Система для выделения опухолевых клеток из спермы и семенной жидкости и способ ее реализации Российский патент 2025 года по МПК G01N33/483 B01L3/00 B81B1/00 

Область техники

Изобретение относится к физике, а именно к устройствам и способам для физического анализа жидких биологических материалов. Система функционирует по принципам инерционной микрогидродинамики и предназначена для выделения клеточных суспензий из спермы, а способ ее применения разработан для определения присутствия опухолевых (атипичных) клеток в сперме при новообразованиях мужской репродуктивной системы.

Уровень техники

Из уровня техники известно множество систем на основе микрогидродинамики для сортировки клеток спермы. Подавляющее большинство из них предназначено для решения задач в области репродуктивного здоровья и искусственного оплодотворения, их функция заключается в фракционировании сперматозоидов с целью отбора наиболее качественных клеток для последующих манипуляций. Так, из уровня техники известно микрогидродинамическое устройство для изоляции сперматозоидов и осеменения ооцитов TWENTY-SECOND FLOOR (номер патента US 2006/0270021 А1). Устройство обеспечивает возможность проведения осеменения in vitro с использованием образцов спермы с повышенной подвижностью и с минимальными манипуляциями с хрупкими ооцитами. Сортировка сперматозоидов осуществляется в общем сортировочном канале, в котором более подвижные сперматозоиды пересекают границу между коламинарными потоками спермы и жидкости среды. Также известно устройство в виде микрофлюидного чипа, предназначенное для сортировки клеток спермы и способное разделять между собой субпопуляции сперматозоидов (номер патента US 2014/0273179 А1). Технические решения данного типа направлены на работу со сперматозоидами. Прочие клеточные компоненты спермы, в том числе опухолевые клетки, не являются объектами интереса и отсортировываются на разных стадиях работы устройств.

Также из уровня техники известны системы и способы, устройства и аппараты для выделения опухолевых клеток из различных жидких биологических материалов. Развитие микроэлектромеханических систем позволило проводить исследования с использованием различных способов выделения опухолевых клеток из биологических жидкостей, преимущественно крови. Один из таких способов основан на принципах безметочного (то есть без использования реакции антиген-антитело и каких-либо меток - антител, фрагментов антител, аффибоди, и проч.) микрогидродинамического выделения. В этой технологии разделение основано на различиях в биофизических характеристиках, таких как размер, плотность, деформируемость или диэлектрические свойства, между опухолевыми клетками и другими клетками, присутствующими в биологической жидкости [1-3]. Так, известно микрогидродинамическое устройство для обнаружения редких клеток в образце жидкости, содержащем содержит как редкие клетки, так и другие типы клеток (номер патента US 10677708 B2). Микрогидродинамическое устройство содержит впускное отверстие для приема образца жидкости, лабиринтную структуру канала, сообщающуюся по текучей среде с входным отверстием, и выпускное отверстие, сообщающееся по текучей среде с лабиринтной структурой канала для сбора редких клеток, отделенных от других клеток в образце жидкости. Структура лабиринтного канала содержит, по меньшей мере, один канал, по которому протекает проба текучей среды. По меньшей мере, один канал имеет множество сегментов и множество углов, причем каждый угол определяется между соседними сегментами. Наличие множества углов вызывает отделение разреженных ячеек от других ячеек в образце жидкости по мере того, как разрозненные клетки перемещаются в первое положение равновесия по меньшей мере в одном канале, когда соотношение инерционных подъемных сил и потока Дина в образце жидкости от 2 до 10. Среди недостатков данного устройства можно отметить длительное время работы устройства и сложную структуру каналов, требующую трудоемкого производства.

Среди различных подходов к микрогидродинамическому безметочному выделению диссеминированных опухолевых клеток особый интерес представляет инерционная методика, основанная на определении размера, благодаря высокой эффективности разделения, скорости выделения и производительности. Кроме того, при таком подходе выделенные клетки остаются неповрежденными, что дает возможность проводить дальнейшие исследования, включая анализ отдельных клеток, и используется при разработке различных микроканальных устройств, предназначенных для жидкостной биопсии крови и мочи [4]. Наиболее близким к заявляемому техническому решению по технической сущности и достигаемому техническому результату является устройство, описанное в заявке WO 2015057159 (RU 2016118626). Устройство, а именно микрогидродинамический сортер для выявления и изоляции клеток, содержит по меньшей мере одно впускное отверстие для приема циркулирующих опухолевых клеток и других клеток в образце; по меньшей мере один криволинейный и/или спиральный канал, через который образец подвергают частичным или полным циклам Дина для изоляции циркулирующих опухолевых клеток от других клеток; и по меньшей мере одно выпускное отверстие, выполненное с возможностью сообщения с каналом для подачи изолированных циркулирующих опухолевых клеток. Канал сконфигурирован для обеспечения заданного соотношения сил на основе желаемого порогового размера циркулирующих опухолевых клеток. Также в изобретении раскрыты соответствующий способ изготовления устройства и соответствующая диагностическая система.

