Способ получения концентрата нативного коллагена Российский патент 2025 года по МПК C07K14/78 A23J1/10 A23J3/04 

Изобретение относится к пищевой и перерабатывающей промышленности, а именно к способу получения концентрата нативного коллагена из дермальных покровов пресноводных бесчешуйчатых рыб, в частности для получения или обогащения медицинских и косметических препаратов, биологически активных добавок, а также функциональных и специализированных продуктов питания.

Из уровня техники известен способ получения коллагенового продукта (патент RU 2614273, заявка 2014146938, приоритет от 24.11.2014, патентообладатель Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Воронежский государственный университет инженерных технологий»), включающий приемку и очистку шкуры пресноводных рыб, первичную промывку, перекисно-щелочную обработку промытых шкур смесью пероксида водорода и гидроксида натрия с массовой концентрацией 3% и выдержку в течение 1,5-2 часов при температуре 20-25°С и гидромодуле 1:4, последующую промывку шкур в проточной воде при температуре 8-12°С в течение 10-15 мин, выдержку промытых шкур в растворе органической кислоты с последующей их гомогенизацией и фасовкой.

Недостатком способа является невысокий выход негидрализованного коллагена, а также большое количество примесей, в частности солей, образованных в результате кислотно-щелочных реакций.

Также известен способ получения высокомолекулярного коллагена (патент RU 2746215, заявка 2020117376, приоритет от 14.05.2020, патентообладатель Хитров Анатолий Анатольевич, Басарыгин Артем Сергеевич), включающий промывку сырья раствором с пищевым растворителем жира на основе фруктовой кислоты, перекисно-щелочную обработку промытых шкур пероксидом водорода с массовой концентрацией 4,0÷10,0% и использованием органической кислоты для достижения рН раствора 1,0÷3,0. Во время выдержки осуществляют воздействие ультразвуком, после выдержки в растворе органических кислот шкуры измельчают до частиц размером 2,0÷5,0 мм, нейтрализуют щелочным раствором до рН 4,5÷7,0, после гомогенизации смесь фильтруют от остатков неразволокненной шкуры. В фильтрат добавляют дистилированную воду в соотношении 1:5÷1:10 и подвергают холодной стерилизации, дополнительной ультрафильтрации для удаления химических примесей и концентрирования. Далее повторно стерилизуют ультрафиолетом.

Недостатком этого способа является неоправданная длительность технологического процесса, большой объем сточных вод, а также отсутствие его селективности.

В качестве прототипа выбран способ получения раствора гидрата коллагенов пресноводных гидробионтов (патент RU 2789758, заявка 2021139828, приоритет от 30.12.2021, патентообладатель Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Воронежский государственный университет»), включающий приемку шкур пресноводных бесчешуйчатых рыб, очищение их от прирезей мышечной ткани, плавников и механических загрязнений, первичную промывку раствором, содержащим пищевые поверхностно-активные вещества, перекисно-щелочную обработку промытых шкур раствором, содержащим 750 мМ гидроксида натрия и 300 мМ перекиси водорода, при комнатной температуре до обесцвечивания кожных покровов с последующей промывкой проточной водой при температуре 8-12°С до полного удаления перекиси и щелочи. После чего дермальные покровы выдерживают в растворе слабой органической кислоты при рН 4 и постоянном воздействии ультразвука частотой 100 кГц. Затем проводят удаление жидкой фазы, гомогенизацию и фильтрацию. Фильтрат подвергают холодной стерилизации с использованием ультрафиолетового излучения и фасуют.

Недостатком прототипа является наличие примесей в получаемой коллагеновой дисперсии, а также длительное ультразвуковое воздействие в кислой среде на дермальные покровы.

Задачей настоящего изобретения является создание способа получения концентрата коллагена из дермальных покровов бесчешуйчатых пресноводных рыб с сохранением нативной структуры белка, для использования в пищевой, косметической, медицинской и других отраслях промышленности.

Техническим результатом изобретения является повышение качественных показателей концентрата коллагена за счет увеличения выхода и концентрации коллагенового продукта, улучшения его органолептических показателей, снижение трудоемкости и себестоимости процесса за счет сокращения числа технологических операций и реактивов.

