫЛКИ К СОЗДАНИЮ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0002] Пересадка жировой ткани, выполняемая после удаления злокачественной (раковой) опухоли из молочной железы в качестве операции по реконструкции молочной железы, считается безопасной и не способствует метастазированию рака. Таким образом, операция по реконструкции молочной железы обычно выполняется методами пластической и косметической хирургии. Однако из-за большого количества тканей молочной железы выживаемость кусочков жировой ткани, полученных простым отсасыванием жировой ткани из живого организма, составляет всего 30-45% (непатентная литература 1, автор Zhou et al.).

[0003] Низкий уровень выживаемости отсосанных кусочков жировой ткани в реципиентной среде в основном обусловлен отсутствием питающих кровеносных сосудов. Пересаженные «кусочки» жировой ткани, которые были отделены от первоначальных питающих кровеносных сосудов, не получают достаточного питания и подвергаются некрозу. Хорошо известно, что после пересадки кусочки жировой ткани воспринимаются организмом как инородное тело, в результате чего происходит абсорбция, образование кист и кальцификация. Кроме того, сообщалось, что в качестве способа удлинения срока выживаемости был предложен способ, при котором жировые ткани трансплантируют вместе с полученными из жировой ткани стволовыми клетками (ASCs), присутствующими в малой васкулярной фракции (SVF), включенной в стромально-васкулярную фракцию в периваскулярной области жировых тканей (клеточно-опосредованный липотрансфер: CAL) (непатентная литература 2, Eto et al.). При указанном способе стволовые клетки-предшественники жировой ткани малой васкулярной фракции, присутствующие в периваскулярной области, получают путем обработки отсосанных жировых тканей ферментом и удаления жировых компонентов, и затем прививают вместе с отсосанными жировыми тканями. Малая васкулярная фракция характеризуются высокой способностью к самообновлению и мультилинейным потенциалом (непатентная литература 3, Zuk PA et al.).

[0004] Zhou et al. провели систематический обзор 17 статей, включающих 387 случаев (непатентная литература 1, Zhou et al.). Срок выживаемости жира был значительно более длительным в группе клеточно-опосредованного липотрансфера по сравнению с группой, в которой пересаживали только отсосанный жир (60% против 45%, p=0,0096). Клеточно-опосредованный липотрансфер позволил существенно увеличить срок выживаемости лицевого жира (на 19%) и снизить частоту множественных операций (на 13,6%). Однако при пересадке жира в молочную железу срок выживаемости жира увеличивался только на 9% без статистической значимости.

[0005] С другой стороны, клеточно-опосредованный липотрансфер в случаях с раком молочной железы (непатентная литература 2 Eto et al.) был связан с более высокой частотой осложнений по сравнению со случаями пластики лица (p<0,001). Клеточно-опосредованный липотрансфер представляет собой способ, при котором путем использования полученных из жировой ткани стволовых клеток, присутствующих в стромально-вискулярной фракции (SVF), полученной при обработке жировой ткани ферментом, полученные из жировой ткани стволовые клетки, вызывающие реваскуляризацию, и жировая ткань пересаживаются вместе. Однако зачастую не удается выполнение клеточно-опосредованного липотрансфера из-за поглощения пересаженных жировых клеток телом. Причина этого может заключаться в том, что пересаженные жировые ткани отделены от донорских питающих кровеносных сосудов, и многие жировые ткани недополучают питание и подвергаются некрозу, хотя некоторые жировые ткани (жировые ткани в пределах 300 мкм) выживают.

[0006] До настоящего времени два типа клеток, а именно стволовые клетки, полученные из жировой ткани, как клетки-предшественники жировой ткани, и дедифференцированные жировые клетки (DFAT), были успешно разработаны в качестве клеток для реваскуляризации.

[0007] Полученные из жировой ткани стволовые клетки являются клетками-предшественниками жировой ткани, при этом они также являются мультипотентными стволовыми клетками, которые дифференцируются не только в адипоциты, но и в остеоциты, миоциты, хондроциты и т.п. (непатентная литература 3 Zuk PA et al.). Кроме того, сообщалось, что полученные из жировой ткани стволовые клетки способствуют образованию метастазов при раке, поэтому полученные из жировой ткани стволовые клетки не подходят для пересадки жира, обычно выполняемой в хирургии реконструкции молочной железы после удаления злокачественной (раковой) опухоли из молочной железы. Кроме того, полученные из жировой ткани стволовые клетки индуцируют большое количество TNF-α в условиях низкого содержания кислорода, вследствие чего они могут вызывать воспаление, что не позволяет полностью предотвратить поглощение после трансплантации, вызванное индукцией воспаления. Ввиду указанной причины, полученные из жировой ткани стволовые клетки не подходят для трансплантации.

[0008] Кроме того, фактор, посредством которого дифференцированные жировые клетки индуцируют васкуляризацию, не был идентифицирован. Отсутствие четкого механизма данного процесса также препятствует его применению для человека.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Непатентная литература

[0009] Непатентная литература 1: Zhou Y, Wang J, Li H, et al. Efficacy and Safety of Cell-Assisted Lipotransfer: A Systematic Review and Meta-Analysis. Plast Reconstr Surg 2016: 137: 44e-57e.

Непатентная литература 2: Eto H, et al.: The fate of adipocyte after non vascularized fat grafting: Evidence of early death and replacement of adipocytes. Plast Reconstr Surg. 2012; 129(5): 1081-92.

Непатентная литература 3: Zuk PA. et al.: Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells. Mol Biol Cell 2001; 13: 4279-95.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩЕСТВА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Техническая задача

[0010] С учетом вышеописанных факторов возникла необходимость в создании композиции, содержащей зрелые адипоциты, обладающие высокой способностью к реваскуляризации жировой ткани. Кроме того, требовалась композиция, содержащая зрелые адипоциты, которая с меньшей вероятностью вызывает воспаление.

[0011] Кроме того, возникла необходимость в создании агента, способствующего реваскуляризации, композиции, используемой в качестве заменителя подкожных жировых тканей, и жиросодержащего агента, используемого при аугментационной маммапластике, хирургии реконструкции молочной железы или хирургии реконструкции дефектов (проседаний) мягких тканей, включающего такую композицию, содержащую зрелые адипоциты.

Решение задачи

[0012] Настоящее изобретение по существу основано на результатах, полученных в Примерах, и заключается в том, что композиция, содержащая зрелые адипоциты, получаемые путем измельчения и фильтрования жировых тканей и культивирования микрожиров с использованием среды, и кондиционированная среда (супернатант культуры), получаемая в процессе вышеуказанного культивирования, содержат большое количество способствующих васкуляризации хемокинов/цитокинов, таких как IL-8, GRO, MCP-1 или VEGF (фактор роста эндотелия сосудов), и что при использовании данной композиции, например, операция по реконструкции молочной железы, является чрезвычайно успешной.

[0013] Первый аспект изобретения, описанный в описании настоящего изобретения, относится к способу получения композиции, содержащей зрелые адипоциты. Указанный способ включает этап измельчения-фильтрации, этап культивирования микрожира и этап получения композиции, содержащей зрелые адипоциты.

