Способ получения аддуктов легких фуллеренов с L-аминокислотами Российский патент 2025 года по МПК C07C61/29 

Изобретение относится к области органической химии и нанотехнологиям и может быть использовано при получении водорастворимых производных легких фуллеренов с L-аминокислотами.

Фуллерены являются аллотропной модификацией углерода и представляют собой сфероидальные, каркасные молекулы, состоящие из четного числа ковалентно связанных атомов углерода в sp²-гибридном состоянии [V.I. Sokolov, I. V Stankevich, The fullerenes - new allotropic forms of carbon: molecular and electronic structure, and chemical properties, Russ. Chem. Rev. 62 (1993) 419–435.], образующих пятиугольники и шестиугольники. Впервые фуллерены были получены в результате сжигания графитовых стержней при воздействии высокоэнергетических лазерных импульсов. Индивидуальные фуллерены обладают рядом уникальных свойств, что позволяет сделать заключение о перспективности их практического применения в различных областях науки, однако существуют ограничения, связанные с их гидрофобной природой. Таким образом, повышение гидрофильности фуллеренов является актуальной задачей, которая может быть решена за счет химического модифицирования фуллеренового кора, что в конечном итоге приведет к получению водорастворимых производных фуллеренов. Из-за относительно высокого сродства к электрону индивидуальные фуллерены ведут себя как электронно-дефицитные полиолефины, поэтому подобно алкенам, фуллерены легко вступают в реакции присоединения с различными нуклеофилами, что в отдельных случаях может повысить их гидрофильность.

В настоящее время фуллерены являются одним из наиболее востребованных продуктов углеродных нанотехнологий, что определяет актуальность исследований в области синтеза и изучения свойств водорастворимых производных фуллеренов, в частности, с аминокислотами. Остановимся на рассмотрении подходов к синтезу водорастворимых производных фуллеренов с аминокислотами, которые являются одним из наиболее изученных и перспективных классов водорастворимых производных фуллеренов [E.I. Pochkaeva, N.E. Podolsky, D.N. Zakusilo, A. V. Petrov, N.A. Charykov, T.D. Vlasov, A. V. Penkova, L. V. Vasina, I. V. Murin, V. V. Sharoyko, K.N. Semenov, Fullerene derivatives with amino acids, peptides and proteins: From synthesis to biomedical application, Prog. Solid State Chem. 57 (2020) 100255]. Соединения, относящиеся к данному классу, обладают широким спектром биологической активности и проявляют следующие свойства: противовирусные [M.G. Medzhidova, M. V Abdullaeva, N.E. Fedorova, V.S. Romanova, A.A. Kushch, [In vitro antiviral activity of fullerene amino acid derivatives in cytomegalovirus infection]., Antibiot. i Khimioterapiia = Antibiot. Chemoterapy [Sic]. 49 (2004) 13–20.; Y.-L. Lin, H.-Y. Lei, Y.-Y. Wen, T.-Y. Luh, C.-K. Chou, H.-S. Liu, Light-Independent Inactivation of Dengue-2 Virus by Carboxyfullerene C3 Isomer, Virology. 275 (2000) 258–262], антимикробные [N. Tsao, T.-Y. Luh, C.-K. Chou, J.-J. Wu, Y.-S. Lin, H.-Y. Lei, Inhibition of Group A Streptococcus Infection by Carboxyfullerene, Antimicrob. Agents Chemother. 45 (2001) 1788–1793], противоопухолевые [X.L. Yang, C.H. Fan, H.S. Zhu, Photo-induced cytotoxicity of malonic acid [C60]fullerene derivatives and its mechanism, Toxicol. Vitr. 16 (2002) 41–46], антиоксидантные [I.C. Wang, L.A. Tai, D.D. Lee, P.P. Kanakamma, C.K.-F. Shen, T.-Y. Luh, C.H. Cheng, K.C. Hwang, C₆₀ and Water-Soluble Fullerene Derivatives as Antioxidants Against Radical-Initiated Lipid Peroxidation, J. Med. Chem. 42 (1999) 4614–4620], нейропротекторные [L.L. Dugan, D.M. Turetsky, C. Du, D. Lobner, M. Wheeler, C.R. Almli, C.K.F. Shen, T.-Y. Luh, D.W. Choi, T.-S. Lin, Carboxyfullerenes as neuroprotective agents, Proc. Natl. Acad. Sci. 94 (1997) 9434–9439; L.L. Dugan, E.G. Lovett, K.L. Quick, J. Lotharius, T.T. Lin, K.L. O’Malley, Fullerene-based antioxidants and neurodegenerative disorders, Parkinsonism Relat. Disord. 7 (2001) 243–246], мембранотропные [I.M. Andreev, V.S. Romanova, A.O. Petrukhina, S.M. Andreev, Amino-acid derivatives of fullerene C₆₀ behave as lipophilic ions penetrating through biomembranes, Phys. Solid State. 44 (2002) 683–685], фотодинамические [F. Käsermann, C. Kempf, Buckminsterfullerene and photodynamic inactivation of viruses, Rev. Med. Virol. 8 (1998) 143–151. B. Vileno, A. Sienkiewicz, M. Lekka, A.J. Kulik, L. Forró, In vitro assay of singlet oxygen generation in the presence of water-soluble derivatives of C₆₀, Carbon N. Y. 42 (2004) 1195–1198]; могут выступать в качестве ингибиторов ферментов и апоптоза, а также радиопротекторов [E.I. Pochkaeva, N.E. Podolsky, D.N. Zakusilo, A. V. Petrov, N.A. Charykov, T.D. Vlasov, A. V. Penkova, L. V. Vasina, I. V. Murin, V. V. Sharoyko, K.N. Semenov, Fullerene derivatives with amino acids, peptides and proteins: From synthesis to biomedical application, Prog. Solid State Chem. 57 (2020) 100255; S. Trajković, S. Dobrić, V. Jaćević, V. Dragojević-Simić, Z. Milovanović, A. Đorđević, Tissue-protective effects of fullerenol C₆₀(OH)₂₄ and amifostine in irradiated rats, Colloids Surfaces B Biointerfaces. 58 (2007) 39–43; J. Grebowski, P. Kazmierska, G. Litwinienko, A. Lankoff, M. Wolszczak, A. Krokosz, Fullerenol C₆₀(OH)₃₆ protects human erythrocyte membrane against high-energy electrons, Biochim. Biophys. Acta - Biomembr. 1860 (2018) 1528–1536; K.N. Semenov, N.A. Charykov, V.N. Postnov, V.V. Sharoyko, I.V. Vorotyntsev, M.M. Galagudza, I.V. Murin, Fullerenols: Physicochemical properties and applications, Prog. Solid State Chem. 44 (2016) 59–74; K.N. Semenov, E. V. Andrusenko, N.A. Charykov, E. V. Litasova, G.G. Panova, A. V. Penkova, I. V. Murin, L.B. Piotrovskiy, Carboxylated fullerenes: Physico-chemical properties and potential applications, Prog. Solid State Chem. 47–48 (2017) 19–36; V. V. Sharoyko, S. V. Ageev, N.E. Podolsky, A. V. Petrov, E. V. Litasova, T.D. Vlasov, L. V. Vasina, I. V. Murin, L.B. Piotrovskiy, K.N. Semenov, Biologically active water-soluble fullerene adducts: Das Glasperlenspiel (by H. Hesse), J. Mol. Liq. 323 (2021)]. Использование аддуктов фуллеренов в качестве модификаторов различных материалов (цементы, краски, полимеры) приводит к значительному улучшению их эксплуатационных характеристик [A.A. Zolotarev, A.I. Lushin, N.A. Charykov, K.N. Semenov, V.I. Namazbaev, V.A. Keskinov, A.S. Kritchenkov, Impact Resistance of Cement and Gypsum Plaster Nanomodified by Water-Soluble Fullerenols, Ind. Eng. Chem. Res. 52 (2013) 14583–14591].