Данное устройство было создано для работы с кровью. Следует отметить, что кровь и сперма значительно различаются по своему составу, физическим и химическим параметрам. Наиболее значительными для микрогидродинамических систем являются различия в вязкости и составе частиц и их распределению по размерам и форме. Основным форменным компонентом крови являются эритроциты в форме двояковогнутого диска, диаметром 6,2-8,2 мкм, следующими по численности являются тромбоциты, затем уже идут лейкоциты и прочие иммунные клетки, размером 4-20 мкм. Эпителиальные клетки, к которым относятся и опухолевые клетки, встречаются в крови в крайне малом количестве. Сперма же состоит из двух основных фракций - сперматозоидов, однородных по форме и размеру (размер головки 5 x 3,5 × 2,5 мкм) и незначительного количества эпителиальных клеток, также могут встречаться иммунные клетки. Таким образом, в рамках одной микрогидродинамической системы нельзя одинаково эффективно работать со столь различными биологическими жидкостями. Данное изобретение было взято в качестве наиболее близкого аналога системы, описываемой в заявке. Заявляемая система и способ разработаны с прицелом на: 1) эффективное отделение сперматозоидов от эпителиальных клеток по размеру; 2) эффективное выявление фракции опухолевых клеток среди прочих эпителиальных клеток при помощи иммунологических реакций с применением антител к известным антигенам новообразований.

Раскрытие изобретения

Рак предстательной железы (РПЖ) является одним из основных видов рака, диагностируемых у мужчин во всем мире, занимая первое или второе место по смертности от злокачественных новообразований в зависимости от региона. Одной из основных проблем при РПЖ является отсутствие симптомов при его ранней локализованной форме. Поэтому раннее выявление имеет решающее значение в лечении РПЖ. Также, в связи с длительным развитием РПЖ, наиболее частыми подходами при локализованной формы заболевания являются активное и динамическое наблюдение. Таким образом, необходимы повторные обследования для отслеживания прогрессирования заболевания. В настоящее время диагностику РПЖ проводят на основании уровня свободного и/или общего простатического специфического антигена в сыворотке крови, УЗИ и тканевой трансректальной биопсии.

Анализ крови на простатический специфический антиген (ПСА) является основным тестом, используемым для определения наличия признаков РПЖ. Однако тест на ПСА обладает лишь умеренной специфичностью и чувствительностью на уровне 40-60%, особенно при локализованной форме заболевания. Уровень ПСА может быть повышен при доброкачественной гиперплазии и воспалительных заболеваниях предстательной железы. УЗИ дает лишь общую информацию об эхогенности структур и тканей. Поэтому существует потребность в дополнительных малоинвазивных способах диагностики, которое смогут заполнить нишу между способы диагностики.

Одним из способов, который потенциально может заменить или дополнить традиционные способы диагностики и прогнозирования РПЖ, такие как тест на ПСА и биопсия тканей, является жидкостная биопсия путем инерционного микрогидродинамического выделения опухолевых клеток РПЖ из жидких биологических материалов. Общеизвестно, что опухолевые клетки постоянно отделяются от опухоли и попадают в различные ткани и органы, в основном, через жидкие среды. Этот процесс напрямую связан с процессом метастазирования, и называется диссеминированием, а отделившиеся от первичного сайта опухоли клетки называют диссеминированными опухолевыми клетками (ДОК). В случае обнаружения подобных клеток в периферической крови, их принято называть циркулирующими опухолевыми клетками (ЦОК). Ранее для выделения ЦОК из крови была успешно применена безметочная жидкостная биопсия на основе инерционной микрогидродинамики у пациентов со злокачественными новообразованиями головы и шеи, раке груди и раке легкого [5-7]. Кроме того, продемонстрирована высокая эффективность данного подхода при выделении ДОК РПЖ из мочи [8]. Важно отметить, что на ранних стадиях развития заболевания, кровь и моча могут не содержать достаточного количества клеток для эффективного выделения и анализа [9-11]. Таким образом, сперма представляет особый интерес как альтернативная биологическая жидкость, потенциально содержащая наибольшее количество ДОК. В процессе эякуляции семенная жидкость (жидкий компонент спермы) непосредственно контактирует со всей площадью предстательной железы, "вымывая" оттуда различные клеточные элементы, в том числе опухолевые клетки. Затем происходит изгнание спермы вместе с опухолевыми клетками из организма во внешнюю среду.

В 1996 году Гардинер с соавт. описали наличие ДОК РПЖ в образцах эякулята у пациентов с РПЖ [12]. В данном исследовании для определения ДОК РПЖ образцы эякулята центрифугировали для получения осадка. Далее из полученного осадка делали мазки и проводили микроскопическое исследование на наличие опухолевых клеток. При использовании этого способа у 75% пациентов, у которых рак предстательной железы был подтвержден гистоморфологическим исследованием биопсийного материала, взятого под контролем трансректальной ультрасонографии, обнаружены атипичные клетки предстательной железы в сперме. Однако поскольку сперма содержит десятки миллионов сперматозоидов в 1 мл, такой способ поиска небольшого количества опухолевых клеток рака предстательной железы в мазках эякулята имеет низкую эффективность и неудобна. В другом исследовании в качестве способа для обнаружения клеток рака предстательной железы в сперме была предложена проточная цитометрия [13]. Однако общеизвестно, что этот способ нарушает жизнеспособность и обладает недостаточной чувствительностью для обнаружения редких клеток.

