КУЛЬТУРАЛЬНАЯ СРЕДА КЛЕТОК-ПРЕДШЕСТВЕННИКОВ КОЖИ, ПРОИСХОДЯЩИХ ИЗ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК, И СПОСОБ ЕЕ ПОЛУЧЕНИЯ Российский патент 2021 года по МПК C12N5/02 C12N5/71 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

[0001] Настоящее описание относится к способу получения кондиционированной среды эпидермальных клеток-предшественников, происходящих из стволовых клеток, к кондиционированной среде эпидермальных клеток-предшественников, происходящих из стволовых клеток, полученной этим способом, и к способу получения белка из эпидермальных клеток-предшественников, происходящих из стволовых клеток.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[0002] Стволовые клетки, имеющие плюрипотентные свойства, могут дифференцироваться в специфические клетки и могут быть разделены на эмбриональные стволовые клетки, взрослые стволовые клетки и индуцированные плюрипотентные стволовые клетки. На сегодняшний день исследования взрослых стволовых клеток в основном связаны с костным мозгом, а в некоторых случаях исследования охватывают методы выделения и культивирования стволовых клеток из жировой ткани или пуповинной крови. Клетки в костном мозге и жировых тканях собирают инвазивными методами, и, в случае стволовых клеток, взятых у пациентов среднего или пожилого возраста, их способность к дифференцировке и пролиферативные свойства снижаются. Кроме того, в случае пуповинной крови, сбор клеток из нее является простым, но количество стволовых клеток в пуповинной крови является низким. В отличие от клеток, полученных из костного мозга и жира, клетки пуповины (UC) и плаценты выделяют из тканей, которые уже выделены из организма, и, таким образом, такое выделение клеток осуществляется неинвазивным способом. Кроме того, в отличие от стволовых клеток, полученных из эмбрионов, выделение клеток из UC и плаценты не связано с этическими проблемами. Таким образом, клетки UC и плаценты недавно оказались в центре внимания в качестве удобного материала по части резистентности или регенеративной медицины, и в качестве первичных клеток, причем такие клетки могут одновременно удовлетворять пролиферативной способности и эффективности дифференцировки. В этом отношении клетки могут быть использованы для регенерации ткани, а также могут иметь преимущества, которые следует использовать после дифференцировки в соответствии с характеристиками ткани.

[0003] Между тем, что касается продукта клеточной терапии, его выживаемость после трансплантации в организме невысока, и могут быть вызваны иммунные отторжения. Таким образом, в клинических применениях практически отсутствуют реальные примеры обширного и стабильного успеха. В связи с этим в качестве альтернативы продукту клеточной терапии в центре внимания оказалась кондиционированная клеточная среда. Кондиционированная клеточная среда (также называемая клеточной средой) представляет собой среду, которая не содержит клеток, полученных после культивирования клеток, но содержит различные ингредиенты, такие как цитокин, фактор роста и тому подобное, необходимые для роста клеток. Такую кондиционированную клеточную среду используют для стимуляции роста клеток или для выделения специфических ингредиентов, и, кроме того, сама кондиционированная клеточная среда применяется для лечения различных заболеваний.

[0004] Авторы настоящего изобретения установили оптимальные условия культивирования для увеличения количества полезных белков, и, соответственно, разработали кондиционированные клеточные среды, содержащие различные белки, о которых известно, что они экспрессируются только в небольшом количестве или не экспрессируются в существующих средах для приготовления кондиционированной клеточной среды.

ОПИСАНИЕ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ

ТЕХНИЧЕСКАЯ ПРОБЛЕМА

[0005] Предложен способ получения кондиционированной среды эпидермальных клеток-предшественников, происходящих из стволовых клеток.

[0006] Предложена кондиционированная среда эпидермальных клеток-предшественников, происходящих из стволовых клеток, полученная этим способом.

[0007] Предложен способ получения белка из эпидермальных клеток-предшественников, происходящих из стволовых клеток.

РЕШЕНИЕ ПРОБЛЕМЫ

[0008] В соответствии с аспектом настоящего изобретения, при условии, что существует способ приготовления кондиционированной среды эпидермальных клеток-предшественников, происходящих из стволовых клеток, причем способ включает: дифференцировку стволовых клеток в эпидермальные клетки-предшественники, происходящие из стволовых клеток, путем культивирования стволовых клеток в среде для дифференцировки, содержащей аскорбиновую кислоту и гидрокортизон; получение культуры эпидермальных клеток-предшественников, происходящих из стволовых клеток, путем культивирования дифференцированных эпидермальных клеток-предшественников, происходящих из стволовых клеток, в среде; и извлечение кондиционированной среды эпидермальных клеток-предшественников, происходящих из стволовых клеток, из культуры эпидермальных клеток-предшественников, происходящих из стволовых клеток.

[0009] Используемый в настоящем описании термин «стволовая клетка» относится к клетке, обладающей эффективностью дифференцировки и способностью к самообновлению. Стволовые клетки могут быть подразделены на плюрипотентные стволовые клетки, мультипотентные стволовые клетки и унипотентные стволовые клетки в зависимости от способности к дифференцировке. Стволовая клетка может включать по меньшей мере одну клетку, выбранную из эмбриональной стволовой клетки (ESC) (т.е. собственная клетка эмбриона до имплантации), взрослой стволовой клетки (т.е. недифференцированная клетка, присутствующая в тканях и органах), и индуцированной плюрипотентной стволовой клетки (т.е. клетка, в которой дедифференцировка индуцируется путем встраивания гена и/или белка в соматическую клетку, или индуцированная плюрипотентная стволовая клетка (iPSC)).

[0010] Стволовая клетка может представлять собой мезенхимальную стволовую клетку. Термин «мезенхимальная стволовая клетка (MSC)», используемый в настоящем описании, относится к взрослой стволовой клетке, которая обладает мультипотентностью и способностью к самообновлению и превосходной пролиферативностью, и которая генетически стабилизирована. MSC является вспомогательной клеткой для продуцирования жиров, хрящей, костей, миелоидной эпилепсии, мышц, нервов и тому подобного и может дифференцироваться в различные клетки, например, в адипоциты, хондроциты, клетки кожи, остеоциты и тому подобное.

[0011] Учитывая, что стволовая клетка обладает потенциалом дифференцировки и способностью к самообновлению, типы и происхождение стволовых клеток не ограничены. Стволовые клетки могут вести происхождение, например, из млекопитающих, людей, обезьян, свиней, лошадей, крупного рогатого скота, овец, собак, кошек, мышей, кроликов и тому подобного. Стволовая клетка может быть получена из отделенной пуповины, отделенной плаценты, отделенного жира, отделенного костного мозга, отделенной пуповинной крови или отделенной амниотической жидкости. Термин «отделенный» в контексте настоящего описания относится к присутствию в среде, которая отличается от клеточной или тканевой среды, которая встречается в природе.

[0012] Используемый в настоящем описании термин «пуповина» относится к каналу между эмбрионом и беременной матерью, чтобы позволить плоду млекопитающего расти в плаценте, и может представлять собой ткань, обычно состоящую из трех сосудов, т. е. две пупочные артерии и одна пупочная вена, окруженные вартоновым студнем. Термин «плацента» в контексте настоящего описания относится к органу, который развивается у плода во время беременности млекопитающего, причем одна сторона плаценты находится в контакте с беременной матерью, а другая сторона находится в контакте с плодом, и пространство между ними наполнено материнской кровью, чтобы плод мог получать питательные вещества. Плацента состоит из трех слоев амниона, хориона и децидуальной оболочки. Амнион представляет собой прозрачную тонкую мембрану, которая окружает плод и включает амниотическую жидкость, а стволовые клетки плода присутствуют в амниотической жидкости и/или амнионе. Децидуальная оболочка - это мембрана, образованная в результате процесса, в котором эпителиальные клетки матки модифицируются таким образом, что оплодотворенная яйцеклетка имплантируется в матку, а стволовые клетки беременной матери присутствуют в децидуальной оболочке. Хорион представляет собой мембрану между амнионом, окружающим плод или околоплодные воды, и децидуальной оболочкой. Он развивается из оплодотворенной яйцеклетки и является частью мембраны яйцеклетки. Стволовые клетки, полученные из плаценты, могут быть получены из плода или беременной матери. Полученные из околоплодных вод стволовые клетки могут быть получены из плода. Стволовые клетки, полученные из пуповины или из плаценты, многочисленны, легко размножаются и способны дифференцироваться в другие клетки. Используемый в настоящем описании термин «костный мозг» относится к ткани, которая продуцирует клетки крови, включая эритроциты, лейкоциты, тромбоциты и тому подобное. Используемый в настоящем описании термин «пуповинная кровь» относится к крови из пуповины новорожденного ребенка после родов. Используемый в настоящем описании термин «жир» относится к жиру тела, и стволовые клетки, полученные из жира, легко получают с высоким коэффициентом выхода, учитывая, что, по оценкам, примерно 1% адипоцитов являются стволовыми клетками.