В работе [S.K. Khalikov, D. Sharipova, S.Z. Zafarov, M. Umarkhon, S. V. Alieva, Synthesis and Characterization of Fullero-C₆₀ α-Amino Acids with Antiviral Properties, Chem. Nat. Compd. 53 (2017) 121–127.] описан синтез аддуктов фуллерена С₆₀ с глицином и L-лизином, которые выделяли в виде солевых форм (N-C₆₀(H)₆[Gly-ONa]₆⋅10H₂O, N,N-C₆₀(H)₈[L-Lys-ONa]₄⋅10H₂O). Указанные аддукты были синтезированы в результате реакции между фуллереном С₆₀ и индивидуальными аминокислотами в органических растворителях. Для проведения синтеза аминокислоту, взятую в 4–10-кратном избытке, добавляли к щелочному раствору диметилформамида (ДМФА), перемешивали, затем к полученной смеси добавляли по каплям раствор фуллерена С₆₀ в органическом растворителе (хлорбензол, дихлорбензол, бромбензол или бромнафталин) и перемешивали в течение 7–8 ч при 80 °С. Выход реакции составил 70–80 %. Идентификация синтезированных аддуктов проводилась с использованием ИК-, ЯМР- спектроскопии, масс-спектрометрии, элементного анализа и тонкослойной хроматографии. Синтезированные вещества (N-C₆₀(H)₆[Gly-ONa]₆⋅10H₂O, N,N-C₆₀(H)₈[L-Lys-ONa]₄⋅10H₂O) обладают умеренной противовирусной активностью по отношению к вирусу гриппа H5N1. Kornev и соавт. [A.B. Kornev, E.A. Khakina, S.I. Troyanov, A.A. Kushch, A. Peregudov, A. Vasilchenko, D.G. Deryabin, V.M. Martynenko, P.A. Troshin, Facile preparation of amine and amino acid adducts of [С₆₀]fullerene using chlorofullerene C₆₀Cl₆ as a precursor, Chem. Commun. 48 (2012) 5461] разработали метод синтеза производных фуллерена С₆₀ с аминокислотами из галогенпроизводного С₆₀Cl₆. Синтез осуществляли следующим образом: C₆₀Cl₆ (200 мг) растворяли в безводном толуоле (200 мл) при постоянном перемешивании в атмосфере аргона. Соль сложного эфира аминокислоты в виде ацетата или гидрохлорида (7 экв.) и 0,5–1,0 г безводного карбонат калия добавляли к раствору C₆₀Cl₆. Полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 дней. После завершения синтеза неорганические соли удаляли фильтрацией, а раствор, содержащий аддукт фуллерена очищали на хроматографической колонке (сорбент - силикагель, элюент - смесь толуол-этилацетат или толуол-метанол). Выход продукта составил 70-80 %. Идентификация синтезированных аддуктов проводилась с использованием ЯМР- спектроскопии и масс-спектрометрии. В работе [Z. Li, L.-L. Pan, F.-L. Zhang, Z. Wang, Y.-Y. Shen, Z.-Z. Zhang, Preparation and Characterization of Fullerene (C₆₀) Amino Acid Nanoparticles for Liver Cancer Cell Treatment, J. Nanosci. Nanotechnol. 14 (2014) 4513–4518] приводятся данные о получении аддуктов фуллерена C₆₀ с L-фенилаланином и глицином. Для проведения синтеза аминокислоту и NaOH растворяли в деионизированной воде, добавляли безводный этанол и по каплям раствор фуллерена С₆₀ в толуоле. Реакционную смесь перемешивали на магнитной мешалке при комнатной температуре до тех пор, пока органический слой не обесцветится. Далее на роторном испарителе удаляли органическую фазу, а нижний слой смешивали с этанолом для выделения конечного продукта. Синтезированный аддукт очищали гель-эксклюзионной хроматографией с использованием колонки с декстраном G-15 (элюент - вода). Идентификация полученных соединений проводилась с использованием просвечивающей электронной микроскопии и динамического рассеяния света. Было установлено, что полученные аддукты проявляют фотодинамические свойства и вызывают апоптоз клеток гепатоцеллюлярной карциномы (клеточная линия SMMC-7721) при облучении. В работе [Z. Hu, W. Guan, W. Wang, L. Huang, X. Tang, H. Xu, Z. Zhu, X. Xie, H. Xing, Synthesis of amphiphilic amino acid C₆₀ derivatives and their protective effect on hydrogen peroxide-induced apoptosis in rat pheochromocytoma cells, Carbon N. Y. 46 (2008)] аддукт фуллерена С₆₀ с β-аланином получали следующим образом: аминокислоту (10 ммоль) и NaOH (20 ммоль) растворяли в 3 мл воды и добавляли этанол (10–20 мл). Полученный раствор по каплям приливали к раствору фуллерена С₆₀ в толуоле (72 мг С₆₀ на 60 мл толуола), после чего добавляли 5 капель 10 % гидроксида тетрабутиламмония. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в атмосфере азота в течение 60 ч. Далее водный слой отделяли от органического, фильтровали, после чего добавляли 3 мл воды и 40 мл этанола. Полученный осадок перекристаллизовывали водно-этанольной смесью три раза. Дополнительную очистку аддукта проводили методом гель-эксклюзионной хроматографии (сорбент - декстран G-25, элюент - вода). Идентификацию конечного продукта проводили с использованием ИК-спектроскопии и просвечивающей электронной микроскопии.