В основу настоящего изобретения положена задача разработать систему на основе микрогидродинамического устройства для эффективного выделения опухолевых клеток из спермы. Инерционная микрогидродинамика является одним из наиболее перспективных подходов для выделения ДОК РПЖ из спермы [14]. Этот подход уже был успешно применен для выделения ДОК из крови и мочи [8, 15]. Однако следует отметить, что сперма в норме содержит большое количество сперматозоидов - сотни миллионов на мл. Кроме того, сперматозоиды имеют необычную некруглую форму с вытянутой головкой и длинным хвостом. Несмотря на то, что размер головки сперматозоида в среднем составляет 5 мкм, что в несколько раз меньше размера средней ДОК и поэтому удобен для микрогидродинамического разделения по размеру, очень длинный хвост размером около 50 мкм может значительно изменить движение сперматозоидов в потоке жидкости [16]. Кроме того, сперма имеет гораздо более высокую вязкость по сравнению с мочой и кровью, что требует применение принципиально иного подхода к выделению ДОК с помощью инерционной микрогидродинамики, основанной на определении размера [17]. При этом сперма по сравнению с кровью и мочой гораздо более однородна в отношении представленных в ней типов клеток. Такая клеточная однородность облегчает разработку соответствующего способа для микрогидродинамического обогащения ДОК.

Таким образом, техническим результатом, на достижение которого направлена заявляемая система и способ ее реализации, является эффективное отделение фракции крупных эпителиальных клеток от фракции мелких сперматозоидов в сперме (а также семенной жидкости).

При этом отделение происходит с учетом особенностей этого жидкого биологического материала; а также идентификация опухолевых клеток, происходящих из клеток мужской репродуктивной системы, включая клетки рака предстательной железы, герминогенных опухолей и аденокарциномы. Этот способ также применим для очистки сперматозоидов от эпителиальных клеток и прочих твердых частиц большого размера для различных нужд. Достижение результата выражается в выделении в целевую фракцию не менее 70-85% присутствующих в первоначальном образце спермы эпителиальных клеток, превышающих в диаметре сперматозоиды на 10-13 мкм и более, а также в выделении не менее 90-99% сперматозоидов, присутствующих в образце, в мусорную фракцию. Также производится характеризация выделенных клеток и определение их принадлежности к ДОК РПЖ, при этом могут быть проанализированы и учтены такие параметры, как морфологические особенности клеток, количество и жизнеспособность клеток, экспрессия поверхностных и внутриклеточных опухоль-ассоциированных антигенов, опухоль-ассоциированные внутриклеточные ДНК- и РНК-маркеры, внутриклеточные везикулы.