Этап измельчения-фильтрации представляет собой этап получения микрожиров путем измельчения и фильтрации жировых тканей, не обработанных ферментом.

Этап культивирования микрожиров представляет собой этап получения зрелых адипоцитов путем культивирования микрожиров с использованием культуральной среды после этапа измельчения-фильтрации. Культуральная среда включает гидрокортизон и фактор роста фибробластов-2.

Этап получения композиции, содержащей зрелые адипоциты, представляет собой этап получения композиции, содержащей зрелые адипоциты, включающей зрелые адипоциты и кондиционированную среду, полученную на этапе культивирования микрожира.

[0014] В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения жировые ткани получают путем промывания отсосанных жиров и последующего удаления компонентов крови.

[0015] В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения этап измельчения-фильтрации включает этап удаления осажденной стромально-вискулярной фракции (SVF) путем проведения разделения центрифугированием.

[0016] В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения зрелые адипоциты экспрессируют каждый из IL-8, GRO и MCP-1, семейства хемокинов/цитокинов, в 4 или более раз (предпочтительно в 10 или более раз, более предпочтительно в 20 или более раз), чем IL-6. Кондиционированная среда предпочтительно содержит указанные хемокины/цитокины. Кондиционированная среда предпочтительно содержит фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) в диапазоне от 0,5 или более раз до 1,5 или менее раз, чем IL-6.

[0017] В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения композицию, содержащую зрелые адипоциты, используют в качестве заменителя подкожных жировых тканей. Кроме того, композиция, содержащая зрелые адипоциты, может быть использована при аугментационной маммапластике, операции по реконструкции молочной железы или операции по реконструкции проседания тканей.

[0018] Второй аспект изобретения, описанный в описании настоящего изобретения, относится к композиции, используемой в качестве заменителя подкожных жировых тканей. Указанная композиция представляет собой композицию, содержащую зрелые адипоциты, полученную любым из приведенных выше способов получения композиции, содержащей зрелые адипоциты, и используемую в качестве заменителя подкожных жировых тканей. Данную композицию используют, например, в аугментационной маммапластике, хирургии реконструкции молочной железы или хирургии реконструкции проседания тканей.

[0019] Третий аспект изобретения, описанный в описании настоящего изобретения, относится к агенту, способствующему реваскуляризации. Указанный способствующий реваскуляризации агент включает композицию, содержащую зрелые адипоциты, полученную, например любым из приведенных выше способов получения композиции, содержащей зрелые адипоциты. Композиция, содержащая зрелые адипоциты, включает рецептор фактора роста эндотелия сосудов (VEGFR) 2 или его положительную клетку, и рецептор фактора роста тромбоцитов (PDGFR).

Положительные эффекты настоящего изобретения

[0020] Композиция, содержащая зрелые адипоциты, полученная, как описано в первом аспекте настоящего изобретения, как правило, проявляет высокую экспрессию IL-8, GRO, MCP-1 или VEGF, обладающих высокой способностью стимулировать васкуляризацию. Таким образом, данная композиция, содержащая зрелые адипоциты, обладает высокой способностью к стимулированию реваскуляризации.

[0021] Кроме того, как описано выше, полученные из жировой ткани стволовые клетки, индуцируют большое количество TNF-α в условиях низкого содержания кислорода и, вследствие этого могут вызывать воспаление. Таким образом, полученные из жировой ткани стволовые клетки, не подходят для трансплантации. Несмотря на то, что композиция, содержащая зрелые адипоциты, полученная в соответствии с первым аспектом настоящего изобретения, проявляет высокую экспрессию IL-8, GRO и MCP-1, способствующих васкуляризации, композиция проявляет низкую экспрессию TNF-α, IL-1β и INF-γ. Следовательно, композиция, содержащая зрелые адипоциты, полученная вышеописанным способом, с меньшей вероятностью вызывает воспаление.

[0022] Далее, в соответствии со вторым аспектом настоящего изобретения предлагается композиция, содержащая зрелые адипоциты, как описано выше, которая может быть использована в качестве заменителя подкожной жировой ткани и в аугментационной маммапластике, хирургии реконструкции груди или хирургии реконструкции дефектов (углублений) в мягкой ткани. Кроме того, композиция, содержащая зрелые адипоциты, проявляющая высокую экспрессию IL-8, GRO и MCP-1, способствующих васкуляризации, может быть использована в качестве агента, стимулирующего реваскуляризацию.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

[0023] Фиг. 1 – снимок вместо чертежа, показывающий культуральную колбу, в которой помещены растертые микрожиры, полученные путем измельчения и фильтрации.

Фиг. 2 – снимок вместо чертежа, выполненный с помощью фазово-контрастного микроскопа рисунка, показывающий зрелые адипоциты в культуре.

Фиг. 3 – снимок вместо чертежа, показывающий зрелые адипоциты в культуре, подвергнутые окрашиванию Суданом III.

Фиг. 4 – диаграмма вместо чертежа, показывающая результат анализа хемокинов/цитокинов кондиционированной среды.

Фиг. 5 – снимок вместо чертежа, показывающий образец ткани через 6 месяцев после пересадки, иссеченной из брюшной полости бестимусной мыши, куда были пересажены только кусочки отсосанного человеческого жира.

Фиг. 6 – снимок вместо чертежа, показывающий образец через 6 месяцев после пересадки, иссеченной из брюшной полости бестимусной мыши, куда были совместно пересажены жировая ткань человека, культивированные адипоциты и кондиционированная среда.

Фиг. 7 – снимок вместо чертежа, показывающий образец через 6 месяцев после пересадки, иссеченной из брюшной полости бестимусной мыши, куда были совместно пересажены жировая ткань человека, культивированные адипоциты и кондиционированная среда.

Фиг. 8 – снимок вместо чертежа, показывающий пример операции по реконструкции груди после операции по удалению злокачественной (раковой) опухоли из левой молочной железы.

Фиг. 9 – снимок вместо чертежа, показывающий результат иммуноокрашивания на VEGFR2 и PDGFR на мембранах культивированных адипоцитов.

Фиг. 10 – график вместо чертежа, показывающий количество пассажей и уровень удвоения популяции адипоцитов.

Фиг. 11 – снимок вместо чертежа, показывающий культивированные адипоциты на 4-й день культуры P2, выращенной только в α-MEM (контроль).

Фиг. 12 – снимок вместо чертежа, показывающий культивированные адипоциты на 4-й день культуры P2, выращенной в бессывороточной среде для роста мезенхимальных стволовых клеток.

Фиг. 13 – снимок вместо чертежа, показывающий культивированные адипоциты, выращенные в среде α-MEM, дополненной 10% эмбриональной телячьей сывороткой (FCS).

ОПИСАНИЕ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ НАСТОЯЩЕГО ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0024] Далее по тексту приведено описание вариантов осуществления настоящего изобретения. Настоящее изобретение не ограничивается описанными ниже вариантами осуществления и включает модификации, выполненные на основе нижеприведенных вариантов осуществления в пределах объема, очевидного для специалистов в данной области техники.