Zhen и соавт. синтезировали аддукты фуллерена С₆₀ с β-аланином, валином и фолацином, а также изучили их способность захватывать NO-радикалы [Z. Hu, Y. Huang, W. Guan, J. Zhang, F. Wang, L. Zhao, The protective activities of water-soluble C₆₀ derivatives against nitric oxide-induced cytotoxicity in rat pheochromocytoma cells, Biomaterials. 31 (2010) 8872–8881]. Синтез осуществляли следующим образом: β-аланин, валин или фолацин (10 ммоль) и гидроксид натрия (20 ммоль) растворяли в 3 мл воды, добавляли 30 мл этанола. Полученный раствор по каплям приливали к раствору фуллерена C₆₀ в толуоле (72 мг С₆₀ на 60 мл толуола), после чего в реакционную смесь добавляли 5 капель 10 % гидроксида тетрабутиламмония. Полученную гетерогенную систему перемешивали в атмосфере азота при комнатной температуре в течение 48 ч. Далее водный слой отделяли от органического, фильтровали, после чего добавляли 3 мл воды. Полученный осадок перекристаллизовывали водно-этанольной смесью три раза. Дополнительную очистку аддукта проводили методом гель-эксклюзионной хроматографии (сорбент - декстран G-25, элюент - вода). Полученное соединение сушили под вакуумом. Идентификация полученных веществ проводилась с использованием ИК-, ЯМР-спектроскопии, хромато-масс-спектрометрии, просвечивающей электронной микроскопии, динамического рассеяния света и элементного анализа.