Для достижения технического результата система для выделения опухолевых клеток из спермы и семенной жидкости состоит из емкости для промывочного буфера, емкости для спермы, насоса, микрогидродинамического устройства, блока регистрации целевой фракции и емкости для слива отработанной жидкостей, причем все элементы и блоки соединены между собой трубками, обеспечивающая получение целевой фракции опухолевых клеток из части или из всего объема образца спермы или семенной жидкости от пациента со злокачественными новообразованиями; при этом, по меньшей мере, одна емкость для промывочного буфера, обеспечивающего предварительную и заключительную очистку системы; по меньшей мере одна емкость для жидкого биологического образа (сперма или суспензия клеток из спермы), из которой обеспечивается подача образца в систему; по меньшей мере один насос, обеспечивающий прокачивание жидкого биологического образца через систему; по меньшей мере одно микрогидродинамическое устройство, содержащее внутри себя по меньшей мере один первичный инерционный криволинейный микрогидродинамический канал, предназначенный для разделения клеток спермы на две фракции по размеру, разделяющийся на по меньшей мере два вторичных криволинейных инерционных канала на дистальном конце; по меньшей мере одно впускное отверстие, обеспечивающее соединение инерционного микрогидродинамического канала с системой; по меньшей мере два выпускных отверстия, обеспечивающих соединение вторичных микрогидродинамических инерционных каналов с системой; по меньшей мере одно выпускное отверстие, предназначенное для выпуска с потоком жидкости целевой фракции более крупных клеток, в том числе опухолевых; по меньшей мере одно выпускное отверстие, предназначенное для выпуска с потоком жидкости более мелких клеток, в том числе сперматозоидов, и прочих частиц; по меньшей мере один блок регистрации, обеспечивающий анализ параметров клеток целевой фракции; по меньшей мере одна емкость, вмещающая отработанные в системе растворы и биологические жидкости; поток жидкости через систему обеспечивается при помощи трубок, непрерывно соединяющих между собой все элементы системы. При этом система характеризуется тем, что способствует отделению сперматозоидов от опухолевых клеток в поступающей клеточной суспензии, включающей сперматозоиды, опухолевые клетки, клетки крови, эпителиальные клетки, тромбоциты, частицы пыли и или остатки разрушенных клеток, где движение клеточной суспензии в криволинейном микроканале обеспечивает разделение компонентов клеточной суспензии на основе размера на две или более жидкостных фракции такого размера, что каждый компонент получает свою фракцию равного или разного объема и равную или разную долю компонентов в клеточной суспензии. Причем система характеризуется тем, что первичный криволинейный микроканал имеет спиральную конфигурацию и по меньшей мере одно впускное отверстие, предназначенное для приема клеточной суспензии или цельной разжиженной спермы. Кроме того, система характеризуется тем, что первичный криволинейный микроканал со спиральной конфигурацией включает в себя по меньшей мере 3 петли по меньшей мере с 1 раздвоением на два вторичных криволинейных микроканала. А также система характеризуется тем, что ключевой элемент представляет собой микрогидродинамическое устройство, сконструированное для приема непрерывного потока клеточной суспензии через по меньшей мере одно впускное отверстие и для обеспечения отделения опухолевых клеток и (или) сперматозоидов от других компонентов, присутствующих в сперме, при непрерывном потоке; опухолевые клетки, присутствующие в клеточной суспензии, могут происходить из любого органа или жидкости, участвующих в образовании человеческой спермы, таких как предстательная железа, яички, придаток яичка, семенные пузырьки, бульбоуретральная железа и кровь, при этом конфигурация системы подразумевает, что опухолевые клетки выпускаются через по меньшей мере одно выпускное отверстие микрогидродинамического устройства и далее проходят через блок регистрации для учета параметров, а большинство других клеток, присутствующих в сперме, включая сперматозоиды, выпускаются через по меньшей мере еще одно выпускное отверстие; сперма, используемая для получения клеточных суспензий, может быть приготовлена с использованием чистого жидкого образца спермы или может быть специально подготовлена перед исследованием путем нагрева, отстаивания, разбавления исходного образца спермы, центрифугирования и последующего ресуспендирования образца спермы для получения концентрированной клеточной суспензии, или добавления реологических модификаторов к исходному образцу спермы, или комбинации вышеперечисленных процедур. При этом система имеет поперечное сечение криволинейного инерционного микрогидродинамического канала в форме невыпуклого пятиугольника ABCDE, где диагональ BD лежит вне многоугольника, с шириной основания от 50 до 1000 мкм, предпочтительно от 300 до 600 мкм, меньшей высотой от 20 до 150 мкм, предпочтительно 30 или 100 мкм, и большей высотой от 70 до 200 мкм, предпочтительно 90 или 140 мкм, с количеством петель от 3 до 15, предпочтительно от 5 до 8, начиная от внешних петель к внутренним с общей длиной канала от 25 до 75 см, предпочтительно 40-50 см, углами между сторонами АВ и АЕ и сторонами ED и АЕ равными 90 градусам, углом между сторонами ВС и CD, лежащем в интервале 125-150 градусов, предпочтительно 130-135 градусов. И ней имеются по меньшей мере два выпускных отверстия, расположенных на дистальном конце криволинейного канала, в центре микрогидродинамического устройства. Кроме того, в системе, по меньшей мере, один криволинейный микроканал микрогидродинамического устройства предназначен для отделения опухолевых клеток от других клеток, присутствующих в сперме, путем фокусировки опухолевых клеток у одной из стенок криволинейного микроканала, что обеспечивает отделение опухолевых клеток от других клеток, присутствующих в сперме, при этом опухолевые клетки выпускаются из микроканала через отдельные выпускные отверстия с выделением потока жидкости в виде по меньшей мере двух жидких фракций. И в которой, по меньшей мере, одна жидкая фракция, выпущенная из по меньшей мере одного выпускного отверстия вторичного канала микрогидродинамического устройства, содержит сперматозоиды практически в той же концентрации, что и образец клеточной суспензии, полученный через по меньшей мере одно впускное отверстие.

А способ реализации системы для выделения опухолевых клеток из спермы и семенной жидкости включает подачу буфера или иного реагента для предварительной подготовки системы из специализированной емкости в систему через по меньшей мере одно впускное отверстие системы для выделения опухолевых клеток и/или сперматозоидов; подачу суспензии клеток, полученных из спермы пациента, либо спермы пациента, через по меньшей мере одно впускное отверстие системы для выделения опухолевых клеток и или сперматозоидов; выделение опухолевых клеток и (или) сперматозоидов на основе разницы в размере и плотности клеток, представленных в клеточной суспензии, разделяемых на различные жидкостные фракции в месте по меньшей мере одного раздвоения по меньшей мере одного криволинейного микроканала; выведение с потоком жидкости выделенной более крупной фракции клеток через по меньшей мере одно отдельное выпускное отверстие из по меньшей мере двух выпускных отверстий и выведение сперматозоидов через по меньшей мере одно другое отдельное выпускное отверстие из по меньшей мере двух выпускных отверстий; подачу выделенной целевой фракции более крупных клеток в блок регистрации; подачу отработанной в системе жидкости в емкость со сливом, и, по меньшей мере, один криволинейный микроканал имеет спиралевидную форму. При этом в способе, по меньшей мере, один первичный криволинейный микроканал имеет по меньшей мере одно раздвоение, разделяющее первичный микроканал на по меньшей мере два вторичных микроканала. А также при реализации способа вторичные микроканалы могут иметь криволинейную форму и соединены с первичным микроканалом для потока жидкости, при этом как первичный, так и вторичные микроканалы могут иметь форму поперечного сечения в виде невыпуклого пятиугольника. Опухолевые клетки выделяются в, по меньшей мере, одном криволинейном микроканале под действием гидродинамических сил, включая инерционные подъемные силы и силы сопротивления Дина, а баланс этих двух сил напрямую коррелирует с диаметром клеток и частиц, и он же обеспечивает фокусировку частиц в различных равновесных положениях. Способ состоит в отделении опухолевых клеток и или сперматозоидов от других клеток, присутствующих в клеточной суспензии, полученной из спермы, в первую очередь сперматозоидов, путем фокусировки опухолевых клеток с одной стороны просвета по меньшей мере одного криволинейного микроканала и фокусировки сперматозоидов с другой стороны просвета по меньшей мере одного криволинейного микроканала. А также способ включает отделение опухолевых клеток и/или сперматозоидов от любых других компонентов клеточной суспензии, полученной из спермы, таких как лейкоциты, эритроциты, эпителиальные клетки, остатки разрушенных клеток, частицы пыли или тромбоциты. Кроме того, способ характеризуется тем, что, по меньшей мере, одна жидкая фракция, полученная через по меньшей мере одно выпускное отверстие, содержит сперматозоиды практически в той же концентрации, что и в исходной клеточной суспензии, содержащей сперматозоиды, подаваемой через по меньшей мере одно впускное отверстие. При этом опухолевые клетки или сперматозоиды, подаваемые по меньшей мере через одно впускное отверстие, выпускаются по меньшей мере через два выпускных отверстия и рециркулируют через то же впускное отверстие и выпускаются через те же выпускные отверстия до пяти раз.