Поставленная задача и технический результат достигаются тем, что способ получения концентрата нативного коллагена, включает приемку и очищение шкур пресноводных бесчешуйчатых рыб, их дальнейшую трехкратную первичную промывку поочередно растворами хлорида натрия с концентрацией 10÷15 % масс. и гидрокарбоната натрия с концентрацией 15÷20 % масс. Последующее обесцвечивание осуществляют двукратной обработкой перекисно-солевым раствором, содержащим 3÷4 % масс. пероксида водорода и 4÷5 % масс. хлорида натрия, в течение 6 часов при гидромодуле 2. Отбеленные шкуры дополнительно трижды промывают проточной водой при температуре 8÷12°С, после чего их выдерживают в цитратном буферном растворе с рН 2,5÷3,0, содержащем 5 % масс. лимонной кислоты, в течение 48÷60 часов при гидромодуле 2, затем нейтрализуют водным раствором, содержащим 5 % масс. гидрокарбоната натрия, до рН 5,0÷6,5. Надосадочную жидкость сливают декантацией, осадок трижды промывают водой при температуре 8÷12°С, выдерживая в течение 10÷15 мин на каждом этапе, конечную промывку осуществляют дистиллированной водой. Промытый осадок отделяют фильтрованием и гомогенизируют любым доступным способом с дополнительной кавитационной обработкой при мощности ультразвука - 23кГц в течение 30÷50 минут при температуре 4÷8°С. Полученный концентрат нативного коллагена подвергают холодной стерилизации и фасовке.

Поочередное трехкратное применение растворов гидрокарбоната натрия и хлористого натрия для первичной промывки позволяет сократить время обработки и объем сточных вод. Дополнительное использование хлорида натрия позволяет провести более эффективное очищение исходного сырья от мажорных белков, формирующих эпидермальную слизь, покрывающую поверхность шкуры бесчешуйчатой рыбы.

Использование перекисно-солевого раствора (вместо перекисно-щелочного) для отбеливания промытых кожных покровов позволяет снизить токсичность сточных вод, а также стоимость данного этапа за счет более дешевого реактива при достижении идентичного результата за такое же время.

Использование цитратного буферного раствора (вместо раствора органической кислоты) обеспечивает деликатное разволокнение пучков коллагеновых волокон, составляющих дермальные покровы. Наличие в разволокняющем растворе соли органической кислоты препятствует разрушению трехспиральной молекулы коллагена и растворению всей коллагеновой массы. При таком режиме разволокнения становится некритичным незначительные колебания температурного и временного режимов процесса.

Проведение процесса нейтрализации смеси гидрокарбонатом натрия после этапа кислотного разволокнения с последующей промывкой позволяет получить набухшую массу с нейтральным рН, что положительно сказывается на органолептических и физико-химических свойствах продукта и расширяет области его применения.

Использование ледяной бани во время кратковременного низкоинтенсивного ультразвукого воздействия на дермальные покровы позволяет исключить процессы денатурации и термического гидролиза коллагеновых белков, который свойственен для рыбного сырья, имеющего чувствительность к температурам выше 35°С.

Сущность изобретения поясняется чертежами, где на фиг.1 представлен ИК-спектр коллагена, на фиг.2 - спектр кругового дихроизма раствора коллагена.

Способ осуществляется следующим образом.

Способ получения концентрата нативного коллагена осуществляется следующим образом. Способ включает приемку шкуры пресноводных рыб, таких как сом, осетр, налим, очищение их от прирезей мышечной ткани, плавников и механических загрязнений, первичную поочередную промывку двумя растворами, содержащими 20 % масс. гидрокарбоната натрия и 10 % масс. хлористого натрия, соответственно, и в соотношении растворы : сырье - 2,5 л раствора : 1 кг сырья, операцию проводят трижды, выдерживая при постоянном перемешивании по 2 мин на каждом этапе при комнатной температуре, перекисно-солевую обработку промытых шкур раствором, содержащим 3 % масс. пероксида водорода и 4 % масс. хлорида натрия, при комнатной температуре в течение 6 часов, последующую троекратную промывку шкур проточной водой при температуре 8÷12°С в течение 10÷15 мин, при массовом соотношении дермальные покровы : вода - 1:3, соответственно, при постоянном перемешивании, выдержку в цитратном буферном растворе с рН 2,5- 3,0, содержащем 5 % масс. лимонной кислоты, в течение 48 часов, нейтрализацию водным раствором, содержащим 5 % масс. гидрокарбонат натрия, до рН 5,0÷7,0, троекратную промывку шкур проточной водой при температуре 8÷12°С в течение 10÷15 мин на каждом этапе, промывку дистиллированной водой, воздействие ультразвука частотой 23 кГц в течение 20-40 минут с использованием ледяной бани, гомогенизацию, фильтрацию, холодную стерилизацию и фасовку.