Zhen и соавт. [Z. Hu, W. Guan, W. Wang, L. Huang, H. Xing, Z. Zhu, Synthesis of β-alanine C₆₀ derivative and its protective effect on hydrogen peroxide-induced apoptosis in rat pheochromocytoma cells, Cell Biol. Int. 31 (2007) 798–804] синтезировали аддукт фуллерена С₆₀ с β-аланином и изучили его антиоксидантные свойства в условиях оксидативного стресса и апоптоза клеток феохромоцитомы крыс (PC12), индуцированных пероксидом водорода. Синтез аддукта осуществляли следующим образом: 1,5 г β-аланина и 0,85 г гидроксида натрия растворяли в 3 мл воды, добавляли 20 мл этанола. Полученный раствор приливали по каплям к раствору C₆₀ в толуоле (55 мг С₆₀ на 35 мл толуола). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в атмосфере азота в течение 48 ч. Далее водный слой отделяли от органического, фильтровали, после чего добавляли 3 мл воды. Полученный осадок перекристаллизовывали водно-этанольной смесью три раза. Дополнительную очистку аддукта проводили методом гель-эксклюзионной хроматографии (сорбент - декстран G-25, элюент - вода). Нингидриновый тест показал отсутствие непрореагировавшего β-аланина в конечном продукте. Идентификацию полученного аддукта проводили с использованием ИК- и ЯМР-спектроскопии. Было установлено, что синтезированный наноматериал является гептааддуктом фуллерена С₆₀.

В патенте № RU 2462474 авторами представлена методика синтеза аддуктов фуллерена С₆₀ с аминокислотами (L-лизин, L-аргинин, ε-аминокапроновой кислоты), аминосахарами, полигидроксиламинами и белками. В качестве примера рассмотрим синтез аддукта фуллерена С₆₀ с L-лизином и L-аргинином. Для проведения синтеза к суспензии 1,82 мг L-лизина в 20 мл диметилсульфоксида добавляли 8,8 мл N,O-бис(триметилсилил)ацетамида (БТСА). Полученную смесь перемешивали в течение 3 ч до получения полупрозрачного раствора, затем вносили 50 мг фуллерена С₆₀ и перемешивали 20 ч при комнатной температуре (цвет дисперсии становился коричневым). Затем к смеси добавляли 50 мл дистиллированной воды, перемешивали в течение 30 мин и добавляли 30 мл этилацетата. Образовавшуюся гетерогенную систему перемешивали, после чего удаляли органический слой. Полученный водный раствор очищали диализом в дистиллированной воде, затем фильтровали (диаметр пор фильтра — 0,2 мкм) и подвергали лиофилизации. Выход аддукта фуллерена составил 53 мг. Идентификация конечного продукта проводилась с использованием ИК- и УФ-спектроскопии. Результаты кислотно-основного титрования показали, что был синтезирован пентааддукт фуллерена С₆₀. К суспензии 1,74 мг L-аргинина в 20 мл ДМСО добавляли 8,8 мл БТСА, полученную смесь перемешивали в течение 3 ч, затем вносили 144 мг фуллерена С_6 0 и перемешивали в течение 18 ч при комнатной температуре. Затем к смеси добавляли 90 мл дистиллированной воды, смесь перемешивали 15 мин и упаривали в вакууме на роторном испарителе при температуре 40 °С для удаления гексаметилдисилоксана. Оставшуюся водную фазу подкисляли до рН = 3, полученный раствор диализуют против дистиллированной воды, диализат фильтровали через фильтр 0,2 мкм, после чего раствор высушивали лиофилизацией. Выход аддукта составил 370 мг. Идентификация показала, что был синтезирован гексааддукт фуллерена С₆₀.

В патенте (CN103347848A, Hydrated N-fullerene amino acids, method for producing the latter, and pharmaceutical compositions on the basis thereof, 2003б Китай) описывается синтез ε-аминокапроновой кислоты, который проводился по следующей методике: к раствору 60 г фуллерена С₆₀ в 4,5 л о-дихлорбензола прибавляют 204 г мелкоизмельченной безводной калиевой соли ε-аминокапроновой кислоты. К полученной суспензии в течение 2 ч при перемешивании и нагревании (не выше 60 °С) добавляют смесь о-дихлорбензола и эфира метилполиэтиленгликоля 500 в соотношении 5:1. Реакционную смесь перемешивают при температуре не выше 60 °С в течение 5 ч до полного обесцвечивания раствора и образования твердого осадка. Далее смесь фильтруют, осадок промывают на фильтре несколькими порциями этанола и сушат в вакууме при температуре не выше 60 °С. Полученную смесь калиевых солей фуллерен-ε-аминокапроновой кислоты растворяют в 100 мл дистиллированной воды и медленно при перемешивании добавляют 0,1 н HCl до pH = 5,1. Смесь отстаивают до полного осаждения продукта, после чего водный слой декантируют. Остаток, представляющий собой мелкую суспензию твердого продукта в воде, центрифугируют и промывают водой до pH 6. Остаток сушат при температуре не выше 60 °С в вакуумном сушильном шкафу.