[0025] Первый аспект изобретения, описанный в описании настоящего изобретения, относится к способу получения композиции, содержащей зрелые адипоциты. Композиция, содержащая зрелые адипоциты, представляет собой, например, композицию, включающую зрелые человеческие адипоциты. Например, в японском патенте № 5991687 описан способ выделения зрелых адипоцитов. Такие зрелые адипоциты является общеизвестными. Размер зрелых адипоцитов (длина части, определяющей максимальную длину) может составлять от 60 до 100 мкм, предпочтительно от 1 мкм или более до 60 мкм или менее. Размер может составлять от 5 мкм или более до 40 мкм или менее.

[0026] Данный способ включает этап измельчения-фильтрации, этап культивирования микрожира и этап получения композиции, содержащей зрелые адипоциты.

[0027] Этап измельчения-фильтрации

Этап измельчения-фильтрации представляет собой этап получения микрожиров путем измельчения и фильтрации жировых тканей, не обработанных ферментом. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения жировые ткани получают путем промывания отсосанных жиров и последующего удаления компонентов крови. Жировые ткани, из которых удалены компоненты крови, могут быть дезинфицированы с использованием антибиотиков, и затем клетки могут быть мелко измельчены путем фильтрации. Этап измельчения-фильтрации предпочтительно включает этап удаления осажденной стромально-сосудистой фракции (СВФ) путем проведения разделения центрифугированием. В этом случае микроклетки получают путем удаления только жировых компонентов, плавающих в верхней части жидкой фазы в результате разделения центрифугированием. Для разделения центрифугированием используется общеизвестный способ.

[0028] Этап культивирования микрожира

Этап культивирования микрожиров представляет собой этап получения зрелых адипоцитов путем культивирования микрожиров с использованием культуральной среды после этапа измельчения-фильтрации. Указанные зрелые адипоциты включены во фракцию культивированных клеток. Культуральная среда представляет собой среду, содержащую гидрокортизон и фактор роста фибробластов-2. Предпочтительной культуральной средой является среда, содержащая собственную сыворотку (аутосыворотку), или среда, содержащая эмбриональную бычью сыворотку, гидрокортизон и фактор роста фибробластов-2. Культуральная среда может представлять собой среду, содержащую собственную сыворотку, гидрокортизон и фактор роста фибробластов-2.

[0029] Среда по настоящему изобретению представляет собой базальную среду, соответствующим образом дополненную необходимыми элементами. Примеры базальной среды включают среду α-MEM, основную питательную среду Игла и минимальную эссенциальную среду Игла, модифицированную по способу Дульбекко (DMEM). К среде соответствующим образом добавлен общеизвестный реагент, используемым в среде. Примеры реагента включают эмбриональную бычью сыворотку (FBS), гидрокортизон (HC), фактор роста фибробластов-2, инсулиноподобный фактор роста (IGF), инсулин, фактор роста тромбоцитов (PDGF), адренокортикотропный гормон (ACTH), лейкемический ингибирующий фактор (LIF), трансформирующий фактор роста (TGF β), костный морфогенетический белок (BMP), стероид, жирную кислоту, соевый ингибитор трипсина, аскорбиновую кислоту, гиалуроновую кислоту, пролин, дексаметазон, инсулин, трансферрин и селеновую кислоту. В случае добавления к среде аскорбиновой кислоты или аналогичной кислоты может быть добавлена ее соль, например, дифосфат. Реагент добавляют в каждую среду в количестве 0,1 нг/мл или более и 20 мкг/мл или менее (или 0,2 нг/мл или более и 10 мкг/мл или менее). Указанные реагенты добавляют, надлежащим образом регулируя их количество в соответствии со степенью очистки и требуемым количеством. Собственная сыворотка может быть добавлена вместо эмбриональной бычьей сыворотки. Кроме того, может быть использована бессывороточная среда. В любом случае, среда предпочтительно содержит гидрокортизон (HC) и фактор роста фибробластов-2 (FGF).

[0030] В качестве примера культуральной среды служит среда α-MEM с добавлением в нее от 1% до 10% эмбриональной бычьей сыворотки, от 20 нг/мл до 100 нг/мл, включительно, гидрокортизон и от 5 нг/мл до 20 нг/мл (или 50 нг/мл), включительно, фактор роста фибробластов-2 (FGF). От 1% до 10% собственной сыворотки может быть добавлено в сочетании от 1% до 10% эмбриональной бычьей сыворотки или вместо нее. Указанные количества могут быть соответствующим образом скорректированы. Например, эмбриональную бычью сыворотку и собственную сыворотку можно добавить к среде в количестве от 0,1% до 20%.

[0031] Микрожиры могут быть культивированы и выращены в нормальных условиях культивирования. Что касается количества клеток, то культуре позволяют достичь от 10% до 100% конфлюэнтного состояния. Далее клетки можно культивировать при высокой плотности в состоянии многослоя до более чем 100% конфлюэнтности. Клетки могут быть переведены в условия низкого содержания кислорода непосредственно после пересадки или после того, как их оставили в покое на некоторое время. Культивирование с низким содержанием кислорода может быть выполнено, например, путем использования инкубатора с низким содержанием кислорода, в котором доступный в продаже газообразный азот или аналогичный газ смешивается для снижения парциального давления кислорода, или путем вдувания газообразного азота или аналогичного газа в соответствующее пространство для снижения парциального давления кислорода.

[0032] Предпочтительно культивирование проводят в условиях содержания от 3% или более и до 20% или менее углекислого газа и от 1% или более и до 10% или менее кислорода. Культивирование можно проводить в условиях содержания от 5% или более и до 20% или менее углекислого газа и от 2% или более и до 10% или менее газообразного кислорода, или от 8% или более и до 12% или менее углекислого газа и от 3% или более и до 7% или менее газообразного кислорода.

[0033] Этап получения композиции, содержащей зрелые адипоциты

Этап получения композиции, содержащей зрелые адипоциты, включает этап получения содержащей зрелые адипоциты композиции, включающей зрелые адипоциты и кондиционированную среду, образовавшуюся на этапе культивирования микрожира. Композиция, содержащая зрелые адипоциты, может включать зрелые адипоциты и супернатант (надосадочную жидкость) клеточной культуры.

[0034] В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения зрелые адипоциты экспрессируют каждый из IL-8, GRO и MCP-1, семейства хемокинов/цитокинов, в 4 или более раз, чем IL-6. Зрелые адипоциты могут экспрессировать любой из IL-8, GRO и MCP-1 или два или более их видов в 10 раз или более, чем IL-6, в 20 раз или более, чем IL-6. Композиция, содержащая зрелые адипоциты, включающая такие хемокины/цитокины, обладающие высокой способностью к реваскуляризации и низкой способностью к индукции воспаления, является приемлемой для трансплантации, поскольку она проявляет высокую способность к реваскуляризации, не вызывая воспаления при трансплантации. В частности, предпочтительно, чтобы данная композиция, содержащая зрелые адипоциты, включала жиры, полученные от пациента, которому проводится пересадка.