Изобретение представляет собой микрогидродинамическую систему, способную выделять опухолевые клетки из спермы. Система состоит из следующих элементов, соединенных между собой трубками:

• Емкость для жидкостей; каждая емкость состоит из стекла или медицинского пластика, пригодна для содержания буферных растворов, жидких биологических материалов, а также пригодна для нагрева до температуры не менее +60°С. Материал не должен выделять цитотоксические соединения. Система содержит не менее двух емкостей -одна емкость предназначается для промывки системы до и после работы фосфатно-солевым буфером, а также любым иным раствором; вторая емкость содержит образец спермы. В емкости погружаются концы трубок, далее проходящих через систему.

• Насос (перистальтический, шприцевой или иной) для прокачивания жидкостей через систему; способен обеспечивать прокачку жидкостей через систему за один цикл работы в объеме от 10 мкл до 1000 мл, скоростью от 0,01 мкл/мин до 100 мл/мин.

• Ключевой элемент системы - микрогидродинамическое устройство, где происходит разделение клеток на фракции в потоке жидкости; подробное описание устройства и его возможных конфигураций приводится ниже.

• Блок регистрации сигнала; предназначен для оценки характеристик целевой клеточной фракции.

• Емкость для слива отработанных жидкостей; представляет собой емкость из стекла или медицинского пластика. Емкость объема не менее 500 мл. Емкость вмещает все жидкости и растворы, выходящие из системы в результате одного цикла работы.

• Трубки, соединяющие все компоненты системы между собой; трубки состоят из медицинского силикона или аналогичного материала, обладают гладкой внутренней поверхностью. Трубки предназначены для эксплуатации при температуре до +60°С, не выделяют в жидкие среды цитотоксические соединения. Трубки обеспечивают скорость потока жидкости в диапазоне от 0,01 мкл/мин до 100 мл/мин. Внутренний диаметр трубок варьирует в зависимости от заданных параметров системы и составляет от 0,1 мм до 100 мм. Толщина стенок составляет от 0,01 мм до 100 мм.

Изобретение поясняется чертежом, где на ФИГ. 1 представлена общая схема, иллюстрирующая идею заявляемого изобретения, на ФИГ. 2 представлена схема реализации системы, на ФИГ. 3 представлена схема микрогидродинамического устройства, на ФИГ. 4 представлена схема поперечного сечения. На ФИГ. 2, при описании используются следующие обозначения: 1 - емкость для промывочного буфера; 2 - емкость для спермы; 3 - трубка, соединяющая емкость для промывочного раствора с системой; 4 - трубка, соединяющая емкость со спермой с системой; 5 - насос, в данном случае - перистальтический; 6 - микрогидродинамическое устройство; 7 - трубка, соединяющая выпускное отверстие для целевой фракции с блоком регистрации; 8 - трубка, соединяющая целевое отверстие для фракции отходов (мусорной), содержащей сперматозоиды, с емкостью для слива отработанной жидкости; 9 - блок регистрации; 10 - емкость для слива отработанной жидкости. На ФИГ. 3, при описании микрогидродинамического устройства, используются следующие обозначения: 11 - объемный элемент, 12 - объемный элемент, 13 - область плотного соединения двух объемных элементов, 14 - криволинейный инерционный канал, углубленный на поверхности объемного элемента под номером 11, 15 - впускное отверстие, 16 - два выпускных отверстия. На ФИГ. 4, при описании используются следующие обозначения: невыпуклый пятиугольник, который представляет собой сечение микроканала, обозначен по вершинам углов как ABCDE, сторона АЕ соответствует ширине канала, сторона АВ соответствует большей высоте канала, сторона ED соответствует меньшей высоте канала, стороны ВС и CD формируют угол С.

Ключевым элементом системы является микрогидродинамическое устройство (ФИГ. 2 под цифрой 6, ФИГ. 3). Устройство состоит из двух объемных элементов (11 и 12), изготовленных (отлитых по форме) из полимера. Объемный элемент 11 представляет собой плоскую деталь. Объемный элемент 12, аналогичный по габаритам, содержит внутри себя углубление в виде микроканала. При совмещении двух деталей (спайкой, склеиванием, сплавлением или иным способом) образуется сечение канала. Канал является криволинейным, в нем образуется инерционный поток жидкости. Дистальный конец канала разделяется на два. Также в устройстве имеется одно впускное отверстие в начале канала и два выпускных отверстия в дистальном конце канала. Объемные элементы микрогидродинамического устройства могут быть изготовлены с применением способов литья, формовки, микрофрезеровки, фотолитографии, микроперфорации. Детали могут быть соединены между собой склейкой, сплавлением, точечным нагревом, кислородно-плазменной резкой или любым иным способом.