[0013] Способ может включать получение отделенной пуповины, отделенной плаценты, отделенного жира, отделенного костного мозга, отделенной пуповинной крови или отделенной амниотической жидкости. Отделенная пуповина, отделенная плацента, жир, отделенный костный мозг, отделенная пуповинная кровь или отделенная амниотическая жидкость могут быть получены анатомическими способами, известными в данной области. Пуповина, плацента, амниотическая жидкость или пуповинная кровь могут быть отделены от тела беременной матери после родов. Отделенная пуповина, отделенная плацента, отделенная амниотическая жидкость или отделенная пуповинная кровь могут сохраняться в стерилизованном контейнере со льдом сразу после отделения.

[0014] Например, плацента может быть получена путем разрезания плацентарных тканей, присутствующих в плаценте, на несколько участков стерилизованными ножницами. Плацентарные ткани могут включать амнион, хорион или децидуальную оболочку. Пуповина может быть, например, получена путем отделения пуповины от плаценты. Затем артерии и вена могут быть дополнительно удалены из пуповины. Жир может быть, например, получен путем проведения липосакции в подкожно-жировой прослойке живота или бедер. Плацентарные ткани, пуповина или жир могут быть промыты фосфатно-буферным солевым раствором (PBS), содержащим антибиотики, такие как пенициллин, стрептомицин, гентамицин или их комбинацию, один, два или три раза или более, удаляя, таким образом, загрязняющие вещества, такие как кровь и тому подобное, присутствующие в тканях.

[0015] Способ может включать: реакцию отделенной пуповины, отделенной плаценты или отделенного жира непосредственно с ферментом; или реакцию отделенной пуповины, отделенной плаценты или отделенного жира непосредственно с ферментом после тонкого вырезания отделенной пуповины, отделенной плаценты или отделенного жира стерилизованными ножницами. Например, отделенная пуповина, отделенная плацента или отделенный жир могут быть тонко разрезаны (например, размером примерно 20 мм или менее или примерно 10 мм или менее) стерилизованными ножницами, а затем клетки этих тонких срезов могут вступать в реакцию с ферментом.

[0016] Способ может включать получение стволовых клеток. Получение стволовых клеток может быть выполнено способами, известными специалисту в данной области. В случае пуповины или плаценты способ может включать, например: прикрепление отделенной пуповины или отделенной плаценты к культуральной чашке для культивирования в течение от 5 до 20 дней, от 10 до 20 дней или от 10 до 15 дней; подтверждение наращивания клеток из культивируемой пуповины или культивируемой плаценты; и/или реакцию фермента диссоциации с пуповиной или плацентой. В одном или более вариантах осуществления, в случае пуповины или плаценты, способ может включать, например, реакцию фермента диссоциации с отделенной пуповиной или отделенной плацентой. Фермент диссоциации может включать коллагеназу. Используемый в настоящем описании термин «коллагеназа» относится к ферменту, который разрушает пептидную связь в коллагене, и включает коллагеназу типа I, коллагеназу типа II, коллагеназу типа III, коллагеназу типа IV или их комбинацию. Фермент диссоциации может включать коллагеназу в концентрации в диапазоне от примерно 10 Ед/мл до примерно 4000 Ед/мл, от примерно 20 Ед/мл до примерно 2000 Ед/мл, от примерно 50 Ед/мл до примерно 800 Ед/мл, от примерно 100 Ед/мл до примерно 400 Ед/мл или от примерно 150 Ед/мл до примерно 300 Ед/мл или в концентрации примерно 200 Ед/мл. Кроме того, фермент диссоциации может включать трипсин, диспазу или их комбинацию. Кроме того, раствор, содержащий фермент диссоциации, может представлять собой воду, содержащую коллагеназу, трипсин, диспазу или их комбинацию, или физиологический раствор, такой как сбалансированный солевой раствор Хенкса (HBSS). Взаимодействие фермента диссоциации с пуповиной или плацентой может быть выполнено с помощью встряхиваемого культивирования или стационарного культивирования. Встряхиваемое культивирование или стационарное культивирование может быть выполнено при температуре в диапазоне от примерно 20°С до примерно 40°С, от примерно 30°С до примерно 40°С, или от примерно 35°С до примерно 40°С, или при температуре примерно 37°С в течение от примерно 1 часа до примерно 20 часов, от примерно 2 часов до примерно 10 часов, от примерно 4 часов до примерно 9 часов или от примерно 5 часов до примерно 6 часов. В случае жира способ может включать, например, реакцию отделенного жира с ферментом диссоциации. Фермент диссоциации может включать коллагеназу, трипсин, диспазу или их комбинацию. Раствор, содержащий фермент диссоциации, может представлять собой воду, содержащую коллагеназу, трипсин, диспазу или их комбинацию, или физиологический раствор, такой как HBSS. Взаимодействие жира с ферментом диссоциации может быть выполнено путем встряхиваемого культивирования или стационарного культивирования.

[0017] Кроме того, после реакции фермента диссоциации с пуповиной, плацентой или жиром может быть выполнен процесс инактивации фермента диссоциации. Например, ферментативная реакция может быть прекращена добавлением сыворотки. Кроме того, после реакции фермента диссоциации с пуповиной, плацентой или жиром процесс получения стволовых клеток из пуповины, плаценты или жира может быть выполнен способами, известными специалисту в данной области. Например, после выполнения центрифугирования может быть выполнен процесс выделения клеток с использованием клеточного сита.

[0018] Способ может включать, перед дифференцировкой стволовых клеток в эпидермальные клетки-предшественники, происходящие из стволовых клеток, культивирование стволовых клеток в среде, содержащей сыворотку. Сыворотка может быть фетальной бычьей сывороткой (FBS), бычьей телячьей сывороткой (BSC) или их комбинацией. Исходя из общего объема среды для дифференцировки, сыворотка может содержаться в расчете на объем от примерно 1% до примерно 50%, от примерно 2% до примерно 25%, от примерно 5% до примерно 20% или от примерно 7,5% до примерно 12,5% или в расчете на объем примерно 10%. Среда может включать фактор роста фибробластов-4 (FGF-4) и/или гепарин. В среде концентрация FGF-4 может находиться в диапазоне от примерно 10 нг/мл до примерно 40 нг/мл или от примерно 20 нг/мл до примерно 30 нг/мл, или может составлять примерно 25 нг/мл. В среде концентрация гепарина может находиться в диапазоне от примерно 0,5 мкг/мл до примерно 2 мкг/мл или примерно от 0,5 мкг/мл до примерно 1,5 мкг/мл, или может составлять примерно 1 мкг/мл. Сыворотка может включать антибиотики. Антибиотики могут включать пенициллин, стрептомицин, гентамицин или их комбинацию. В среде концентрация антибиотиков может находиться в диапазоне от примерно 10 мкг/мл до примерно 250 мкг/мл, от примерно 25 мкг/мл до примерно 100 мкг/мл или от примерно 40 мкг/мл до примерно 65 мкг/мл, или может составлять примерно 50 мкг/мл.

[0019] Способ может включать, перед дифференцировкой стволовых клеток в эпидермальные клетки-предшественники, происходящие из стволовых клеток, культивирование стволовых клеток в среде, содержащей сыворотку, в течение от 10 часов до 350 часов. Культивирование стволовых клеток можно проводить в течение от примерно 10 часов до примерно 350 часов, от примерно 20 часов до примерно 170 часов, или от примерно 50 часов до примерно 70 часов, или в течение от примерно 0,5 до 14 дней, от 1 дня до 7 дней или от 2 дней до 3 дней. Культивирование стволовых клеток может быть осуществлено процессом субкультивирования выделенных стволовых клеток с пассажем 0 (P0). Здесь число пассажей субкультивирования конкретно не ограничено и может быть соответствующим образом выбрано в соответствии с желаемым количеством пролиферирующих клеток. Например, для получения необходимого кумулятивного количества пролиферирующих клеток можно выполнить от 1 пассажа до 20 пассажей, от 2 пассажей до 10 пассажей, от 3 пассажей до 7 пассажей или от 4 пассажей до 5 пассажей.