[0035] В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения зрелые адипоциты экспрессируют любой из IL-8, GRO и MCP-1 или два или более их видов в 10 или более раз, чем TNF-α, предпочтительно в 50 или более раз, чем TNF-α, предпочтительно в 100 или более раз, чем TNF-α, предпочтительно в 500 или более раз, чем TNF-α.

[0036] В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения зрелые адипоциты экспрессируют любой из IL-8, GRO и MCP-1 или два или более их видов в 10 или более раз, чем IL-1-β, предпочтительно в 50 или более раз, чем IL-1-β, предпочтительно в 100 или более раз, чем IL-1-β, предпочтительно в 500 или более раз, чем IL-1-β.

[0037] В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения зрелые адипоциты экспрессируют любой из IL-8, GRO и MCP-1 или два или более их видов в 10 или более раз, чем INF-γ, предпочтительно в 50 или более раз, чем INF-γ, предпочтительно в 100 или более раз, чем INF-γ, предпочтительно в 500 или более раз, чем INF-γ.

[0038] Композиция, содержащая зрелые адипоциты, включает соответствующие количества зрелых адипоцитов и кондиционированной среды (или надосадочной жидкости клеточной культуры) в зависимости от целей. Далее, данная композиция, как и обычная композиция, хранится в соответствующем контейнере и используется по мере необходимости. Зрелые адипоциты могут быть использованы, например, в количестве от 1 x 10⁴ клеток до 1 x 10¹⁰ клеток, включительно, на одноразовое применение, или от 1 x 10⁵ клеток до 1 x 10⁸ клеток, включительно, на одноразовое применение.

[0039] Средство, включающее надосадочную жидкость клеточной культуры в качестве активного ингредиента, является общеизвестным, как раскрыто, например, в JP 2013-18756 A, японском патенте № 5139294 и японском патенте № 5526320. Таким образом, композиция, включающая кондиционированную среду, может быть получена с использованием общеизвестных способов.

[0040] Примеры культуральной надосадочной жидкости зрелых адипоцитов включают обработанный материал, полученный путем удаления влаги методом сублимационной сушки из культуральной надосадочной жидкости, который представляет собой компонент культуральной надосадочной жидкости, полученный подверганием культуральной надосадочной жидкости твердо-жидкостному разделению путем разделения центрифугированием; обработанный материал, полученный путем концентрирования культуральной надосадочной жидкости под пониженным давлением с использованием испарителя или аналогичного аппарата; обработанный материал, полученный путем концентрирования культуральной надосадочной жидкости с использованием ультрафильтрационной мембраны или аналогичных средств; обработанный материал, полученный путем подвергания разделению культуральной надосадочной жидкости на твердую и жидкую фракции с помощью фильтра; или неразбавленный раствор культуральной надосадочной жидкости, не обработанный вышеуказанными способами обработки. Далее, например, стерильную культуральную надосадочную жидкость можно получить, подвергнув надосадочную жидкость, полученную культивированием зрелых адипоцитов по настоящему изобретению, разделению центрифугированием (например 1000×г, 10 мин), выполнив фракционирование с использованием сульфата аммония (например, 65% насыщенного сульфата аммония), суспендировав полученный осадок в соответствующем буферном растворе, подвергнув полученную суспензию диализу и отфильтровав полученную суспензию с использованием шприцевого фильтра (например 0,2 мкм). Собранную культуральную надосадочную жидкость можно использовать в том виде, в каком она есть, или заморозить и хранить для последующего использования путем оттаивания. Далее, к культуральной надосадочной жидкости может быть добавлен фармацевтически приемлемый носитель, и культуральная надосадочная жидкость может быть расфасована аликвотами в стерильные контейнеры в жидком виде и в количестве, обеспечивающим удобную работу с ней. Кроме того, культуральная надосадочная жидкость может быть обработана с использованием вирусного барьерного фильтра или ультрафиолетового облучения в качестве меры против риска проникновения инфекционных патогенов. Композиция, содержащая зрелые адипоциты, включает культуральную надосадочную жидкость в количестве, составляющем предпочтительно 1 мл или более и 1000 мл или менее, более предпочтительно 30 мл или более и 300 мл или менее, в качестве однократно вводимой дозы.

[0041] В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения композиция, содержащая зрелые адипоциты, используется в качестве заменителя подкожной жировой ткани. В описании настоящего изобретения также представлен способ замещения подкожной жировой ткани, включающий этап введения композиции, содержащей зрелые адипоциты, пациенту-человеку. Предпочтительно, чтобы композиция, содержащая зрелые адипоциты, в данном способе далее включала жировые ткани, полученные от пациента, в отношении которого применяется способ, дополнительно к зрелым адипоцитам и к кондиционированной среде. Далее, композиция, содержащая зрелые адипоциты, может быть использована в аугментационной маммапластике, хирургии реконструкции молочной железы или хирургии реконструкции дефектов (проседаний) мягких тканей. Например, операция по реконструкции молочной железы включает этап введения композиции, содержащей зрелые адипоциты, в молочную железу, в которой испытывается дефицит жировых компонентов.

[0042] Второй аспект изобретения, описанный в описании настоящего изобретения, относится к композиции, используемой в качестве заменителя подкожных жировых тканей. Данная композиция представляет собой композицию, содержащую зрелые адипоциты, полученную любым из вышеописанных способов получения композиции, содержащей зрелые адипоциты, и используемую в качестве заменителя подкожных жировых тканей. Данная композиция используется, например, в аугментационной маммапластике, хирургии реконструкции молочной железы или хирургии реконструкции дефектов (проседаний) мягких тканей.

[0043] Третий аспект изобретения, описанный в описании настоящего изобретения, относится к агенту, способствующему реваскуляризации. Данный способствующий реваскуляризации агент включает композицию, содержащую зрелые адипоциты, полученную, например, с использованием любого из вышеописанных способов получения композиции, содержащей зрелые адипоциты. То есть, данный способствующий реваскуляризации агент аналогичен вышеописанной композиции, содержащей зрелые адипоциты. Способствующий реваскуляризации агент может представлять собой, например, препарат для инъекций. Вышеописанную композицию, содержащую зрелые адипоциты, помещают в инъекционный шприц, дополнительно смешанную с тканями, полученными от пациента, и пересаживают на необходимый участок пациента.

Пример 1

[0044] Способ культивирования: Композиция среды культивированного жира

После получения информированного согласия пациента жировые ткани отсасывали и собирали с живота, верхней части бедра, боковой поверхности бедра и плечевой части руки с использованием канюли диметром 2 мм или менее (диаметр не ограничен). Отсосанные и собранные жировые ткани промывали и удаляли из них компоненты крови. Указанные ткани дезинфицировали антибиотиками, и затем подвергали измельчению с фильтрацией для тонкого дробления жиров. После центрифугирования культивировали только жировые компоненты, плавающие в верхней части жидкой фазы. После центрифугирования удаляли стромально-васкулярную фракцию клеток жировой ткани, осажденную в нижнем слое в виде конгломерата.