Белковая природа выделенного продукта подтверждалась методом ИК-спектроскопии с помощью ИК-фурье спектрометра ФСМ 1201 с использованием приставки нарушенного полного внутреннего отражения (НПВО) в диапазоне волновых чисел 650-4000 см^-1, с разрешением 1 см^-1, число сканов - 20. Находят следующие характеристические полосы поглощения: амид А - ок. 3300 см^-1, амид В ок. 2925 см^-1 (С-Н); амид I - ок. 1630 см^-1 (С=О); амид II - ок. 1530 см^-1 (C-N, C=O), 1450 см^-1(N-C-O); амид III - ок. 1340 см^-1 (H-N-C) (Фиг.1). Приведенные полосы однозначно указывают на белковую природу полученного продукта, что дополнительно подтверждается сравнением полученного спектра с библиотечными аналогами.

Нативная структура коллагена подтверждалась методом спектроскопии кругового дихроизма (КД-спектроскопия). Этот метод используется для оценки вторичной структуры белка путем дифференциального поглощения лево- и правостороннего кругового поляризованного света в асимметричной среде. Регистрация спектров осуществлялась на спектрометре Chirascan-plus DMS (Applied Photophysicals) с использованием кварцевой цилиндрической кюветы с длиной оптического пути 0,2 мм. Для каждого измерения в кювету помещали 600 мкл раствора коллагена с концентрацией 0,1 мг/мл в 50 мМ уксусной кислоты. Спектры КД получали путем сканирования от 190 до 260 нм со скоростью сканирования 50 нм/мин.

Пример 1 реализации способа

Способ включает приемку шкуры пресноводной бесчешуйчатой рыбы - Африканский клариевый сом (Clarias gariepinus), очищение ее ручным или механическим способом. Первичную промывку 1 кг очищенной шкуры осуществляют поочередно растворами хлорида натрия с концентрацией 10 % масс. и гидрокарбоната натрия с концентрацией 15 % масс., которую повторяют не менее трех раз с продолжительностью каждого этапа не менее 2 минут при гидромодуле 1.

Отбеливающую обработку проводят перекисно-солевым раствором, содержащим 3÷4 % масс. пероксида водорода и 4÷5 % масс. хлорида натрия, при комнатной температуре с кратностью обработки 2, при гидромодуле 2, в течение 6 часов, отбеленные шкуры дополнительно трижды промывают проточной водой при температуре 8÷12°С в течение 10÷15 мин, после чего их выдерживают в цитратном буферном растворе с рН 2,5÷3,0, содержащем 5 % масс. лимонной кислоты, в течение 48 часов при гидромодуле 2. Полученную набухшую массу нейтрализуют водным раствором, содержащим 5 % масс. гидрокарбоната натрия, до рН 5,0÷6,5. Надосадочную жидкость сливают декантацией, осадок трижды промывают водой при температуре 8÷12°С, выдерживая в течение 10÷15 мин на каждом этапе, конечную промывку осуществляют дистиллированной водой.

Крупные частицы отделяют фильтрованием, полученную массу гомогенизируют любым доступным способом с дополнительной кавитационной обработкой при мощности ультразвука - 23 кГц в течение 30 минут при температуре не выше 8°С. Полученный концентрат нативного коллагена подвергают холодной стерилизации и фасовке.

Выделено 1,70 кг концентрата нативного коллагена с концентрацией - 5,7 % масс.

Пример 2 реализации способа

Способ аналогичен примеру 1. За исключением следующего. Первичную промывку 1 кг очищенной шкуры осуществляют поочередно растворами хлорида натрия с концентрацией 15 % масс. и гидрокарбоната натрия с концентрацией 20 % масс. Выдержку в цитратном буферном растворе проводят в течение 60 ч. Кавитационную обработку проводят в течение 50 мин. Выделено 1,62 кг концентрата нативного коллагена с концентрацией - 5,8 % масс.

Полученный в примерах продукт имеет светло-бежевый цвет с незначительной замутненностью, свойственной суспензиям, а также нейтральные запах и вкус. В зависимости от целей дальнейшего использования продукт может быть подвержен лиофильной сушке. После низкотемпературной лиофильной сушки продукт представляет собой бледно-желтый порошок.

Пример 3 Подтверждение нативной структуры коллагена методом кругового дихроизма

Сохранность вторичной структуры экстрактов коллагена оценивали с помощью кругового дихроизма. Регистрация спектров осуществлялась на спектрометре Chirascan-plus DMS (Applied Photophysicals) с использованием кварцевой цилиндрической кюветы с длиной оптического пути 0,2 мм. Для каждого измерения в кювету помещали 600 мкл раствора коллагена с концентрацией 0,1 мг/мл в 50 мМ уксусной кислоты. Спектры КД получали путем сканирования с непрерывной длиной волны (в трех экземплярах) от 190 до 260 нм со скоростью сканирования 50 нм/мин. Для исследуемого образца наблюдалась положительная полоса при длине волны 220-225 нм, что характерно для тройной спирали, и выраженная отрицательная полоса в районе 196-200 нм, типичная для структуры случайного клубка. Наличие положительной полосы с максимумом 222 нм свидетельствует о сохранении нативной структуры выделенного концентрата коллагена (Фиг.2).