Недостатками вышеупомянутых методов являются:

не определена возможность масштабирования синтеза;

не представлены данные о выходе конечного продукта;

не представлены данные о конечной чистоте синтезированного аддукта, что является ограничением применения полученных наноматериалов в биомедицине;

недостаточно подробно проведенная идентификация полученных аддуктов не позволяет установить их однозначный химический состав;

отсутствуют экспериментальные данные по изучению стабильности водных растворов во времени: концентрационная зависимость дзета-потенциалов и размеров частиц.

Наиболее близким техническим решением является способ, описанный в работе [G. Jiang, F. Yin, J. Duan, G. Li, Synthesis and properties of novel water-soluble fullerene–glycine derivatives as new materials for cancer therapy, J. Mater. Sci. Mater. Med. 26 (2015) 24], в которой был синтезирован аддукт фуллерена С₆₀ с глицином, а также изучен его цитостатический эффект на клеточной линии эпителиоидной карциномы шейки матки (HeLa).

Синтез осуществляли следующим образом: глицин (0,3 г) и гидроксид натрия (2,2 г) растворяли в смеси, состоящей из 8 мл воды и 40 мл этанола. Полученный раствор по каплям добавляли к раствору фуллерена С₆₀ в органическом растворителе (35 мг С₆₀ на 30 мл толуола, 1,2-дихлорбензола или диоксана). Гетерогенная система перемешивалась при комнатной температуре в течение 7 дней. Далее удаляли органический слой, фильтровали, добавляли 8 мл воды и 60 мл этанола. Полученный осадок перекристаллизовывали с водно-этанольной смесью три раза. Дополнительную очистку аддукта проводили методом гель-эксклюзионной хроматографии (сорбент - декстран G-25, элюент - вода). Нингидриновый тест показал отсутствие непрореагировавшего глицина в конечном продукте. Полученный аддукт сушили в вакууме. Идентификация синтезированного аддукта была проведена с использованием ИК-, УФ-, ЯМР-спектроскопии, сканирующей электронной микроскопии и термогравиметрического анализа.

Недостатками вышеупомянутого метода являются:

в представленном прототипе описан синтез только одного продукта - аддукта фуллерена C₆₀ с глицином;

не определена возможность масштабирования синтеза;

данные по идентификации полученного аддукта не являются информативными и не позволяют установить состав синтезированного соединения. Более того, вызывает сомнение возможность использования метода жидкостной ЯМР-спектроскопии для идентификации, так как в результате растворения аддуктов фуллеренов в воде образуются крупные ассоциаты с размерами десятки-тысячи нм в зависимости от концентрации, в которых не наблюдается быстрых вращательных диффузионных процессов. В связи с этим, не происходит усреднения диполь-дипольных взаимодействий, что приводит к невозможности регистрации жидкостного спектра ЯМР высокого разрешения;

не указана информация о чистоте полученного соединения, следовательно, невозможно сделать заключение об эффективности проведенной очистки с использованием гель-эксклюзионной хроматографии;

не представлены данные по распределению частиц аддукта фуллерена по размерам и электрокинетическому потенциалу в зависимости от концентрации, следовательно, невозможно сделать заключение о стабильности водных дисперсий аддукта фуллерена.

Технический результат настоящего изобретения состоит в устранении указанных недостатков за счет разработки новой методики синтеза водорастворимых аддуктов легких фуллеренов с L-аминокислотами.

Этот результат достигается тем, что в известном способе получения аддуктов легких фуллеренов с L-аминокислотами, включающем приготовление смеси гидроксида натрия и аминокислоты в водно-этанольной смеси, добавление к полученному раствору легкого фуллерена в растворителе толуоле, перемешивание реакционной смеси в течение 7 дней, отгонку органической фазы, фильтрование, согласно изобретению, в качестве аминокислоты используют протеиногенную аминокислоту L-ряда, в качестве легкого фуллерена используют фуллерен С₆₀ или фуллерен С₇₀, в качестве растворителя дополнительно используют о-ксилол, удаление растворителей из полученной смеси выполняют с помощью роторного испарителя, затем полученный осадок растворяют в дистиллированной воде, перемешивают в течение 2 ч с последующей фильтрацией и нейтрализацией 0,1 М раствором HCl до значения рН = 7-8 , после чего отгоняют воду из раствора до 1/10 объема, с последующей очисткой диализом против дистиллированной воды.

В качестве аминокислоты может быть использована протеиногенная аминокислота L-ряда, а именно: L-аргинин, L-лизин, L-гистидин, L-аспарагиновая кислота, L-глутаминовая кислота, L-серин, L-треонин, L-метионин, L-цистеин, L-селеноцистеин, L-триптофан, L-пролин (L-гидроксипролин), а также глицин.