[0020] Способ может включать дифференцировку стволовых клеток в эпидермальные клетки-предшественники, происходящие из стволовых клеток, путем культивирования стволовых клеток в среде дифференцировки, содержащей аскорбиновую кислоту и гидрокортизон. В связи с этим стволовые клетки могут дифференцироваться в эпидермальные клетки-предшественники, происходящие из стволовых клеток, поскольку они культивируются в среде для дифференцировки, содержащей аскорбиновую кислоту и гидрокортизон.

[0021] Используемый в настоящем описании термин «дифференцировка» относится к явлению, при котором структуры функций клеток специализируются друг относительно друга во время деления и пролиферации клеток, иными словами, клетки или ткани живых существ изменяют формы или функции для выполнения поставленных задач. Измерение или определение степени дифференцировки для определенных типов клеток может быть выполнено способами, хорошо известными в данной области. Кроме того, дифференцировка может быть подтверждена с помощью: измерения изменений маркеров клеточной поверхности (например, путем окрашивания клеток тканеспецифическими или клеточно-специфическими антибиотиками) и морфологии клеток с использованием таких методов, как проточная цитометрия или иммуноцитохимия; исследования морфологии клеток с помощью оптического микроскопа или конфокального микроскопа; или измерения изменений в экспрессии генов с использованием методов, хорошо известных в данной области, таких как полимеразная цепная реакция (ПЦР) и профили экспрессии генов.

[0022] Стволовые клетки могут обладать различными свойствами, включая деление, дифференцировку или миграцию клеток, в зависимости от окружающей микросреды (например, ниша стволовых клеток). Стволовые клетки также могут по-разному влиять на экспрессию генов путем стимуляции из окружающей микросреды, и, соответственно, клетки, подлежащие дифференцировке, могут быть изменены.

[0023] Среда для дифференцировки может включать аскорбиновую кислоту и гидрокортизон. Аскорбиновая кислота представляет собой органическое соединение, обладающее антиоксидантными свойствами, является одним из видов витамина С, растворима в воде и имеет молекулярную формулу C₆H₈O₆. Аскорбиновая кислота может быть L-аскорбиновой кислотой. Аскорбиновая кислота может быть представлена в форме аскорбиновой кислоты или ее соли. Соль аскорбиновой кислоты может представлять собой неорганическую соль, соль щелочного металла или соль щелочноземельного металла. Например, соль аскорбиновой кислоты может быть неорганической солью, такой как гидрохлорид, нитрат, сульфат и тому подобное, солью щелочного металла, как например, соль натрия, соль калия, соль кальция, соль магния и тому подобное, или соль щелочноземельного металла. Например, соль аскорбиновой кислоты может представлять собой соль L-аскорбиновой кислоты, такую как натриевая соль L-аскорбиновой кислоты, магниевая соль L-аскорбиновой кислоты, калиевая соль L-аскорбиновой кислоты, кальциевая соль L-аскорбиновой кислоты и тому подобное. Аскорбиновая кислота может влиять на пролиферацию и образование базальной мембраны эпидермальных клеток-предшественников, происходящих из стволовых клеток. В среде концентрация аскорбиновой кислоты может находиться в диапазоне примерно от 0,03 мкМ до примерно 3 мкМ, примерно от 0,05 до 2 мкМ, примерно от 0,1 мкМ до примерно 1 мкМ или примерно от 0,1 мкМ до 0,5 мкМ.

[0024] Гидрокортизон является одним из видов адренокортикальных гормонов и имеет молекулярную формулу C₂₁H₃₀O₅. Гидрокортизон может быть представлен в форме гидрокортизона или его соли. Соль гидрокортизона может быть кислотно-аддитивной солью. Например, соль гидрокортизона может представлять собой неорганическую соль соляной кислоты, азотной кислоты, фосфорной кислоты, серной кислоты, бромводородной кислоты, йодоводородной кислоты, азотистой кислоты, фосфористой кислоты и тому подобное, или может представлять собой нетоксичную соль органической кислоты, как например, алифатический монокарбоксилат и дикарбоксилат, фенилзамещенный алканоат, гидроксиалканоат и алкандиоат, соль ароматической кислоты, соль алифатической и ароматической сульфокислоты и тому подобное. Гидрокортизон, который является фактором, стимулирующим способность дифференцировки в эпидермальные клетки-предшественники, играет небольшую роль в синтезе липидов и образовании плазматической мембраны, а также может способствовать образованию рогового слоя, который расположен над эпидермальным слоем. В среде концентрация гидрокортизона может находиться в диапазоне примерно от 0,05 мкг/мл до примерно 5 мкг/мл, примерно от 0,075 мкг/мл до примерно 3,5 мкг/мл, примерно от 0,1 мкг/мл до примерно 2,5 мкг/мл, примерно от 0,2 мкг/мл до примерно 1,25 мкг/мл, примерно от 0,3 мкг/мл до примерно 1 мкг/мл или примерно от 0,4 мкг/мл до примерно 0,6 мкг/мл.

[0025] Среда для дифференцировки особо ничем не ограничивается при условии, что она может использоваться для культивирования клеток, и, например, среда для дифференцировки может включать, по меньшей мере, одну, выбранную из модифицированной Дульбекко среды Игла (DMEM), минимальной основной среды (MEM), базальной среды Игла (BME), RPMI 1640, F-10, F-12, DMEM/F12, α-минимальной питательной среды (α-MEM), минимальной питательной среды Глазго (G-MEM), модифицированной по Искову среды Дульбекко (IMDM), MacCoy 5A среды, полной среды AmnioMax, полной среды AminoMax®, базальной среды EBM-2, среды Чанга и MesenCult-XF. Среда для дифференцировки может представлять собой среду, содержащую сыворотку. Сыворотка может представлять собой FBS, BSC или их комбинацию. Исходя из общего объема среды для дифференцировки, сыворотка может содержаться в расчете на объем от примерно 1% до примерно 50%, от примерно 2% до примерно 25%, от примерно 5% до примерно 20% или от примерно 7,5% до примерно 12,5%.

[0026] Способ может включать дифференцировку стволовых клеток в эпидермальные клетки-предшественники, происходящие из стволовых клеток, путем культивирования стволовых клеток в среде для дифференцировки в течение от примерно 120 часов до примерно 600 часов, от примерно 150 часов до примерно 500 часов, от примерно 180 часов до примерно 450 часов или от примерно 200 часов до примерно 300 часов, или от примерно 5 дней до примерно 25 дней, от примерно 6 дней до примерно 21 дня, или от примерно 7 дней до примерно 18 дней, от примерно 8 дней до примерно 15 дней, или от примерно 9 дней до примерно 12 дней.

[0027] Кожа состоит из эпидермального слоя, дермального слоя и подкожного жирового слоя. В самой нижней части эпидермального слоя расположен базальный слой, и новые эпидермальные клетки (также называемые кератиноцитами, клетками кожной ткани или кератиноцитами) образуются в базальном слое путем деления клеток, и образующиеся эпидермальные клетки непрерывно заменяют мертвые клетки выше эпидермального слоя. Такой процесс индуцирует регенерацию клеток кожи. Эпидермальные клетки-предшественники, происходящие из стволовых клеток, могут составлять эпидермальный слой, например, базальный слой. Эпидермальные клетки-предшественники, происходящие из стволовых клеток, могут быть клетками-предшественниками кератиноцитов.

[0028] Эпидермальные клетки-предшественники, происходящие из стволовых клеток, могут иметь ограниченную эффективность дифференцировки и ограниченную способность к самообновлению по сравнению со стволовыми клетками. Например, эпидермальные клетки-предшественники, происходящие из стволовых клеток, могут быть превращены в клетки, имеющие эффективность дифференцировки 100%, клетки, имеющие эффективность дифференцировки 0%, из стволовых клеток, имеющие эффективность дифференцировки, равной любому %, или клетки, имеющие эффективность дифференцировки ниже чем любой %. Эпидермальные клетки-предшественники, происходящие из стволовых клеток, можно использовать взаимозаменяемо с эпидермальными клетками-предшествениками, происходящими из стволовых клеток, дифференцированными клетками-предшественниками кожи, дифференцированными эпидермальными стволовыми клетками, стволовыми клетками кожи или эпидермальными стволовыми клетками.