[0045] Указанные микрожиры помещали в культуральную колбу для начала культивирования. Фиг. 1 - снимок вместо рисунка, показывающий культуральную колбу, в которую помещены микрожиры, раздробленные путем измельчения с фильтрацией. Как показано на Фиг. 1, после удаления стромально-васкулярной фракции клеток жировой ткани остаются только жировые компоненты. Количество среды в культуре было отрегулировано до небольшого количества с целью предотвращения плавания тканей на поверхности. После подтверждения клеточной адгезии в некоторых клетках из кусочков ткани на 5-й день культивирования добавляли среду для продолжения культивирования.

[0046] В качестве среды использовали среду α-MEM с добавлением 5% эмбриональной бычьей сыворотки, 40 нг/мл гидрокортизона и 10 нг/мл фактора роста фибробластов-2. Культивирование проводили в атмосфере 10% углекислого газа и 5% кислорода.

[0047] На день 12-й из первичной культуры было извлечено от 2 до 3 x 10⁶ культивируемых клеток. Фракция указанных клеток была заморожена, в то время как оставшиеся клетки инокулировали при плотности от 4 до 5 x 10⁴/см² и культивировали в течение 5 дней. Через 6 дней клетки промывали 3 раза фосфатно-солевым буферным раствором (-) и культивировали в течение 2 дней в среде, в которой эмбриональную бычью сыворотку удаляли из вышеуказанных компонентов среды. Данную среду использовали для анализа в качестве кондиционированной среды.

[0048] На Фиг. 2 вместо рисунка представлен снимок, выполненный с использованием фазово-контрастного микроскопа, на котором изображены зрелые адипоциты в культуре. Как показано на Фиг. 2, адипоциты содержали большое количество жировых частиц. Для подтверждения наличия зрелых адипоцитов в культуре было проведено окрашивание Суданом III. Зрелые адипоциты, в частности, окрашиваются в красный цвет Суданом III, который используется для специфического окрашивания жиров. Результат показан в Фиг. 3. На Фиг. 3 вместо рисунка представлен снимок, на котором показаны зрелые адипоциты в культуре, окрашенные Суданом III. Как показано на Фиг. 3, среда содержит большое количество жировых частиц.

Пример 2

[0049] Кондиционированную среду культивированных зрелых адипоцитов подвергали анализу на хемокины/цитокины с использованием метода иммобилизации антител на поверхности магнитных частиц. Надосадочную жидкость получали из образца кондиционированной среды путем центрифугирования при 13000 G при 4° C в течение 5 минут и использовали для измерений. Концентрацию 40 целевых белков в кондиционированной среде измеряли с использованием системы Luminex (зарегистрированная торговая марка). Каждый предварительно обработанный образец в объеме 25 мкл вносили в одну лунку, и измерение выполняли 3 раза. Один стандартный раствор был включен в соответствии с руководством, и приготавливали 5-кратные серийные разведения в общей сложности для 7 точек и измеряли 3 раза. Сорок целевых белков включали: эпидермальный фактор роста, фактор роста фибробластов-2, эотаксин, TGF-α, G-CSF, Flt-3L, GM-CSF, фракталкин, IFNα2, IFNγ, GRO, IL-10, MCP-3, IL-12p40, MDC, IL-12p70, PDGF-AA, IL-13, PDGF-AB/BB, IL-15, sCD40L, IL-17A, IL-1RA, IL-1α, IL-9, IL-1β, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IP-10, MCP-1, MIP-1α, MIP-1β, RANTES, TNFα, TNFβ и VEGF.

[0050] На Фиг. 4 вместо рисунка представлена диаграмма, показывающая результат анализа на хемокины/цитокины кондиционированной среды. Как показано в Фиг. 4, подтверждено, что кондиционированная среда культивированных зрелых адипоцитов продуцирует большое количество (нг/мл) IL-8, GRO и MCP-1, которые являются цитокинами, обладающими высокой способностью стимулировать реваскуляризацию. С другой стороны, TNF-α, который повышается в стволовых клетках, полученных из жировой ткани, и вызывает воспаление, а также IL-1-β и INF-γ, обладающие сильными свойствами индукции воспаления, практически не вырабатываются в указанных клетках, что подтверждает их безопасность.

Пример 3

[0051] Тесты по пересадке жировой ткани бестимусным мышам

Тесты по пересадке жировой ткани мышам, и оценка изображений пересаженных тканей

После получения информированного согласия пациента жировые ткани отсасывали и собирали с живота. Ткани дезинфицировали и инокулировали тем же вышеописанным способом. На день 12-й из первичной культуры извлекали 2 x 10⁶ культивированных адипоцитов. Затем указанные клетки замораживали и хранили. Перед пересадкой клетки размораживали, инокулировали при плотности 5 x 10⁴ клеток/см² и культивировали в течение 5 дней. 3 x 10⁶ культивированных адипоцитов, восстановленных ферментативной обработкой, добавляли и смешивали с 0,6-0,7 г жиров, подлежащих пересадке, и смесь на следующий день пересаживали подкожно в спину бестимусным мышам. В контрольной группе мышам пересаживали только жиры. Ткани удаляли через 6 месяцев после пересадки и подвергали окрашиванию. В то время как при пересадке только человеческих жировых тканей большая часть жировых тканей была поглощена, при пересадке культивированных клеток в комбинации с человеческими жирами жировые ткани успешно приживались. При этом, в центральных частях наблюдалось образование кровеносных сосудов.

[0052] Образцы тканей через 6 месяцев после пересадки, иссеченные из живота бестимусных мышей, где были пересажены только кусочки человеческого отсосанного жира, окрашивали масляным красным О. На Фиг. 5 вместо рисунка представлен снимок, показывающий образец ткани через 6 месяцев после пересадки, иссеченный из живота бестимусной мыши, которой были пересажены только кусочки человеческого отсосанного жира. На Фиг. 5 показано изображение, полученное при 100-кратном увеличении. Несмотря на то, что жировые ткани образуются в некоторых частях периферии, впадины в центральных частях являются участками, на которых жиры поглощаются после пересадки. Вокруг впадин образуются рубцовые ткани, и часть жиров способствует образованию жировой ткани.

[0053] Через 6 месяцев после пересадки образцы, иссеченные из живота бестимусных мышей, куда были совместно пересажены жировые ткани человека, культивированные адипоциты и кондиционированная среда, окрашивали масляным красным О. На Фиг. 6 вместо рисунка представлен снимок, показывающий образец ткани через 6 месяцев после пересадки, иссеченный из живота бестимусной мыши, куда были совместно пересажены жировые ткани человека, культивированные адипоциты и кондиционированная среда. На Фиг. 6 показано изображение, полученное при 100-кратном увеличении. Жировые ткани сформированы в 95% или более от всей ткани образца. Внутри жировых тканей наблюдалось формирование сосудистых тканей.