Для получения аддуктов с L-аминокислотой использовали фуллерены С₆₀ и С₇₀, так как они являются наиболее изученными и обладают уникальными физико-химическими и биологическими свойствами: высокая антиоксидантная активность; мембранотропное и радиопротекторное действие; способность модулировать трансмембранный транспорт ионов; антибактериальная, про- и антиоксидантная активность, а также имеют перспективы применения в качестве скаффолдов для получения противоопухолевых, нейропротекторных и противовирусных препаратов.

Длительное перемешивание реакционной смеси приводит к высокой степени конверсии исходного фуллерена в аддукт с аминокислотой.

В качестве растворителя дополнительно используют о-ксилол, что позволяет варьировать условия синтеза в зависимости от растворимости исходных веществ.

Удаление растворителей из полученной смеси выполняют с использованием роторного испарителя при низком давлении для того, чтоб упростить первый этап очистки конечного продукта от растворителей и не проводить данный процесс при высоких температурах.

Отгонка растворителей из реакционной смеси после синтеза, дальнейшее разбавление водой и фильтрация полученного раствора позволяют увеличить выход целевого продукта.

Растворение полученного осадка в дистиллированной воде с последующим перемешиванием в течение 2 ч, фильтрацией и нейтрализацией позволяет очистить конечный продукт от непрореагировавших веществ, представленных твердой фазой, а последующая отгонка воды из раствора до 1/10 объема и последующей длительной очисткой диализом против дистиллированной воды приводит к достаточно полной очистке от примесей и непрореагировавших веществ и получению конечного продукта высокой степенью чистоты.

Лиофилизация и проведение синтеза в атмосфере инертного газа позволяют избежать окислительных процессов в фуллереновом коре.

Таким образом, только такая последовательность действий позволяет устранить недостатки прототипа и аналогов, а также достичь заявленного нами технического результата. Использование предложенного метода в практике позволяет осуществить одностадийный синтез аддуктов фуллеренов С₆₀ и С₇₀ с L-аминокислотами с высоким выходом, воспроизводимым химическим составом, а также высокой степенью чистоты, удовлетворяющей требованиям при проведении биомедицинских исследований.

Для лучшего понимания в качестве примеров заявленного изобретения приводим методику синтеза.

Стадия 1 включает в себя получение раствора аминокислоты и щелочи в водно-этанольной смеси (мольное соотношение гидроксид натрия:аминокислота:вода:этанол – 0,5:0,034:3,87:7,61), с последующим его добавлением к насыщенному раствору фуллерена С₆₀ или С₇₀ в о-кислоле или толуоле (мольное соотношение фуллерен С₆₀ или С₇₀: о-кислол или толуол – 0,001:1,42) и перемешивание в течение 7 дней при комнатной температуре в атмосфере инертного газа.

Стадия 2. По окончании перемешивания из реакционной смеси удаляют растворители, полученный осадок разбавляют водой, фильтруют, нейтрализуют до рН = 7-8 с помощью 0,1 М раствора HCl, отгоняют воду до 1/10 исходного объема, осуществляют очистку диализом против дистиллированной воды в течение 48 ч и с помощью лиофилизации получают окончательный продукт.

Сущность способа поясняется примером.

Пример 1.

Стадия 1. В круглодонной колбе смешивали 15,76 г NaOH и 54 мл H₂O, 4,65 г L-аргинина и 270 мл этанола. Затем к образовавшемуся раствору добавляли раствор фуллерена С₆₀ (1 г фуллерена С₆₀ растворяли 131,5 мл о-ксилола) и полученную реакционную смесь перемешивали в течение 7 дней при комнатной температуре в атмосфере инертного газа.

Стадия 2. По окончании перемешивания из реакционной смеси на роторном испарителе удаляли растворители при t = 55 °С. Далее к полученному осадку добавляли 1 л дистиллированной воды и полученную смесь перемешивали 2 ч, после чего фильтровали с помощью фильтра (синяя лента) и фильтрат нейтрализовали раствором соляной кислоты (С = 0,1 М) до pH = 7-8, после чего полученный раствор концентрировали на роторном испарителе до 0,1 л (t = 55 °С, P = 0,8 кПа). Полученный раствор помещали в диализный мешок (1000 Да) и проводили диализ в течение 48 ч. Далее проводилась лиофилизация конечного продукта.

Пример 2.

Стадия 1. В круглодонной колбе смешивали 15,76 г NaOH и 54 мл H₂O, 3,90 г L-лизина и 270 мл этанола. Затем к образовавшемуся раствору добавляли раствор фуллерена С₇₀ (1 г фуллерена С₇₀ растворяли 131,5 мл о-ксилола) и полученную реакционную смесь перемешивали в течение 7 дней при комнатной температуре в атмосфере инертного газа.