[0029] В эпидермальных клетках-предшественниках, происходящих из стволовых клеток, может быть повышена экспрессия по меньшей мере одного, выбранного из кератина 5 (Krt5), кератина 1 (Krt1) и кератина 14 (Krt14), по сравнению с экспрессией в стволовых клетках до культивирования в среде для дифференцировки. То есть, поскольку стволовые клетки дифференцируются в эпидермальные клетки-предшественники, экспрессия по меньшей мере одного, выбранного из Krt5, Krt1 и Krt14, может быть увеличена. Увеличение может указывать на увеличение экспрессии генов, т. е. увеличение количества мРНК или белков, по меньшей мере, в два раза, по меньшей мере, в 4 раза, по меньшей мере, в 8 раз, по меньшей мере, в 10 раз или, по меньшей мере, в 20 раз или более. Эпидермальные клетки-предшественники, происходящие из стволовых клеток, могут дифференцироваться, не достигая поздней стадии дифференцировки, в которой экспрессируется большое количество Krt10 и/или инволюкрина (IVL) в зависимости от степени дифференцировки. Экспрессия может быть подтверждена путем измерения изменений в экспрессии гена с использованием таких методов, как ПЦР в реальном времени (RT-PCR) или иммуноблот (IB). Эпидермальные клетки-предшественники, происходящие из стволовых клеток, могут иметь определенную округлую форму постоянного размера.

[0030] Способ может включать получение культуры эпидермальных клеток-предшественников, происходящих из стволовых клеток, путем культивирования дифференцированных эпидермальных клеток-предшественников, происходящих из стволовых клеток.

[0031] Культивирование может быть выполнено путем культивирования дифференцированных эпидермальных клеток-предшественников, происходящих из стволовых клеток, без пассажа субкультуры в среде. Среда может быть подходящей для продуцирования белков, и в среде полезные белки могут продуцироваться и секретироваться из клеток посредством межклеточных взаимодействий во время культивирования дифференцированных эпидермальных клеток-предшественников, происходящих из стволовых клеток. Среда может быть бессывороточной средой. Среда может не включать холинхлорид, феноловый красный (или фенолсульфофталеин) или их комбинацию. Среда конкретно ничем не ограничена при условии, что она может использоваться для культивирования клеток, и, например, среда может включать, по меньшей мере, одну, выбранную из DMEM, MEM, BME, RPMI 1640, F-10, F-12, DMEM/F12., α-MEM, G-MEM, IMDM, среды MacCoy 5A, полной среды AmnioMax, полной среды AminoMax II, базальной среды EBM-2, среды Чанга и MesenCult-XF.

[0032] Способ может включать получение культуры эпидермальных клеток-предшественников, происходящих из стволовых клеток, путем культивирования дифференцированных эпидермальных клеток-предшественников, происходящих из стволовых клеток, в среде в течение от примерно 10 часов до примерно 350 часов, от примерно 15 часов до примерно 200 часов, от примерно 20 часов до примерно 170 часов, или от примерно 40 часов до примерно 80 часов, или в течение от примерно 0,5 до примерно 15 дней, от 1 дня до примерно 8 дней, от примерно 1,5 до примерно 4 дней или от примерно 2 до примерно 3 дней.

[0033] Культура эпидермальных клеток-предшественников, происходящих из стволовых клеток, может относиться к среде, к дифференцированным эпидермальным клеткам-предшественникам или их смеси, полученным во время или после культивирования дифференцированных эпидермальных эклеток-предшественников в среде.

[0034] Дифференцированная эпидермальная клетка-предшественник, происходящая из стволовых клеток, может секретировать белки, происходящие из эпидермальной клетки-предшественника, посредством межклеточных взаимодействий при культивировании в среде. Эпидермальные клетки-предшественники, происходящие из стволовых клеток, могут проявлять различное поведение в отношении экспрессии генов при стимуляции из окружающей среды, и, соответственно, типы и количества белков, секретируемых из эпидермальных клеток-предшественников, происходящих из стволовых клеток, также могут варьироваться. Стимуляция может включать среду, в которой культивируются эпидермальные клетки-предшественники, происходящие из стволовых клеток, и/или время культивирования. То есть, в зависимости от культуральной среды и/или времени культивирования, типы и количества белков, секретируемых из эпидермальных клеток-предшественников, происходящих из стволовых клеток, могут варьироваться, а составы и количества белков, присутствующих в кондиционированной среде эпидермальных клеток-предшественников, происходящих из стволовых клеток, также могут варьироваться.

[0036] Способ может включать извлечение кондиционированной среды эпидермальных клеток-предшественников, происходящих из стволовых клеток, из культуры эпидермальных клеток-предшественников, происходящих из стволовых клеток. Восстановление может быть связано с получением культуры эпидермальных клеток-предшественников, происходящих из стволовых клеток, или ее супернатанта, который получают во время или после культивирования дифференцированных эпидермальных клеток-предшественников в среде. Восстановление может заключаться в получении культуры эпидермальных клеток-предшественников, происходящих из стволовых клеток, или ее супернатанта, которые получают во время или после культивирования дифференцированных эпидермальных клеток-предшественников, происходящих из стволовых клеток, в среде после удаления дифференцированных эпидермальных клеток-предшественников и/или макромолекул путем центрифугирования или фильтрации через фильтр.

[0036] Кондиционированная среда эпидермальных клеткок-предшественнников, происходящих из стволовых клеток, может включать в себя белки, выделяемые из эпидермальных клеток-предшественников, происходящих из стволовых клеток. Эпидермальные клетки-предшественники, происходящие из стволовых клеток, могут продуцировать и секретировать белки при культивировании в среде. Такие белки могут включать полезные белки, такие как цитокины, факторы роста и тому подобное. Кондиционированная среда эпидермальных клеток-предшественников, происходящих из стволовых клеток, может включать белки, перечисленные на ФИГ. 5. Кондиционированная среда эпидермальных клеток-предшественников, происходящих из стволовых клеток, может включать, по меньшей мере, один, выбранный из тромбоспондина (TSP), тканевого ингибитора металлопротеиназ 2 (TIMP2), тканевого ингибитора металлопротеиназ 1 (TIMP1), эктодисплазина-A2 (EDA-A2), X-связанного рецептора эктодисплазина-A (XEDAR), ангиопоэтина-1, секретируемого кислого белка, богатого цистеином (SPARC), трансмембранного белка с EGF-подобным и двумя фоллистатин-подобными доменами 1/томорегулин-1 (TMEFF1/Томорегулин-1), нидогена-1, белка 3, связывающего инсулиноподобный фактор роста, (IGFBP-3), тромбоспондина-2, TNF-связанного цитокина, индуцированного активацией (TRANCE), и альфа-рецептора интерлейкина-15 (альфа IL-15R).

[0037] Кондиционированная среда эпидермальных клеток-предшественников, происходящих из стволовых клеток, может включать, по меньшей мере, один, выбранный из TSP, TIMP1, TIMP2, EDA-A2, XEDAR, ангиопоэтина-1, SPARC, TMEFF1/Томорегулина-1, нидогена-1, IGFBP-3, тромбоспондина -2, TRANCE и IL-15R альфа), в концентрации примерно 10 пг/мл или более, примерно 15 пг/мл или более или примерно 20 пг/мл или более.

[0038] Кондиционированная среда эпидермальных клеток-предшественников, происходящих из стволовых клеток, может включать, по меньшей мере, один, выбранный из groucho (GRO), латентного TGF-бета-связывающего белка 1 (латентный TGF-бета bp1), crossveinless-2 (CV-2), Smad 4, интерлейкина -8 (IL-8), активина C, интерлейкина-6 (IL-6), воспалительного белка 2 макрофагов (MIP2) и активина А.

[0039] При культивировании в среде дифференцированных эпидермальных клеток-предшественников, полученных культивированием стволовых клеток в среде для дифференцировки в эпидермальные клетки-предшественники, количество полезных белков, присутствующих в клеточной культуре и/или среди полученных из клеток белков, может быть повышенным по сравнению со случаем, когда клетки получают путем культивирования стволовых клеток в среде, не содержащей аскорбиновую кислоту и гидрокортизон, или по сравнению со случаем, когда типичные эпидермальные клетки-предшественники культивируют в такой среде. Увеличенное количество может быть подтверждено путем измерения изменений в поведении экспрессии генов с использованием таких методов, как RT-PCR, IB, иммуноферментный анализ (ИФА) и тому подобное.