В канале за счет принципов инерционной микрогидродинамики в процессе прохождения жидкости по каналу происходит разделение единого потока разнородных компонентов спермы по размеру на два: более крупные элементы концентрируются у внутренней стенки канала, более мелкие - у внешней; шаг разделения фракций составляет 13 мкм. Соответственно, выпускное отверстие, через которые выходит фракция более крупных целевых клеток, соединено трубкой с блоком регистрации (далее - внутреннее отверстие); второе выпускное отверстие, через которое из канала выходят сперматозоиды и прочие мелкие клеточные элементы и частицы (мусорная фракция) - в емкость для отработанной жидкости (далее - внешнее отверстие).

Система соединена трубками, согласно схеме, изображенной на ФИГ 2. Перед началом работы осуществляется предварительная пробоподготовка образца спермы, а также подготовка промывочного раствора. Обе жидкости размещаются в соответствующих емкостях. Настраиваются параметры системы, при необходимости, подключаются трубки. Способ применения системы заключается в последовательном прокачивания по трубкам жидкостей из емкостей: сперва прокачивается жидкость из емкости с промывочным раствором, осуществляя предварительное промывание системы и подготовку ее к работе; Промывочный раствор выходит из емкости, протекает по трубкам через микрогидродинамическое устройство, блок регистрации и попадает в емкость для отработанной жидкости; скорость потока при этом составляет от 0,05 мкл/мин до 25 мл/мин, в зависимости от прочих параметров системы. Затем через систему прокачивается образец спермы, со скоростью от 0,01 мкл/мин до 100 мл/мин, в зависимости от параметров системы. Клеточные компоненты спермы при этом распределяются в инерционном канале на две фракции; жидкость, содержащая целевую фракцию, выходит из внутреннего выпускного отверстия, и далее по трубке поступает в блок регистрации, где оцениваются параметры клеточных элементов, а затем - в отдельную емкость для хранения, не включенную в систему. Также способ применения системы может включать в себя сохранение фракции сперматозоидов для последующих манипуляций; в таком случае, предусмотрен вариант применения в виде сбора этой фракции в отдельную емкость.

Краткое описание чертежей

Изобретение поясняется следующими фигурами, на которых изображено:

На ФИГ. 1 схематично отображен рабочий процесс выделения клеток РПЖ из семенной жидкости. Сперва происходит забор образца спермы у пациента или у здорового добровольца. Образец транспортируется в стерильном контейнере для биоматериалов. Далее образец обрабатывается с помощью описываемого изобретения, на выходе из системы образуется две фракции компонентов спермы, целевая и мусорная.

На ФИГ. 2 приведена схема системы. Обозначение ключевых элементов: 1) емкость для промывочного буфера; 2) емкость для спермы; 3) трубка, соединяющая емкость для промывочного раствора с системой; 4) трубка, соединяющая емкость со спермой с системой; 5) Насос, в данном случае - перистальтический; 6) трубка, соединяющая насос с микрогидродинамическим устройством; 7) микрогидродинамическое устройство; 7) трубка, соединяющая выпускное отверстие для целевой фракции с блоком регистрации; 8) трубка, соединяющая целевое отверстие для фракции отходов (мусорной), содержащей сперматозоиды, с емкостью для слива отработанной жидкости; 9) блок регистрации; 10) емкость для слива отработанной жидкости.

На ФИГ. 3 изображена схема микрогидродинамического устройства, обозначенного ранее на ФИГ. 2 под цифрой 6. Устройство состоит из двух объемных элементов, обозначенных цифрами 11 и 12. Оба элемента отлиты из полимера по форме. Элементы прочно соединены между собой, область стыка обозначена цифрой 13. Элемент 11 содержит углубление в виде криволинейного инерционного канала, обозначенного цифрой 14. Элемент 12 обладает плоской поверхностью, также в нем выполнены впускное отверстие в начале канала (обозначенное цифрой 15) и два выпускных отверстия в области разветвления канала (обозначены цифрой 16).

На ФИГ. 4 представлен чертеж сечения канала, представляющего невыпуклый пятиугольник ABCDE, где диагональ BD лежит вне пятиугольника.

На ФИГ. 5 продемонстрирован вариант реализации криволинейного инерционного канала.

На ФИГ. 6 представлено позиционирование частиц в канале, а именно клеточных компонентов спермы, в начале криволинейного инерционного канала (в левой части фигуры) и в дистальном конце канала (в правой части фигуры).

На ФИГ. 7 представлены возможные соотношения сторон ВС и CD.

На ФИГ. 8 представлен пример реализации изобретения. Графики демонстрируют эффективность заявляемого изобретения в пилотном эксперименте, описанном в Примере 1.