[0054] Жировые ткани человека, культивированные адипоциты и кондиционированная среда были совместно пересажены на живот бестимусных мышей. Проводили окрашивание посредством иммунофлуоресцентного окрашивания (антитело к ядерному антигену человека 231-1 [Alexa Fluor (зарегистрированная торговая марка) 488], Novus Biologicals, Southpark Way, США) для подтверждения того, что жиры ткани являлись клетками человеческого происхождения. На Фиг. 7 вместо рисунка приведен снимок, на котором показан образец через 6 месяцев после пересадки, иссеченный из живота бестимусной мыши, куда были совместно пересажены жировые ткани человека, культивированные адипоциты и кондиционированная среда. Жировые ткани сформировались во всей ткани образца. Внутри жировой ткани также были обнаружены сосудоподобные ткани.

Пример 4

[0055] Пересадка жировой ткани человеку (мастэктомия/хирургия реконструкции молочной железы)

Пример 4-1: Пример пересадки культивированных зрелых адипоцитов, кондиционированной среды и собственного жира для реконструкции молочных желез после операции по удалению злокачественной (раковой) опухоли из левой молочной железы

46-летней женщине, перенесшей операцию по удалению злокачественной (раковой) опухоли из левой молочной железы, во время иссечения раковой опухоли из молочной железы в грудную клетку был помещен тканевый экспандер для расширения подкожных тканей и большой грудной мышцы, что позволило увеличить размер груди. Впоследствии, по просьбе пациентки, была запланирована пересадка по способу настоящего изобретения. Из брюшной полости отсасывали 2 см³ жира, его собирали, дезинфицировали и инокулировали для культивирования. На день 14-й из первичной культуры извлекали 3×10⁶ культивированных адипоцитов. Затем указанные культивированные адипоциты замораживали и хранили. Перед пересадкой клетки размораживали и культивировали в течение 6 дней в 12 колбах, площадь дна каждой из которых составляла 150 см². Отсосанные жировые ткани, культивированные зрелые клетки и кондиционированную среду, предназначенные для пересадки, смешивали вместе и пересаживали. При первой пересадке в общей сложности 252 мл (17,16×10⁷ клеток) непосредственно подкожно пересаживали в левую грудь по периферии подкожного тканевого экспандера. После удаления тканевого экспандера приблизительно через 6 месяцев, 258 мл (11,44×10⁷ клеток), что соответствует 8 колбам, непосредственно подкожно пересаживали в левую сторону груди во внутренней полости и по периферии внутренней полости.

[0056] В качестве среды для первичной культуры и культивирования размороженных клеток использовалась среда, в которую добавляли 10% собственной сыворотки, 40 нг/мл гидрокортизона и 210 нг/мл фактора роста фибробластов. Следует обратить внимание на то, что было подтверждено, что тот же результат был получен при использовании эмбриональной бычьей сыворотки вместо 10% собственной сыворотки.

[0057] Был проведен анализ изображения пересаженных жировых тканей с помощью МРТ через год после пересадки. В результате было продемонстрировано, что пересаженные жировые ткани сохранили первоначальный размер без рассасывания. Результат показан в Фиг. 8. На Фиг. 8 вместо рисунка приведен снимок, показывающий пример операции по реконструкции молочной железы после операции по удалению раковой опухоли из левой молочной железы. Изображение МРТ представляет собой горизонтальный поперечный срез, сделанный с нижней стороны, и показывает ткань молочной железы и сосок на здоровой стороне. На стороне реконструкции почти 100% пересаженного жира приживается без рассасывания. Белый яркий цвет в жировых тканях указывает на то, что жиры образуются по всему слою. Кроме того, отмечается, что внутри жировой ткани проходит множество кровеносных сосудов. Не наблюдается некроза жира, кист, кальцификации или ригидности (индурации). Наблюдалось достоверное образование жира (такие же результаты были получены в других 10 случаях). Снимок был сделан в положении лицом вниз, поэтому грудь на здоровой стороне свисает вниз.

[0058] Пересадка жировой ткани человеку (реконструктивная хирургия по сохранению молочной железы)

Пример 4-2: Пример пересадки культуры зрелых адипоцитов, кондиционированной среды и собственного жира после органосохраняющей операции при раке левой молочной железы и при атрофии и гипоплазии правой молочной железы

У 44-летней женщины, перенесшей операцию по поводу рака левой молочной железы, после органосохраняющей операции по поводу рака левой молочной железы была диагностирована серьезная деформация с образованием впадины в молочной железе (деформация наполовину и более), а также гипоплазия и атрофия правой молочной железы. По просьбе пациентки была запланирована пересадка по способу настоящего изобретения. Из брюшной полости отсасывали 2 см³ жира, его собирали, дезинфицировали и инокулировали для культивирования. На день 14-й из первичной культуры извлекали 3,4×10⁶ культивированных клеток. Затем указанные культивированные клетки замораживали и хранили. Перед пересадкой клетки размораживали и культивировали в течение 7 дней в 15 колбах, площадь дна каждой из которых составляла 150 см². В качестве среды для первичной культуры и культивирования размороженных клеток использовали среду, к которой добавляли 10% собственного жира, 40 нг/мл гидрокортизона и 210 нг/мл фактора роста фибробластов. Отсосанные жировые ткани, культивированные адипоциты, культивированные зрелые клетки и кондиционированную среду, предназначенные для пересадки, смешивали вместе и пересаживали. Общий объем трансплантата составил 310 мл (21,45×10⁷ клеток). В общей сложности 220 мл было введено и трансплантировано в подкожные ткани для органосохранения части левой молочной железы, которая была поражена раком. Оставшиеся 90 мл были введены и пересажены в часть правой молочной железы с атрофией и гипопластической аномалией. Через год после пересадки жировые ткани сохранили свой первоначальный размер без рассасывания. Ригидности (уплотнения) или дефекты подобного рода не наблюдались, и внешний вид был безупречным.

[0059] Пересадка жировой ткани человеку (реконструкция при деформации (западении) мышц лица)

Пример 4-3: У 68-летней женщины, перенесшей операцию по поводу удаления раковой опухоли из левой молочной железы, была диагностирована серьезная деформация западением мышц лица. Далее жир отсасывали из брюшной полости, верхней части бедра и иных участков в других клиниках, что затруднило процесс нормального сбора жира для данного случая. По просьбе пациентки была запланирована пересадка по способу настоящего изобретения. Из брюшной полости отсасывали и собирали 2 см³ жира, его дезинфицировали и инокулировали для культивирования. На день 16-й из первичной культуры извлекали 4,4×10⁶ культивированных клеток. Затем указанные культивированные клетки замораживали и хранили. Перед пересадкой клетки размораживали и культивировали в течение 7 дней в 5 колбах, площадь дна каждой из которых составляла 175 см². В качестве среды для первичной культуры и культивирования размороженных клеток использовали среду, к которой добавляли 10% собственной сыворотки, 40 нг/мл гидрокортизона и 210 нг/мл фактора роста фибробластов. Отсосанные жировые ткани, культивированные клетки, культивированные зрелые клетки и кондиционированную среду, предназначенные для пересадки, смешивали вместе и пересаживали. Общий объем трансплантата составил 35 мл (8,35×10⁷ клеток). Через год после пересадки жировые ткани сохранили свой первоначальный размер без рассасывания. Ригидности (уплотнения) или дефекты подобного рода не наблюдались, и внешний вид был безупречным.