[0040] Согласно другому аспекту настоящего изобретения, при условии, что имеется кондиционированная среда эпидермальных клеток-предшественников, происходящих из стволовых клеток, полученная способом приготовления кондиционированной среды эпидермальных клеток-предшественников, происходящих из стволовых клеток, причем способ включает: дифференцировку стволовых клеток в эпидермальные клетки-предшественники, происходящие из стволовых клеток, путем культивирования стволовых клеток в среде дифференцировки, содержащей аскорбиновую кислоту и гидрокортизон; получение культуры эпидермальных клеток-предшественников, происходящих из стволовых клеток, путем культивирования дифференцированных эпидермальных клеток-предшественников, происходящих из стволовых клеток, в среде; и извлечение кондиционированной среды эпидермальных клеток-предшественников, происходящих из стволовых клеток, из культуры эпидермальных клеток-предшественников, происходящих из стволовых клеток.

[0041] Кондиционированная среда эпидермальных клеток-предшественников, происходящих из стволовых клеток, может включать в себя белки, секретируемые из эпидермальных клеток-предшественников, происходящих из стволовых клеток, и может включать белки, перечисленные на ФИГ. 5. Кондиционированная среда эпидермальных клеток-предшественников, происходящих из стволовых клеток, может включать, по меньшей мере один, выбранный из TSP, TIMP1, TIMP2, EDA-A2, XEDAR, Ангиопоэтина-1, SPARC, TMEFF1/Томорегулина-1, Нидогена-1, IGFBP-3, Тромбоспондина -2, TRANCE и IL-15R альфа.

[0042] Кондиционированная среда эпидермальных клеток-предшественников, происходящих из стволовых клеток, может представлять собой кондиционированную среду, полученную после культивирования дифференцированных эпидермальных клеток-предшественников, происходящих из стволовых клеток, в среде, и может включать белки, секретируемые из клеток посредством межклеточных взаимодействий во время культивирования дифференцированных эпидермальных клеток-предшественников, происходящих из стволовых клеток. Такие белки могут включать полезные белки, такие как цитокины, факторы роста и тому подобное. Кондиционированная среда эпидермальных клеток-предшественников, происходящих из стволовых клеток, полученная способом получения кондиционированной среды эпидермальных клеток-предшественников, происходящих из стволовых клеток, может включать ряд полезных белков в высоких концентрациях и в соответствии со способом получения кондиционированной среды эпидермальных клеток-предшественников, происходящих из стволовых клеток, даже когда вышеописанный процесс выполняется многократно, может быть получена кондиционированная среда эпидермальных клеток-предшественников, происходящих из стволовых клеток, содержащая полезные белки постоянного состава и постоянной концентрации.

[0043] Согласно аспекту настоящего изобретения, при условии, что существует способ получения белка из эпидермальных клеток-предшественников, происходящих из стволовых клеток, причем способ включает: дифференцировку стволовых клеток в эпидермальные клетки-предшественники, происходящие из стволовых клеток, путем культивирования стволовых клеток в среде дифференцировки, содержащей аскорбиновую кислоту и гидрокортизон; получение культуры эпидермальных клеток-предшественников, происходящих из стволовых клеток, путем культивирования дифференцированных эпидермальных клеток-предшественников, происходящих из стволовых клеток, в среде; и извлечение кондиционированной среды эпидермальных клеток-предшественников, происходящих из стволовых клеток, из культуры эпидермальных клеток-предшественников, происходящих из стволовых клеток.

[0044] Дифференцировку стволовых клеток в эпидермальные клетки-предшественники, происходящие из стволовых клеток, путем культивирования стволовых клеток в среде дифференцировки, содержащей аскорбиновую кислоту и гидрокортизон; получение культуры эпидермальных клеток-предшественников, происходящих из стволовых клеток, путем культивирования дифференцированных эпидермальных клеток-предшественников, происходящих из стволовых клеток, в среде; и извлечение кондиционированной среды эпидермальных клеток-предшественников, происходящих из стволовых клеток, из культуры эпидермальных клеток-предшественников, происходящих из стволовых клеток, можно понять, обратившись к соответствующим описаниям, представленным в настоящем документе.

[0045] Белок, продуцируемый из эпидермальных клеток-предшественников, происходящих из стволовых клеток, может включать в себя полезный белок, секретируемый из клеток посредством межклеточных взаимодействий во время культивирования дифференцированных эпидермальных клеток-предшественников, происходящих из стволовых клеток, в среде. Такой белок может включать полезный белок, такой как цитокины, факторы роста и тому подобное. Белок, полученный способом получения белка из эпидермальных клеток-предшественников, происходящих из стволовых клеток, может включать большое количество полезного белка в высокой концентрации и в соответствии со способом получения белка, даже если вышеописанный процесс повторяется, может быть получен белок, содержащий полезный белок в постоянном составе и в постоянной концентрации. Кроме того, согласно способу получения белка из эпидермальной клетки-предшественника, полученной из стволовых клеток, большое разнообразие полезных белков может быть получено в большом количестве.

ПРЕИМУЩЕСТВЕННЫЕ ЭФФЕКТЫ РАСКРЫТИЯ

[0046] Ссылаясь на способ получения кондиционированной среды клеток-предшественников кожи, происходящих из стволовых клеток, в соответствии с одним аспектом, и кондиционированной среды клеток-предшественников кожи, происходящих из стволовых клеток, полученной этим способом, большое количество полезных белков может содержаться в кондиционированной среде клеток-предшественников кожи, происходящих из стволовых клеток.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

[0047] ФИГ. 1 показывает форму клеток, включая: кератиноциты после дифференцировки недифференцированных кератиноцитов, полученных из эпидермиса; и клеток-предшественников эпидермального происхождения после дифференцировки стволовых клеток, полученных из плаценты, и стволовых клеток, полученных из пуповины, путем культивирования в среде для дифференцировки в течение 11 дней.

[0048] ФИГ. 2 показывает результаты измерения уровней экспрессии Krt5, Krt1, IVL, Krt14 и Krt10 в день 3, день 5, день 7, день 9, день 11, день 13, день 15, день 17, день 19 и день 21 во время процесса дифференцировки стволовых клеток, полученных из плаценты, в клетки-предшественники эпидермального происхождения в среде дифференцировки.

[0049] ФИГ. 3 и 4 каждый показывает результаты измерения уровня белка Krt14 в день 3, день 5, день 7, день 9, день 11, день 13, день 15, день 17, день 19 и день 21 во время процесса дифференцировки стволовых клеток, полученных из плаценты, в клетки-предшественники эпидермального происхождения в среде дифференцировки.

[0050] ФИГ.5 показывает 24 основных вида цитокинов с высоким уровнем экспрессии в кондиционированной среде эпидермальных клеток-предшественников, происходящих из стволовых клеток.

[0051] ФИГ. 6 показывает концентрации нидогена-1 в кондиционированной среде эпидермальных клеток-предшественников, происходящих из стволовых клеток (т. е. дифференцированная кондиционированная среда), в кондиционированной среде недифференцированной стволовой клетки (т. е. недифференцированная кондиционированная среда) и в типичной кондиционированной среде кератиноцитов (т. е. кондиционированная среда кератиноцитов).

[0052] ФИГ.7А показывает результаты характеристик поверхностных антигенов стволовых клеток, полученных из плаценты. ФИГ. 7В представляет собой изображение, показывающее результаты индуцирования дифференцировки в адипоциты, остеоциты и хондроциты путем добавления индукторов дифференцировки в стволовые клетки, полученные из плаценты.

СПОСОБ РАСКРЫТИЯ

[0053] Далее настоящее раскрытие будет подробно описано со ссылкой на примеры. Однако примеры приведены только для иллюстративных целей, и объем настоящего раскрытия не ограничен примерами.

[0054] Пример 1. Приготовление кондиционированной среды эпидермальных клеток-предшественников, происходящих из стволовых клеток, и идентификация белка, полученного из эпидермальных клеток-предшественников, происходящих из стволовых клеток.

[0055] 1. Приготовление кондиционированной среды эпидермальных клеток-предшественников, происходящих из стволовых клеток

[0056] (1) Дифференцировка стволовых клеток в эпидермальные клетки-предшественники

[0057] Информированное согласие, основанное на достаточном объяснении заранее, было получено от здоровой матери, которая родила нормально, и пуповина была отделена от плаценты, собранной при нормальной доставке плаценты. Каждую из отделенной плаценты и отделенной пуповины промывали два-пять раз фосфатно-буферным солевым раствором Дульбекко (DPBS), не содержащим Ca/Mg, для удаления из них крови. Затем плацентарную ткань разрезали до размера от примерно 1 мм до примерно 5 мм. Кроме того, артерия и вена были удалены из пуповины, и полученную пуповину разрезали до размера от примерно 1 мм до примерно 5 мм. После этого каждую из полученной плацентарной ткани и полученной пуповины прикрепляли к культуральной чашке и культивировали в течение от 10 до 15 дней. После подтверждения того, что клетки были выделены из культивируемых тканей, туда добавляли 200 ед/мл коллагеназы I в течение от 5 часов до 6 часов, тем самым выделяя стволовые клетки, полученные из плаценты, и стволовые клетки, полученные из пуповины, соответственно.