Стадия 2. По окончании перемешивания из реакционной смеси на роторном испарителе удаляли растворители при t = 55 °С. Далее к полученному осадку добавляли 1 л дистиллированной воды и полученную смесь перемешивали 2 ч, после чего фильтровали с помощью фильтра (синяя лента) и фильтрат нейтрализовали раствором соляной кислоты (С = 0,1 М) до pH = 7-8, после чего полученный раствор концентрировали на роторном испарителе до 0,1 л (t = 55 °С, P = 0,8 кПа). Полученный раствор помещали в диализный мешок (1000 Да) и проводили диализ в течение 48 ч. Далее проводилась лиофилизация конечного продукта.

Для характеризации полученного наноматериала использовались следующие физико-химические методы анализа. В качестве примера приведем аддукт фуллерена C₆₀ с L-аргинином - С₆₀-Arg.

На Фиг. 1. Представлены дисперсии C60-Arg в диапазоне концентраций C = 0,01–10,00 г⋅л-1.

Для характеризации полученного наноматериала использовались следующие физико-химические методы анализа.

¹³C ЯМР спектроскопия

На Фиг. 2 представлен ¹³С ЯМР спектр С₆₀-Arg, где 1 - химический сдвиг (ppm), на котором видны следующие сигналы: а-сигнал, соответствующий атому углерода карбоксильной группы (176,9 ppm); б-сигнал, соответствующий атому углерода гуанидиновой группы (158,8 ppm); в-сигнал, соответствующий α-углеродному атому L-аргинина (55,6 ppm); г, д -сигналы, соответствующие атомам углерода –СН₂– групп (42,3, 27,8 ppm), а также сигналы, относящиеся к атомам углерода фуллеренового кора (139,3, 75,6, 63,8, 16,5 ppm); в частности, пик с химическим сдвигом 75,6 ppm может быть отнесен к атомам углерода фуллеренового кора, связанного с атомом водорода.

Инфракрасная спектроскопия

На Фиг. 3 представлен ИК-спектр твердого образца C₆₀-Arg (где 2 - A (пр. ед.), 3 - n (см^-1)) в таблетке KBr включает следующие пики: ν, см^-1: 3430 - nO-H, 2900 - nC-H, 1605 - nC=O, 1390 - nC-N, 1140 - (nN-C₆₀₎, 515 - (C₆₀ ядро).

Электронная спектроскопия

На Фиг. 4 представлены электронные спектры поглощения водного раствора C₆₀-Arg (С = 8 мг⋅л^-1) и С₆₀ (С = 10 мг⋅л^-1) в о-ксилоле (для сравнения), где 2 - A (пр. е.), 4 - λ (нм). Из полученных спектров можно сделать следующие выводы: (1) электронный спектр водного раствора C₆₀-Arg не содержит полос поглощения; (2) в спектре водного раствора C₆₀-Arg отсутствует характерный для фуллерена C₆₀ пик поглощения при λ = 335 нм; (3) сравнение спектров растворов C₆₀-Arg и C₆₀ подтверждает функционализацию фуллеренового кора и отсутствие непрореагировавшего фуллерена C₆₀.

Высокоэффективная жидкостная хроматография

Определение чистоты C₆₀-Arg проводилось методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с УФ-детектированием при 300 нм, с использованием колонки «Phenomenex® NH₂» (150 мм × 2,0 мм, 5 мкм, 100 Å), объём введения – 2⋅10^-8⋅м³, скорость введения – 0,2 мл⋅мин^-1, элюент ‒ ацетонитрил/0,1 % водный раствор уксусной кислоты (5/95). Исходя из данных хроматографического анализа, чистота производного С₆₀-Arg составляет 99,8 % (Фиг. 5- жидкостная хроматограмма C60-Arg, где 5 - Интенсивность (пр. е.), 6 - Время (мин)).

Термогравиметрический анализ

На Фиг. 6 представлены результаты термогравиметрического анализа C₆₀-Arg: TG (сплошная линия) и DTG (пунктирная линия), где 7- TG (%), 8 - T, (K), 9 - DTG (%⋅мин^-1), 10 - DSC / V⋅мг^-1. Из полученных данных видно следующее: (1) в интервале температур до 340 К аддукт C₆₀-Arg термически стабилен; (2) в интервале температур T = 340–950 K протекают многостадийные процессы разложения C₆₀-Arg (в присутствии O₂), включающие дегидратацию, декарбоксилирование, деазотирование и дегидрирование; потеря массы 65,9 % соответствует деградации восьми остатков L-аргинина; (3) в интервале температур Т = 950–1270 К происходит окисление фуллеренового ядра (С₆₀).