[0060] Кроме того, pectus excavatum (воронкообразная деформация грудной клетки) представляет собой состояние, при котором происходит деформация с западением грудины и передней грудной стенки в грудной клетке, и данное состояние может рассматриваться с медицинской точки зрения как серьезная воронкообразная деформация, как в Примере 4-2. Таким образом, pectus excavatum включен в показания к применению способа настоящего изобретения.

[0061] Обсуждение результатов

Согласно общепринятой концепции, считается, что стромально-васкулярная фракция клеток жировой ткани (полученная из жировой ткани стволовых клеток), включающая стволовые клетки, полученные из жировой ткани, способствует неоваскуляризации, следовательно, трансплантация стромально-васкулярной фракции клеток жировой ткани (полученной из жировой ткани стволовых клеток) с жиром увеличивает выживаемость трансплантата. В исследованиях на животных жизнеспособная зона кусочков трансплантата составляет около 1,5±0,5 мм от края, а среди жизнеспособных клеток наблюдалась потеря 60% адипоцитов. Даже если к адипоцитам добавить стромальные клетки, полученные из жировой ткани (полученные из жировой ткани стволовых клеток), входящие в состав стромально-васкулярной фракции клеток жировой ткани, можно было получить зону выживаемости лишь менее 300 мкм. Далее, в исследованиях на людях, сообщалось, что пересадка жировой ткани молочной железы, процедура, называемая клеточно-опосредованным липотрансфером (CAL), не отличается от обычной пересадки жира с точки зрения выживаемости, или, что противоречиво, сообщалось, что выживаемость составляла 39% для обычной пересадки жира и 63% для CAL (Toyserkani MN., Quaade ML, and Sorensen JA. Cell-Assisted Lipotransfer: A Systematic Review of Its Efficacy. Aesthetic Plast Surg. 2016; 40: 309-318). Выживаемость при клеточно-опосредованном липотрансфере, примененном к молочной железе, была описана в 5 отчетах из 10 и варьируется следующим образом: 51,8%, 47%, от 40% до 80%, 54% и 50% (Cell assisted lipotransfer in breast augmentation and reconstruction: A systematic review of safety, efficacy, use of patient reported outcomes and study quality. Arshad Z, Karmen L, Choudhary R, Smith JA, Branford OA, Brindley DA, Pettitt D, and Davies BM. JPRAS OPEN. 2016 Dec; 10: 5-20).

[0062] Способность GRO стимулировать васкуляризацию описана в литературе (Caunt M,¹ Liang Hu,¹ Thomas Tang,1 Peter C. Brooks,² Sherif Ibrahim,³ and Simon Karpatkin. Growth-regulated Oncogene Is Pivotal in Thrombin-Induced Angiogenesis. Cancer Res 2006; 66(8): 4125-32, Keglowich¹ L, Roth M, Philippova¹ M, Resink T, Tjin G, Bronchial Smooth Muscle Cells of Asthmatics Promote Angiogenesis Through Elevated Secretion of CXC-chemokines (ENA-78, GRO-α, and IL-8) PLoS One. 2013; 8(12): e81494. doi: 10.1371/journal.pone.0081494).

[0063] Способность IL-8 к реваскуляризации также описана в литературе (Mikula-Pietrasik J, Kuczmarska A, Kucińska M, Muriaset M. et al. Resveratrol and its synthetic derivatives exert opposite effects on mesothelial cell-dependent angiogenesis via modulating secretion of VEGF and IL-8/CXCL8. Angiogenesis 2012; 15: 361-376 and Keglowich1 et al. описаны выше).

[0064] Сообщается, что MCP-1 является хемокином для неоваскуляризации, и способность MCP-1 стимулировать васкуляризацию описана в другой литературе (6. Niu J, Azfer A, Zhelyabovska O, Fatma S, and Kolattukudy PE. Monocyte Chemotactic Protein (MCP)-1 Promotes Angiogenesis through a Novel Transcription Factor, MCP-1-induced Protein (MCPIP). J Biol Chem 2008 May 23; 283(21): 14542-51. doi: 10.1074/jbc.M802139200). Далее, в литературе описано, что MCP-1 опосредует васкуляризирующую способность VEGF (3. Hong KH, Ryu J, Han KH. Monocyte Chemoattractant protein-1-induced Angiogenesis Is Mediated by Vascular Endothelial Growth factor-A. Blood 2005; 105: 1405-1407 DOI:10,1182/blood-2004-08-3178). Для васкуляризации требуется мобилизация макрофагов, и MCP-1 является важным фактором для осуществления этого процесса.

[0065] В совокупности показано, что все 4 вида цитокинов (MCP-1, IL-8, GRO и VEGF), входящие в состав кондиционированной среды, секретируемой культивированными адипоцитами в Примерах, обладают способностью стимулировать васкуляризацию.

Пример 5

[0066] Культивированные зрелые адипоциты P2 инокулировали в количестве 1×10⁴/6 лунок (8 см²/лунка), затем была создана группа из одних только культивированных зрелых адипоцитов и группа со-культуры, состоящая из культивированных зрелых адипоцитов и отсосанного жира, которые культивировали в течение 5 дней, после чего проводилось иммуноокрашивание на VEGFR2 (рецептор 2 фактора роста эндотелия сосудов) и PDGFRβ (тромбоцитарный фактор роста бета). В качестве реагентов использовали анти-VEGFR2 поликлональное антитело (Funakoshi Co., Ltd.: bs-10412), анти-PDGFR бета поликлональное антитело [Y92]-C-концевое (ab32570), козий анти-кроличий IgG H&L (HRP) (ab205718) и набор субстратов DAB (Funakoshi Co. Ltd.: CSK-4100, VEC).

Полученный результат приведен на Фиг. 9. Показано, что обе группы содержат клетки, сильно экспрессирующие VEGFR2 и PDGFRβ.

Ввиду того, что VEGFR2 является первичным респондером на сигнал VEGF и экспрессируется только в сосудистых эндотелиальных клетках и их клетках-предшественниках, продемонстрировано, что обеспечивается формирование кровеносных сосудов. PDGFRβ экспрессируется в клетках-предшественниках жировой ткани при стимулировании PPARγ жирной кислотой или аналогичным соединением. Таким образом, полученный результат показывает, что также содержатся жировые клетки-предшественники. Считается, что включение указанных двух клеток одновременно способствует васкуляризации и образованию жира после пересадки. Далее, учитывая тот факт, что вышеупомянутые способствующие васкуляризации факторы (MCP-1, IL-8, GRO и VEGF) секретируются в большом количестве, обнаруживается, что васкуляризация после пересадки обусловлена двумя механизмами, т.е. клеточными типами и факторами, тем самым проявляя исключительно высокую активность неоваскуляризации. Кроме того, показано, что VEGFR2 и PDGFRβ сильно экспрессируются также в группе со-культуры, состоящей из зрелых адипоцитов и отсосанного жира.

Пример 6

[0067] Туморигенные клетки характеризуются тем, что продолжают расти без задержки роста. Для подтверждения безопасности культивированных адипоцитов, полученных в Примерах, был проведен тест на старение адипоцитов. Данный тест позволяет определить, в какой момент происходит прекращение роста адипоцитов после непрерывного культивирования и пассажа.