[0058] Чтобы определить, обладают ли стволовые клетки, полученные из плаценты, характеристиками мезенхимальных стволовых клеток, была проведена проточная цитометрия для анализа поверхностных белков. Полученные из плаценты стволовые клетки промывали DPBS, дополнительно к DPBS, содержащему 2% FBS, и затем проводили реакцию с CD44, CD73, CD90, CD105, CD45, CD34, CD31, CD29, CD49, CD9, HLA-ABC и HLA -ER в течение примерно 20 минут. Впоследствии характеристики поверхностных антигенов анализировали с помощью проточного цитометра (FACS Calibur, Becton Bickinson). ФИГ. 7А показывает результаты характеристик поверхностных антигенов стволовых клеток, полученных из плаценты. Как показано на ФИГ. 7А, уровни экспрессии CD44, CD73, CD90, CD105, CD29, CD49, CD9 и HLA-ABC были высокими в стволовых клетках, полученных из плаценты, и, соответственно, было подтверждено, что стволовые клетки, полученные из плаценты, имели характеристики мезенхимальных стволовых клеток.

[0059] Кроме того, для анализа эффективности дифференцировки стволовых клеток, полученных из плаценты, индуцировали дифференцировку в адипоциты, остеоциты и хондроциты, соответственно. Затем клетки в образце, в котором индуцировалась дифференцировка в адипоциты, окрашивали масляным красным О, клетки в образце, в котором индуцировалась дифференцировка в хондроциты, окрашивали альциановым синим, и клетки в образце, в котором индуцировалась дифференцировка в остеоциты, окрашивали ализарином красным S, и анализировали эффективность дифференцировки полученных клеток. ФИГ. 7B представляет собой изображение, показывающее результаты индуцирования дифференцировки стволовых клеток, полученных из плаценты, в адипоциты, остеоциты и хондроциты, соответственно, путем добавления различных индукторов дифференцировки для каждой дифференцировки стволовых клеток, полученных из плаценты. Как показано на ФИГ. 7B, выделенные клетки обладали той же мультипотентностью, что и мезенхимальные стволовые клетки, и, соответственно, было подтверждено, что выделенные клетки дифференцировались в адипоциты, остеоциты и хондроциты, соответственно. Выделенные клетки распределяли в многоуровневые культуральные флаконы в концентрации от примерно 100 клеток/см² до примерно 5000 клеток/см². Здесь клетки находились в пассаже 0 (Р0) и были субкультивированы в течение 5 пассажей в среде МЕМ альфа GlutaMAX (PS-CM) с добавлением 25 нг/мл фактора роста фибробластов-4 (FGF-4), 1 мкг/мл гепарина, 50 мкг/мл гентамицина и 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) в течение 2 дней в условиях культивирования при 37°С и 5% CO₂.

[0060] Затем к культивируемым клеткам добавляли модифицированную Дульбекко среду Игла: питательную смесь F-12 (DMEM/F12) и среду для дифференцировки, дополненную 0,3 мкМ аскорбиновой кислоты, 0,5 мкг/мл гидрокортизона и 10% FBS, причем каждый добавляли так, чтобы концентрация в многоуровневом культуральном флаконе составляла 5 мкл/см², и полученные клетки культивировали в течение 11 дней в условиях культивирования при 37°С и 5% СО₂. Для контрольной группы использовали клетки, культивируемые в среде, не содержащей аскорбиновую кислоту и гидрокортизон.

[0061] ФИГ. 1 показывает клеточную морфологию кератиноцитов после дифференцировки из недифференцированных кератиноцитов эпидермального происхождения и клеток-предшественников эпидермального происхождения после дифференцировки из стволовых клеток, полученных из плаценты, и стволовых клеток, полученных из пуповины, соответственно, в средах для дифференцировки в течение 11 дней. Стволовые клетки, полученные из плаценты, и стволовые клетки, полученные из пуповины, каждые дифференцировались в клетки постоянного размера и небольшие и округлые по морфологии, сходной с клетками-предшественниками эпидермального происхождения. Как показано на ФИГ. 1, было подтверждено, что стволовые клетки, полученные из плаценты, и стволовые клетки, полученные из пуповины, показали морфологию эпидермальных клеток-предшественников после культивирования в среде дифференцировки.

[0062] (2) Идентификация экспрессии генов в дифференцированных эпидермальных клетках-предшественниках.

[0063] (2.1) анализ ПЦР в реальном времени (RT-PCR)

[0064] В процессе (1), в котором полученные из плаценты стволовые клетки дифференцировались в эпидермальные клетки-предшественники, с помощью RT-PCR были измерены уровни экспрессии Krt5, Krt1, IVL, Krt14 и Krt10, которые являются генами, экспрессируемыми на средней и поздней стадиях.

[0065] В процессе дифференцировки стволовых клеток, полученных из плаценты, дифференцированные клетки были получены в день 3, день 5, день 7, день 9, день 11, день 13, день 15, день 17 и день 19, а затем извлекали из них РНК с использованием фенола/хлороформа. Извлеченные РНК подвергали обратной транскрипции для синтеза кДНК. Уровни экспрессии генов кДНК анализировали с помощью RT-PCR на системе определения последовательности Applied Biosystems 700 (Foster City, CA, USA). Здесь были использованы синтезированные кДНК, набор праймеров, специфичных для каждого из Krt5, Krt1, IVL, Krt14 и Krt10, 2х мастер-микс TaqMan и 20х подготовленный набор анализа экспрессии гена TaqMan (Applied Biosystems). Условия ПЦР были следующими: повторение процесса 95°С в течение 10 минут, 95°С в течение 15 секунд и 60°С в течение 1 минуты. Затем уровни мРНК Krt5, Krt1, IVL, Krt14 и Krt10 были нормализованы к уровню глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (GAPDH) человека.

[0066] [Таблица 1]

Название гена Прямой праймер Обратный праймер Krt5 GTC TCG CCA GTC AAG TGT GT
(SEQ ID NO: 1) GAC ACG GAG GTG AAG CTG
(SEQ ID NO: 2) Krt1 GGG TGG TTA TGG TCC TGT CT
(SEQ ID NO: 3) GGA TCT CAG GGT CAA TCT CC
(SEQ ID NO: 4) IVL CCA GGT CCA AGA CAT TCA AC
(SEQ ID NO: 5) ACT GCG GGT GGT TAT TTA TG
(SEQ ID NO: 5) Krt14 GAG CAG CAG AAC CAG GAG T
(SEQ ID NO: 7) GAG AAC TGG GAG GAG GAG AG
(SEQ ID NO: 8) Krt10 ACT ACT CTT CCT CCC GCA GT
(SEQ ID NO: 9) TGA GCT AAA TCC TCC ACC AA
(SEQ ID NO: 10)

[0067] ФИГ. 2 показывает результаты измерения уровней экспрессии Krt5, Krt1, IVL, Krt14 и Krt10 в день 3, день 5, день 7, день 9, день 11, день 13, день 15, день 17, день 19 и день 21 во время процесса дифференцировки стволовых клеток, полученных из плаценты, в клетки-предшественники эпидермального происхождения в среде для дифференцировки. Здесь ось Y представляет уровни экспрессии гена, нормализованные к GAPDH человека. Как показано на ФИГ. 2, по мере дифференцировки уровень мРНК Krt14, который экспрессируется на средней стадии дифференцировки эпидермальной клетки-предшественника, повышается после 5-го дня.

[0068] (2.2) Иммуноблот (IB)

[0069] Во время процесса (1), в котором полученные из плаценты стволовые клетки дифференцировались в эпидермальные клетки-предшественники, уровень белка Krt14, который является геном, экспрессируемым на средней стадии, измеряли с помощью IB.