На ФИГ. 9 и ФИГ. 10 продемонстрированы изображения фракции клеток, полученные с помощью заявляемой системы и способа ее применения. Изображения получены с помощью световой микроскопии; фракции были нанесены на камеру для подсчета клеток с разметкой в виде сетки. Фракция, полученная на выходе из выпускного отверстия для мусорной фракции (или мусорной фракции) (ФИГ. 9) и фракция, полученная из выпускного отверстия для фракции целевых клеток (ФИГ. 10).

На ФИГ. 11 и ФИГ. 12 показаны фотографии опухолевых клеток, выделенных с помощью заявляемого изобретения. Фотографии получены посредством лазерного сканирующего микроскопа Zeiss LSM 880. Для получения изображения клетки были помечены флуоресцентными метками посредством флуоресцентной прямой иммуноцитохимии.

На ФИГ. 13 и ФИГ. 14 показаны графики, отображающие статистические данные, иллюстрирующие примеры применения заявляемого изобретения в диагностике и прогнозировании опухолевых заболеваний мужской репродуктивной системы.

В Таблице 1 перечислен примеры клинических данных пациентов с РПЖ, принимавших участие в пилотном эксперименте по тестированию описываемого изобретения.

Осуществление изобретения

На ФИГ. 1 схематично показан процесс выявления опухолевых клеток из семенной жидкости пациентов с РПЖ с помощью инерционной микрогидродинамики. Как показано на ФИГ. 1, сначала у пациента берут образец спермы. Образец спермы изначально густой и вязкий. Вязкость спермы колеблется от +1 до +4; поэтому вязкость может быть приблизительно +1, приблизительно +2, приблизительно +3 или приблизительно +4. Такая вязкость приводит к появлению неньютоновских свойств. Перед использованием образец спермы может быть разжижен с применением термической обработки, либо с применением химических соединений или ферментов, в том числе протеолитических, а также любой комбинацией из этих вариантов. Разжижение может занять время от 5 до 120 минут; таким образом, оно может завершиться примерно за 5, примерно за 10, примерно за 20, примерно за 30, примерно за 40, примерно за 50, примерно за 60, примерно за 70, примерно за 80, примерно за 90, примерно за 100, примерно за 110 или примерно за 120 минут. РН спермы может варьировать от 6,8 до 8,2; таким образом, его значение может составлять приблизительно 6,8, приблизительно 6,9, приблизительно 7,0, приблизительно 7,1, приблизительно 7,2, приблизительно 7,3, приблизительно 7,4, приблизительно 7,5, приблизительно 7,6, приблизительно 7,7, приблизительно 7,8, приблизительно 7,9, приблизительно 8,0, приблизительно 8,1 или приблизительно 8,2. Также может осуществляться иная пробоподготовка образца, такая, как отстаивание, центрифугирование, разбавление, замена жидкой части на другую жидкость. После этого образец спермы вводят в емкость для спермы, обозначенную на ФИГ. 2 цифрой 2.

Предварительная пробоподготовка также включает подготовку промывочного раствора, который может представлять собой как буфер с различными добавками, такими, как альбумин, ЭДТА и консерванты, так и дезинфицирующие растворы, такие, как водные растворы гипохлорита натрия, этилового спирта или других аналогичных соединений. Раствор помещается в емкость, обозначенную на ФИГ. 2 цифрой 1, и пропускается через систему насосом с заданной скоростью, которая устанавливается в зависимости от объема раствора и параметров системы. Значение скорости может варьировать от 0,05 мкл/мин до 100 мл/мин, и равняться любому значению в данном диапазоне. Функции данного этапа заключаются в очистке внутренних поверхностей компонентов системы от возможных загрязнений, пыли и прочих микрочастиц, дезинфицировании внутренних поверхностей, удалений следов прошлых циклов работы, а также в смачивании стенок для обеспечения желаемых свойств потока в криволинейном инерционном микрогидродинамическом канале. Важно отметить, что при запуске в первую очередь осуществляется промывка системы, затем подача образца, а после завершения работы с образцом осуществляется еще одна промывка системы.

Прокачивание жидкостей осуществляется с помощью следующего элемента системы - как минимум одного насоса. Может быть использован как перистальтический насос с шаговым двигателем, так и любой иной насос, подходящий для решаемой задачи, а именно точного перекачивания малых объемов жидкостей с заданной скоростью, например, шприцевой насос или инфузомат. В таком случае схема системы может быть дополнена необходимыми элементами, такими, как шприцы. При необходимости система может комплектоваться более чем одним насосом. Параметры насоса должны обеспечивать прохождение образца спермы непрерывным потоком через систему с заданной скоростью, при этом должна быть возможность регулирования и настройки скорости. Скорость устанавливается в диапазоне от 0,01 мкл/мин до 500 мл/мин. Соответственно, время обработки образца спермы заявляемой системой может составлять от 3 минут до 190 минут, и зависит как от вышеописанных параметров, так и от объема образца. Элемент системы обозначен на ФИГ. 2 цифрой 5.