Заявленное изобретение на практике показало свою эффективность в достижении технического результата. Предложенный способ может быть реализован в условиях промышленного производства с использованием стандартного оборудования, общеизвестных технологий и материалов. Специалисту в данной области техники очевидно множество других вариантов осуществления изобретения, представленного в приведенном выше описании. Поэтому, следует понимать, что изобретение не ограничивается конкретным раскрытием воплощения и другие варианты выполнения могут быть включенными в объем предлагаемой формулы.

Изобретение относится к перерабатывающей промышленности, в частности к способам получения нативного коллагена. Способ получения концентрата нативного коллагена включает приемку шкуры пресноводных бесчешуйчатых рыб и очищение ручным или механическим способом. Далее осуществляют первичную промывку очищенной шкуры поочередно не менее трех раз растворами хлорида натрия с концентрацией 10-15 % масс. и гидрокарбоната натрия с концентрацией 15-20 % масс. с продолжительностью каждого этапа не менее 2 мин при гидромодуле 1. Затем проводят обесцвечивание перекисно-солевым раствором, содержащим 3-4 % масс. пероксида водорода и 4-5 % масс. хлорида натрия, при комнатной температуре с кратностью обработки 2 при гидромодуле 2 в течение 6 ч. Отбеленные шкуры дополнительно трижды промывают проточной водой при температуре 8-12°С, после чего их выдерживают в цитратном буферном растворе с рН 2,5-3,0, содержащем 5 % масс. лимонной кислоты, в течение 48-60 ч при гидромодуле 2. Затем обработанные шкуры нейтрализуют водным раствором, содержащим 5 % масс. гидрокарбоната натрия, до рН 5,0-6,5. Надосадочную жидкость сливают декантацией и осадок трижды промывают водой при температуре 8-12°С, выдерживая в течение 10-15 мин на каждом этапе. Конечную промывку осуществляют дистиллированной водой. Промытый осадок отделяют фильтрованием и гомогенизируют любым доступным способом с дополнительной кавитационной обработкой при мощности ультразвука частотой 23 кГц в течение 30-50 мин при температуре 4-8°С. Полученный концентрат нативного коллагена подвергают холодной стерилизации и фасовке. Предлагаемый способ получения концентрата нативного коллагена обеспечивает повышение качественных показателей концентрата коллагена, увеличение выхода и концентрации коллагенового продукта, улучшение органолептических показателей, снижение трудоемкости и сокращение числа технологических операций и реактивов. 2 ил., 3 пр.

Способ получения концентрата нативного коллагена, включающий приемку шкуры пресноводных бесчешуйчатых рыб, очищение ручным или механическим способом, отличающийся тем, что первичную промывку очищенной шкуры осуществляют поочередно растворами хлорида натрия с концентрацией 10-15 % масс. и гидрокарбоната натрия с концентрацией 15-20 % масс., которую повторяют не менее трех раз с продолжительностью каждого этапа не менее 2 мин при гидромодуле 1, последующее обесцвечивание осуществляют перекисно-солевым раствором, содержащим 3-4 % масс. пероксида водорода и 4-5 % масс. хлорида натрия, при комнатной температуре с кратностью обработки 2 при гидромодуле 2 в течение 6 ч, отбеленные шкуры дополнительно трижды промывают проточной водой при температуре 8-12°С, после чего их выдерживают в цитратном буферном растворе с рН 2,5-3,0, содержащем 5 % масс. лимонной кислоты, в течение 48-60 ч при гидромодуле 2, затем нейтрализуют водным раствором, содержащим 5 % масс. гидрокарбоната натрия, до рН 5,0-6,5, надосадочную жидкость сливают декантацией, осадок трижды промывают водой при температуре 8-12°С, выдерживая в течение 10-15 мин на каждом этапе, конечную промывку осуществляют дистиллированной водой, далее осадок отделяют фильтрованием и гомогенизируют любым доступным способом с дополнительной кавитационной обработкой при мощности ультразвука частотой 23 кГц в течение 30-50 мин при температуре 4-8°С, полученный концентрат нативного коллагена подвергают холодной стерилизации и фасовке.