[0070] Во время процесса дифференцировки полученных из плаценты стволовых клеток в эпидермальные клетки-предшественники, дифференцированные клетки были получены в день 5, день 7, день 9, день 11, день 13, день 15, день 17 и день 19, а затем полученные клетки лизировали в буфере для лизиса клеток. Буфер для лизиса клеток содержал буфер RIPA (доступный от Thermofisher) и коктейль с ингибитором протеазы (доступный от Roche, Inc., Индианаполис, Индиана, США). Белки, содержащиеся в клеточном лизате, разделяли с помощью электрофореза на 7, 5% полиакриламидном геле (электрофорез в додецилсульфат натрия-полиакриламидном геле натрия: SDS-PAGE). Разделенные белки переносили на поливинилиденфторидную (PVDF) мембрану (доступную от EMD Millipore, Биллерика, Массачусетс, США). Затем мембрану PVDF подвергали реакции с первичными антителами при температуре 4°С в течение ночи. На следующий день полученную мембрану PVDF промывали раствором TBST, содержащим Tween и Tris и NaCl, и затем полученную мембрану подвергали реакции с HRP-конъюгированным вторичным антителом при комнатной температуре. Белковые полосы визуализировали с использованием системы наборов усиленной хемилюминесценции (ECL) (доступной от EMD Millipore).

[0071] ФИГ. 3 и 4 каждый показывает результаты измерения уровня белка Krt14 в день 3, день 5, день 7, день 9, день 11, день 13, день 15, день 17, день 19 и день 21 во время процесса дифференцировки стволовых клеток, полученных из плаценты, в клетки-предшественники эпидермального происхождения в среде дифференцировки. Как показано на ФИГ. 3 и 4, было подтверждено, что уровень белка Krt14 постепенно повышался со дня 5 после того, как полученные из плаценты стволовые клетки культивировались в среде для дифференцировки. Было также подтверждено, что после культивирования полученных из плаценты стволовых клеток в среде, не содержащей аскорбиновую кислоту и гидрокортизон, Krt14 не экспрессировался или экспрессировался на очень низком уровне.

[0072] (3) Приготовление кондиционированной среды эпидермальных клеток-предшественников, происходящих из стволовых клеток

[0073] Кондиционированную среду получали из дифференцированных эпидермальных клеток-предшественников (1).

[0074] Затем среду для дифференцировки удаляли из дифференцированных эпидермальных клеток-предшественников (1) и полученные клетки промывали DPBS для удаления из них оставшейся сыворотки. После этого среду DMEM/F12, не содержащую хлорида холина и фенолового красного, добавляли в культуральный планшет так, чтобы концентрация находилась в диапазоне от примерно 2 мл/см² до примерно 3 мл/см², и клетки культивировали в течение от 2 дней до 4 дней в условиях культивирования 37°С и 5% CO₂. Затем супернатант собирали из культуры эпидермальных клеток-предшественников, смешанных с дифференцированными эпидермальными клетками-предшественниками и средой. Затем собранный супернатант фильтровали через 0,22 мкм фильтр для получения культуры дифференцированных эпидермальных клеток-предшественников. Для контрольных групп стволовые клетки, полученные из плаценты (далее называемые недифференцированными стволовыми клетками), культивированные в среде, не содержащей аскорбиновую кислоту и гидрокортизон, и в собранной кондиционированной среде путем добавления среды к каждому из типичных кератиноцитов и путем культивирования среды.

[0075] (4) Анализ белковых компонентов в кондиционированной среде эпидермальных клеток-предшественников, происходящих из стволовых клеток.

[0076] Компоненты полученных из клеток белков в кондиционированной среде дифференцированных эпидермальных клеток-предшественников, полученных в (3), были идентифицированы с помощью анализа секретома. Подробно были идентифицированы уровни 507 цитокинов.

[0077] Анализ секретома проводили с использованием набора человеческих цитокинов RayBio™ серии L (доступного от RayBiotech, Норкросс, Джорджия) в соответствии с протоколом эррея антител человеческих цитокинов RayBio. Относительную интенсивность полученных пятен измеряли с помощью Image J, а затем корректировали путем вычитания фона. Результаты были представлены как средние значения двух считанных результатов.

[0078] ФИГ.5 показывает 24 верхних вида цитокинов с высоким уровнем экспрессии в кондиционированной среде эпидермальных клеток-предшественников, происходящих из стволовых клеток. В Таблице 2 показано 24 цитокина, экспрессируемых в больших количествах в кондиционированной среде дифференцированных эпидермальных клеток-предшественников. Кондиционированная среда дифференцированных эпидермальных клеток-предшественников может включать TSP, TIMP1, TIMP2, EDA-A2, XEDAR, Ангиопоэтин-1, SPARC, TMEFF1/Томорегулин-1, Nidogen-1, IGFBP-3, Тромбоспондин-2, TRANCE, IL -15R альфа и тому подобное в больших количествах.

[0079] [Таблица 2]

No. Цитокин Интенсивность сигнала 1 Тромбоспондин (TSP) 5886805 2 IGFBP-rp1/IGFBP-7 3970222 3 TIMP-2 3950540 4 EDA-A2 3938694 5 XEDAR 1572912 6 Ангиопоэтин-1 1167638 7 SPARC 1020366 8 GDF-3 1009469 9 sFRP-4 999123 10 GRO 963242 11 MIP 2 865819 12 TIMP-1 785939 13 Латентный TGF-бета bp1 554608 14 CV-2/Crossveinless-2 475676 15 IL-6 441917 16 TMEFF1/Томорегулин-1 430143 17 Нидоген-1 413625 18 Smad 4 391810 19 Activin C 228189 20 IGFBP-3 182444 21 Тромбоспондин-2 112674 22 TRANCE 100065 23 Активин A 76102 24 IL-15R альфа 51270

[0080] (%) Анализ концентрации белка в кондиционированной среде эпидермальных клеток-предшественников, происходящих из стволовых клеток

[0081] Было подтверждено, что белки, перечисленные в Таблице 2, секретировались в больших количествах в кондиционированной среде дифференцированных эпидермальных клеток-предшественников, и количество секретируемых белков количественно анализировали с помощью ИФА. Для контрольных групп использовали кондиционированную среду, собранную путем добавления новой среды к стволовым клеткам, полученным из плаценты (далее называемые недифференцированными стволовыми клетками), культивированных в среде, не содержащей аскорбиновую кислоту и гидрокортизон, и путем культивирования новую среду в течение от 2 дней до 4 дней, и использовали кондиционированную среду, собранную путем добавления новой среды к эпидермальным клеткам и культивирования новой среды в течение от 2 до 4 дней. В качестве набора для ИФА, DTP00B (доступный от R & D system, Миннеаполис, Миннесота) для TSP, ELH-Нидоген1 (доступный от Raybiotec, Норкросс, Джорджия) для Нидоген 1, MBS262463 (доступный от Mybiosource) для TRANCE и ELH-IL15RA (доступный от Raybiotec, Норкросс, Джорджия) для IL-15R альфа использовали и проводили в соответствии с инструкциями производителя. Абсорбцию измеряли для всех цитокинов с использованием устройства для считывания микропланшетов Epoch (доступного от BioTek Inc.) при длине волны 450 нм, и измеренную оптическую плотность анализировали с использованием программного обеспечения Gen5 (2. 00).

[0082] В Таблице 3 приведены результаты измерения концентраций TSP, Нидогена-1, TRANCE и IL15R альфа в кондиционированной среде дифференцированных эпидермальных клеток-предшественников. Другими словами, было подтверждено, что кондиционированная среда дифференцированных эпидермальных клеток-предшественников содержала Нидоген, TSP и тому подобное. ФИГ. 6 показывает концентрации Нидогена-1, содержащегося в кондиционированной среде эпидермальных клеток-предшественников, происходящих из стволовых клеток, в кондиционированной среде недифференцированных стволовых клеток и в типичной кондиционированной среде эпидермальных клеток. Как показано на ФИГ. 6, количество Нидогена-1 в кондиционированной среде дифференцированных эпидермальных клеток-предшественников было более чем в 10 раз выше, чем в кондиционированной среде недифференцированных стволовых клеток и типичной кондиционированной среде эпидермальных клеток.

[0083] [Таблица 3]

No. Цитокин Концентрация (пг/мл) Интенсивност сигнала 1 TSP 63,65 5886805 2 Нидоген-1 15180 413625 3 TRANCE 29 100065 4 IL-15R альфа 19 51270

--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> CHA BIOTECH CO., LTD.