Распределение по размерам и ξ-потенциалы

На Фиг. 7 (Концентрационная зависимость распределения по размерам ассоциатов C₆₀-Arg в водных растворах при 298,15 К (а); концентрационная зависимость ξ-потенциалов ассоциатов первого, второго и третьего типов C₆₀-Arg в водных растворах при 298,15 К (б), где 11 - ln_di / ln (нм), 12 - ln/ ln (г⋅дм^-3), 13 - ξ_i / мВ) анализ концентрационных зависимостей распределения ассоциатов C₆₀-Arg по размерам и ξ-потенциалов в водных растворах в диапазоне концентраций C = 0,001 - 10 г⋅дм^-3 при Т = 298,15 К (Фиг. 7 а, б) показывает следующее: (1) отсутствие мономерных молекул C₆₀-Arg с линейными размерами 2 нм во всём диапазоне концентраций; (2) присутствие ассоциатов первого и второго типов в диапазоне концентраций С = 0,001 - 0,1 г⋅дм^-3 с линейными размерами 50-70 нм и 200-300 нм, соответственно; (3) присутствие исключительно ассоциатов второго типа в концентрационном интервале С = 0,1 - 0,2 г⋅дм^-3; (4) одновременное присутствие в растворе ассоциатов второго и третьего порядков (5 - 6 мкм) в диапазоне концентраций C = 0,3-10 г⋅дм^-3. Анализ концентрационной зависимости ξ-потенциала показывает, что: (1) во всём диапазоне концентраций значения ξ-потенциала отрицательны и равны -60 -20 мВ; (2) в изученном интервале концентраций растворы C₆₀-Arg являются агрегативно устойчивыми; (3) распределение ξ-потенциала включает в себя два пика, относящихся к ассоциатам первого и второго типов в интервале концентраций С = 0,001-0,1 г⋅дм^-3; один пик, относящийся к ассоциатам второго типа в интервале концентраций С = 0,2-5 г⋅дм^-3; два пика, относящиеся к ассоциатам второго и третьего типов в области концентраций C = 5-10 г⋅дм^-3; (4) cравнение экспериментальных данных, показывает несовпадение размерности ассоциатов в концентрационном диапазоне C = 0,1-3 г⋅дм^-3. Скорее всего, это связано с тем, что под действием электрического потенциала заряженные частицы C₆₀-Arg могут ассоциировать или диссоциировать в зависимости от соотношения поверхностных зарядов и степени гидратации кластеров.

Предлагаемый способ получения аддуктов легких фуллеренов с L-аминокислотами имеет следующие преимущества перед аналогами:

одностадийный синтез приводит к получению аддуктов фуллерена с аминокислотами с высоким выходом и воспроизводимым химическим составом;

увеличение длительности перемешивания реакционной смеси приводит к более полной конверсии исходного фуллерена;

отгонка растворителей из реакционной смеси после синтеза, разбавление полученного осадка водой и фильтрация образовавшегося раствора позволяют избежать снижения выхода продукта;

последующая очистка аддукта, включающая нейтрализацию и длительный диализ позволяют эффективно избавиться от непрореагировавших веществ, что обеспечивают высокую чистоту, удовлетворяющую требованиям при проведении биомедицинских исследований;

лиофилизация и проведение синтеза в атмосфере инертного газа позволяют избежать окислительных процессов.

Способ получения аддуктов легких фуллеренов с L-аминокислотами разработан в отделе фундаментальных исследований ФГБУ «РНЦРХТ им. ак. А.М. Гранова» Минздрава России.

Изобретение относится к органической химии и нанотехнологиям и может быть использовано при получении водорастворимых производных легких фуллеренов с L-аминокислотами. Способ заключается в приготовлении смеси гидроксида натрия и протеиногенной аминокислоты L-ряда в водно-этанольной смеси, добавлении к полученному раствору аддукта легкого фуллерена С₇₀ или С₆₀ в растворителе толуоле или о-ксилоле, перемешивании реакционной смеси в течение 7 дней, удалении растворителей из полученной смеси с помощью роторного испарителя, растворении полученного осадка в дистиллированной воде, перемешивании в течение 2 ч с последующей фильтрацией и нейтрализацией 0,1 М раствором HCl до значения рН = 7-8, с последующей отгонкой воды из раствора до 1/10 объема и очисткой с помощью диализа против дистиллированной воды. Предлагаемый способ позволяет получить аддукты фуллеренов с аминокислотами с высоким выходом и воспроизводимым химическим составом. 7 ил., 2 пр.

Способ получения аддуктов легких фуллеренов с L-аминокислотами, включающий приготовление смеси гидроксида натрия и аминокислоты в водно-этанольной смеси, добавление к полученному раствору аддукта легкого фуллерена в растворителе, перемешивание реакционной смеси в течение 7 дней, удаление растворителей из полученной смеси, фильтрование, отличающийся тем, что в качестве аминокислоты используют протеиногенную аминокислоту L-ряда, в качестве аддукта легкого фуллерена используют фуллерен С₇₀ или фуллерен С₆₀, в качестве растворителя используют толуол или о-ксилол, удаление растворителей из полученной смеси выполняют с помощью роторного испарителя, затем полученный осадок растворяют в дистиллированной воде, перемешивают в течение 2 ч с последующей фильтрацией и нейтрализацией 0,1 М раствором HCl до значения рН = 7-8, после чего отгоняют воду из раствора до 1/10 объема с последующей очисткой с помощью диализа против дистиллированной воды.