Культивированные адипоциты, полученные от 6 субъектов, культивировали в течение 3 месяцев и измеряли PDL (CPD) до прекращения роста. Указанные индексы показывают количество раз деления клеток. Результат приведен на Фиг. 10. Фиг. 10 включает график вместо рисунка, показывающий число пассажей и PDL адипоцитов. График, приведенный на Фиг. 10, подтверждает, что прекращение роста вызвано старением.

P14, соответствующий в общей сложности 102-дневному культивированию: по вертикальной оси расположены CDL (или PDL) 49-летний субъект (прекращение на 102 день), 40-летний субъект (прекращение на 95 день), 60-летний субъект (прекращение на 67 день), 54-летний субъект (прекращение на 61 день), 52-летний субъект (прекращение на 62 день), 50-летний субъект (прекращение на 67 день).

Пример 7

[0068] Проводили эксперимент для проверки возможности культивирования адипоцитов в бессывороточной среде. Культивированные адипоциты смогли расти в имеющейся в продаже в бессывороточной среде для роста мезенхимальных стволовых клеток (Lonza PT-3001: Lonza. KK), хотя и менее пролиферативной, чем среда с эмбриональной бычьей сывороткой.

Базовая среда:

A: - Только α-МЕМ, бессывороточная среда (контроль).

Концентрация добавляемых ГК и фактора роста фибробластов такая же, как и в клинических условиях.

B: Среда, дополненная бессывороточной средой для роста мезенхимальных стволовых клеток (Lonza PT-3001).

C: α-MEM, дополненная 10% эмбриональной бычьей сыворотки (FCS) (положительный контроль)

Было проведено сравнение и исследование вышеуказанных сред. Результат приведен на Фиг. 11 - Фиг. 13. На Фиг. 11 вместо чертежа приведен снимок, показывающий культивированные адипоциты на 4-й день культуры P2, выращенной только в среде α-MEM (контроль). На Фиг. 12 вместо чертежа приведен снимок, показывающий культивированные адипоциты на 4-й день культуры P3, выращенные в бессывороточной среде (Lonza PT-3001). На Фиг. 13 вместо чертежа приведен снимок, показывающий культивированные адипоциты, выращенные в среде α-MEM, дополненной 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FCS). В Таблице 1 приведено количество клеток в каждой среде.

[0069] Таблица 1

Клетки, подсчитанные на день 4-й после инокуляции Р3

Количество инокулированных клеток Количество клеток Количество клеток среднеквадра-тическое отклонение PDL PDL
средне-квадрати-ческое отклонение Среда α-МЕМ 1 10000 1300 1533,33+251,66 -2,94 -2,72+0,24 2 10000 1800 -2,47 3 10000 1500 -2,74 Бессывороточная среда, Lonza 40 нг/мл ГК, 10 нг/мл фактора роста фибробластов 1 10000 77000 78666+3785,94 2,94 2,97+0,07 2 10000 83000 3,05 3 10000 76000 2,93 10% эмбриональная телячья сыворотка+среда α-МЕМ+40 нг/мл ГК, 10 нг/мл фактора роста фибробластов 1 10000 110000 120000,00+10000,00 3,46 3,58+0,12 2 10000 130000 3,70 3 10000 120000 3,58

* Формула PDL = LOG (коэффициент выхода/коэффициент инокуляции/LOG (2)

Промышленная применимость

[0070] Настоящее изобретение может быть использовано в области медицинской техники и в аналогичных областях.

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способу получения композиции, содержащей зрелые адипоциты. Данный способ включает: этап измельчения-фильтрации для измельчения и фильтрации жировой ткани, не обработанной ферментом; этап культивирования минимального количества жира с помощью культуральной среды; этап получения композиции, содержащей зрелые адипоциты, при этом культуральная среда содержит гидрокортизон и фактор роста фибробластов-2. Также раскрыт способ получения способствующего реваскуляризации агента. Изобретение обеспечивает создание композиции, содержащей зрелые адипоциты, обладающей превосходной способностью к реваскуляризации и вызывающей воспаление с меньшей долей вероятности. 2 н. и 7 з.п. ф-лы, 13 ил., 1 табл., 7 пр.

1. Способ получения композиции, содержащей зрелые адипоциты, включающий:

этап измельчения-фильтрации для получения микрожира путем измельчения и фильтрации жировой ткани без обработки ферментом;

этап культивирования микрожира для получения зрелых адипоцитов путем культивирования микрожира с использованием культуральной среды после этапа измельчения-фильтрации;

этап получения композиции, содержащей зрелые адипоциты, для получения композиции, содержащей зрелые адипоциты, включающей зрелые адипоциты и кондиционированную среду, полученную на этапе культивирования микрожира,

отличающийся тем, что этап измельчения-фильтрации включает этап удаления осажденной стромально-вискулярной фракции (SVF) путем проведения разделения центрифугированием и культуральная среда представляет собой среду, содержащую гидрокортизон и фактор роста фибробластов-2.

2. Способ получения композиции, содержащей зрелые адипоциты, по п. 1, отличающийся тем, что жировую ткань получают путем промывания отсосанного жира и последующего удаления компонента крови.

3. Способ получения композиции, содержащей зрелые адипоциты, по п. 2, отличающийся тем, что этап измельчения-фильтрации дополнительно включает этап получения микроклеток путем извлечения жирового компонента, плавающего в верхней части жидкой фазы, полученной в результате разделения центрифугированием.

4. Способ получения композиции, содержащей зрелые адипоциты, по п. 3, отличающийся тем, что кондиционированная среда включает каждый из IL-8, GRO и МСР-1 в 4 раза больше или более чем IL-6.

5. Способ получения композиции, содержащей зрелые адипоциты, по п. 3, отличающийся тем, что в кондиционированной среде содержание фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) находится в диапазоне от 0,5 или более раз до 1,5 или менее раз по сравнению с IL-6.

6. Способ получения композиции, содержащей зрелые адипоциты, по любому из пп. 1-5, отличающийся тем, что композиция, содержащая зрелые адипоциты, используется в качестве заменителя подкожной жировой ткани.

7. Способ получения композиции, содержащей зрелые адипоциты, по любому из пп. 1-5, отличающийся тем, что композиция, содержащая зрелые адипоциты, используется в аугментационной маммопластике, хирургии реконструкции молочных желез или хирургии реконструкции при проседании тканей.

8. Способ получения способствующего реваскуляризации агента, включающий:

получение композиции, содержащей зрелые адипоциты, по любому из способов по пп. 1-5,

смешивание композиции с тканями, полученными от пациента, и

помещение композиции в инъекционный шприц.

9. Способ получения способствующего реваскуляризации агента по п. 8, отличающийся тем, что композиция, содержащая зрелые адипоциты, включает рецептор фактора роста эндотелия сосудов (VEGFR) 2 или (VEGFR) 2-позитивную клетку и рецептор к фактору роста, выделенному из тромбоцитов (PDGFR) b.