<120> Кондиционированная среда клеток-предшественников кожи, полученных из стволовых клеток, и способ ее получения

<130> PX056664PCT

<150> KR 10-2017-0083861

<151> 2017-06-30

<160> 10

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Прямой праймер для Krt5

<400> 1

gtctcgccag tcaagtgtgt 20

<210> 2

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Обратный праймер для Krt5

<400> 2

gacacggagg tgaagctg 18

<210> 3

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Прямой праймер для Krt1

<400> 3

gggtggttat ggtcctgtct 20

<210> 4

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Обратный праймер для Krt1

<400> 4

ggatctcagg gtcaatctcc 20

<210> 5

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Прямой праймер для IVL

<400> 5

ccaggtccaa gacattcaac 20

<210> 6

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Обратный праймер для IVL

<400> 6

actgcgggtg gttatttatg 20

<210> 7

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Прямой праймер для Krt14

<400> 7

gagcagcaga accaggagt 19

<210> 8

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Обратный праймер для Krt14

<400> 8

gagaactggg aggaggagag 20

<210> 9

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Прямой праймер для Krt10

<400> 9

actactcttc ctcccgcagt 20

<210> 10

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Обратный праймер для Krt10

<400> 10

tgagctaaat cctccaccaa 20

<---

Изобретение относится к области генетической технологии и медицине. Предложены способ получения кондиционированной среды эпидермальных клеток-предшественников, происходящих из стволовых клеток, включающий дифференцировку стволовых клеток, не являющихся стволовыми клетками, полученными из человеческих эмбрионов, в эпидермальные клетки-предшественники в среде для дифференцировки, содержащей аскорбиновую кислоту и гидрокортизон, затем их культивирование в среде и извлечение полученной кондиционированной среды эпидермальных клеток-предшественников; кондиционированная среда эпидермальных клеток-предшественников, происходящих из стволовых клеток, полученная указанным способом, и способ получения белка из эпидермальных клеток-предшественников, происходящих из указанных стволовых клеток, где белок включает один или более белков, выбранных из TSP, TIMP1, TIMP2, EDA-A2, XEDAR, Ангиопоэтина-1, SPARC, TMEFF1/Томорегулина-1, Нидогена-1, IGFBP-3, TRANCE и IL-15R альфа. 3 н. и 16 з.п. ф-лы, 8 ил, 3 табл., 1 пр.

1. Способ получения кондиционированной среды эпидермальных клеток-предшественников, происходящих из стволовых клеток, включающий:

дифференцировку стволовых клеток в эпидермальные клетки-предшественники, происходящие из стволовых клеток, путем культивирования стволовых клеток в среде для дифференцировки, содержащей аскорбиновую кислоту и гидрокортизон, где стволовые клетки не являются стволовыми клетками, полученными из человеческих эмбрионов;

получение культуры эпидермальных клеток-предшественников, происходящих из стволовых клеток, путем культивирования дифференцированных эпидермальных клеток-предшественников, происходящих из стволовых клеток, в среде; и

извлечение кондиционированной среды эпидермальных клеток-предшественников, происходящих из стволовых клеток, из культуры эпидермальных клеток-предшественников, происходящих из стволовых клеток.

2. Способ по п.1, где концентрация аскорбиновой кислоты находится в диапазоне 0,03 мкМ до 3 мкМ, а концентрация гидрокортизона находится в диапазоне от 0,05 мкг/мл до 5 мкг/мл.

3. Способ по п.1, где дифференцировку стволовых клеток в эпидермальные клетки-предшественники, происходящие из стволовых клеток, осуществляют путем культивирования в течение от 120 до 600 ч.

4. Способ по п.1, где стволовые клетки содержат одну или более клеток из эмбриональных стволовых клеток, взрослых стволовых клеток и индуцированных плюрипотентных стволовых клеток.

5. Способ по п.1, где получение культуры эпидермальных клеток-предшественников, происходящих из стволовых клеток, осуществляют путем культивирования в течение от 10 до 350 ч.

6. Способ по п.1, где получение культуры эпидермальных клеток-предшественников, происходящих из стволовых клеток, осуществляют путем культивирования дифференцированных эпидермальных клеток-предшественников, происходящих из стволовых клеток, в бессывороточной среде.

7. Способ по п.1, который включает перед дифференцировкой стволовых клеток в эпидермальные клетки-предшественники, происходящие из стволовых клеток, культивирование стволовых клеток в среде, содержащей сыворотку, в течение от 10 ч до 350 ч.

8. Способ по п.1, где кондиционированная среда эпидермальных клеток-предшественников, происходящих из стволовых клеток, содержит один или более белков, выбранных из Тромбоспондина (TSP), Тканевого ингибитора металлопротеиназы 1 (TIMP1), Тканевого ингибитора металлопротеиназы 2: (TIMP2), Эктодисплазина-A2 (EDA-A2), X-связанного рецептора Эктодисплазина-A (XEDAR), Ангиопоэтина-1, секретируемого кислого белка, богатого цистеином (SPARC), трансмембранного белка с EGF-подобным и двумя фоллистатин-подобными доменами 1/Томорегулин-1 (TMEFF1/томорегулин-1), Нидогена-1, белка-3, связывающего инсулиноподобный фактор роста (IGFBP-3), Тромбоспондина-2, TNF-связанного цитокина, индуцированного активацией (TRANCE), и альфа-рецептора интерлейкина-15 (IL-15R альфа).

9. Способ по п.1, где кондиционированная среда эпидермальных клеток-предшественников, происходящих из стволовых клеток, содержит в концентрации 10 нг/мл или более, один или более белков, выбранных из TSP, TIMP1, TIMP2, EDA-A2, XEDAR, Ангиопоэтина-1, SPARC, TMEFF1/Томорегулина-1, Нидогена-1, IGFBP-3, TRANCE и IL-15R альфа.

10. Кондиционированная среда эпидермальных клеток-предшественников, происходящих из стволовых клеток, полученная способом по п.1, где стволовые клетки не являются стволовыми клетками, полученными из человеческих эмбрионов.

11. Кондиционированная среда по п.10, которая содержит один или более белков, выбранных из TSP, TIMP, TIMP2, EDA-A2, XEDAR, Ангиопоэтина-1, SPARC, TMEFF1/Томорегулина-1, Нидогена-1, IGFBP-3, TRANCE и IL-15R альфа.

12. Кондиционированная среда по п.10, где кондиционированная среда содержит в концентрации 10 нг/мл или более один или более из белков, выбранных из TSP, TIMP1, TIMP2, EDA-A2, XEDAR, Ангиопоэтина-1, SPARC, TMEFF1/Томорегулина-1, Нидогена-1, IGFBP-3, TRANCE и IL-15R альфа.

13. Способ получения белка из эпидермальных клеток-предшественников, происходящих из стволовых клеток, где белок включает один или более белков, выбранных из TSP, TIMP1, TIMP2, EDA-A2, XEDAR, Ангиопоэтина-1, SPARC, TMEFF1/Томорегулина-1, Нидогена-1, IGFBP-3, TRANCE и IL-15R альфа, где способ включает:

дифференцировку стволовых клеток в эпидермальные клетки-предшественники, происходящие из стволовых клеток, путем культивирования стволовых клеток в среде для дифференцировки, содержащей аскорбиновую кислоту и гидрокортизон, где стволовые клетки не являются стволовыми клетками, полученными из человеческих эмбрионов;

получение культуры эпидермальных клеток-предшественников, происходящих из стволовых клеток, путем культивирования дифференцированных эпидермальных клеток-предшественников, происходящих из стволовых клеток, в среде; и

извлечение кондиционированной среды эпидермальных клеток-предшественников, происходящих из стволовых клеток, из культуры эпидермальных клеток-предшественников, происходящих из стволовых клеток.

14. Способ по п.13, где концентрация аскорбиновой кислоты находится в диапазоне от 0,03 мкМ до 3 мкМ, а концентрация гидрокортизона находится в диапазоне от 0,05 мкг/мл до 5 мкг/мл.

15. Способ по п.13, где дифференцировку стволовых клеток в эпидермальные клетки-предшественники, происходящие из стволовых клеток, осуществляют путем культивирования в течение от 120 до 600 ч.

16. Способ по п.13, где стволовые клетки содержат одну или более клеток из эмбриональных стволовых клеток, взрослых стволовых клеток и индуцированных плюрипотентных стволовых клеток.

17. Способ по п.13, где получение культуры эпидермальных клеток-предшественников, происходящих из стволовых клеток, осуществляют культивированием в течение от 10 до 350 ч.

18. Способ по п.13, где получение культуры эпидермальных клеток-предшественников, происходящих из стволовых клеток, осуществляют путем культивирования дифференцированных эпидермальных клеток-предшественников, происходящих из стволовых клеток, в бессывороточной среде.

19. Способ по п.13, который включает перед дифференцировкой стволовых клеток в эпидермальные клетки-предшественники, происходящие из стволовых клеток, культивирование стволовых клеток в среде, содержащей сыворотку, в течение от 10 ч до 350 ч.