Ключевым элементом системы будет являться микрогидродинамическое устройство с инерционной фокусировкой частиц в потоке жидкости (ФИГ. 2 под цифрой 6, ФИГ. 3). Устройство состоит из двух объемных элементов (ФИГ. 3 под цифрами 11 и 12), изготовленных (отлитых по форме) из полимера. Объемный элемент 12 представляет собой плоскую деталь. Объемный элемент 11, аналогичный по габаритам, содержит внутри себя углубление в виде микроканала (ФИГ. 3, под цифрой 14). При совмещении двух деталей (спайкой, склеиванием, сплавлением или иным способом) образуется форма сечения канала, зона соединения объемных элементов обозначена на ФИГ. 3 под цифрой 13. Криволиненый канал обеспечивает инерцию потока. Поперечное сечение канала представляет собой невыпуклый пятиугольник ABCDE, где диагональ BD лежит вне пятиугольника; углы между сторонами АВ и АЕ и сторонами ED и АЕ равны 90 градусам, а угол между сторонами ВС и CD лежит в интервале 125-150 градусов; при этом сторона АВ больше стороны ED (на ФИГ. 4).

Принцип решения поставленной задачи основан на разделении клеточных компонентов спермы на фракции по размеру; при этом во фракции более крупных клеток могут присутствовать опухолевые клетки, присутствующие в сперме пациентов со злокачественными новообразованиями. Схематическая иллюстрация сечения инерционного канала с позиционированием частиц представлена на ФИГ. 5. После введения в систему образец по трубке поступает в микрогидродинамическое устройство через по меньшей мере одно впускное отверстие (ФИГ. 3, под цифрой 15), затем проходит по петлям инерционного канала, в результате чего разделяется на две жидкие фракции, которые выходят через по меньшей мере два выпускных отверстия (ФИГ. 3, под цифрой 16). Одна из фракций, называемая также мусорной, может быть практически не обеднена сперматозоидами и содержать не менее 90% сперматозоидов, присутствующих в исходном образце. Другая фракция, называемая целевой, может содержать не менее 80% эпителиальных клеток, среди которых могут присутствовать и опухолевые клетки, присутствующих в исходном образце, а также может содержать остаточные сперматозоиды.

Частицы на входе в микроканал случайным образом распределялись в поперечном сечении канала. После прохождения семенной жидкости по каналу необходимой длины для инерционной фокусировки опухолевые клетки концентрируются с одной стороны просвета канала вблизи меньшей высоты канала, в то время как сперматозоиды, прочие твердые частицы, эритроциты или другие клетки концентрируются на другой стороне. В зависимости от полосы фокусировки опухолевых клеток регулируют точку раздвоения, расположенную у выходного отверстия канала. В одном из вариантов осуществления изобретения точка раздвоения находится ближе к полосе фокусирования опухолевых клеток, тогда чистота образца (т.е. эффективность удаления сперматозоидов, мусорных частиц, прочих мелких клеток) повышается ценой потери некоторых мелких целевых клеток. В другом варианте осуществления изобретения точка раздвоения перемещена дальше от полосы фокусирования, что увеличивает вероятность сбора всех целевых клетки повышает вероятность обнаружения опухолевых клеток в выделенной фракции эпителиальных клеток, хотя некоторые прочие твердые частицы или другие типы клеток также могут попадать в данную фракцию. Возможные варианты соотношения сторон ВС и CD проиллюстрированы на ФИГ. 6.

Физические основы работы заявляемого изобретения базируются на инерционной микрогидродинамике. В прямых каналах на клетки и частицы воздействуют две различные подъемные силы: сила, обусловленная градиентом сдвига и сила, обусловленная стенкой. Обе силы являются компонентами инерционной подъемной силы. Обусловленная градиентом сдвига подъемная сила толкает частицы к стенке, в то время как обусловленная стенкой подъемная сила отталкивает частицы от стенки. Взаимодействие этих двух сил определяет равновесное положение частицы в канале. Уравнение 1 описывает инерционную подъемную силу:

В уравнении 1 ρ - плотность, а - диаметр частицы, D_h - гидравлический диаметр канала, U_max - максимальная линейная скорость движения образца, C_L - безразмерный коэффициент подъемной силы. D_h может быть рассчитано как 4А/Р, где А - площадь поперечного сечения канала, а Р - смоченный периметр поперечного сечения канала.

В непрямых каналах, однако, на частицы воздействует другая сила, оказывающая дополнительное влияние на их положение. В частности, в спиральных микроканалах эта сила может быть приблизительно описана уравнением 2:

В уравнении 2 μ - вязкость, a De - число Дина. De может быть рассчитано по уравнению 3:

Исходя из уравнения (1) и (2), F_L ∝ а⁴ и F_D ∝ а. Поэтому разные по размеру клетки занимают разные позиции фокусировки в микроканале и могут быть собраны из соответствующих выходных отверстий.

По меньшей мере один из описанных далее вариантов осуществления изобретения был использован при разработке ключевого элемента системы, а именно микрогидродинамического устройства. Форма канала должна обеспечивать инерционный поток жидкости и соответствовать описываемым выше физическим законам.

С учетом вышеуказанного, основание канала, обозначенное на ФИГ. 4 как сторона АЕ пятиугольника ABCDE, может варьировать в диапазоне от 20 мкм до 5 мм. Таким образом, ширина основания канала может составлять 20 мкм, 30 мкм, 40 мкм, 50 мкм, 75 мкм, 100 мкм, 125 мкм, 150 мкм, 175 мкм, 200 мкм, 250 мкм, 300 мкм, 400 мкм, 500 мкм, 600 мкм, 700 мкм, 800 мкм,900 мкм, 1 мм, 1,25 мм, 1,5 мм, 1,75 мм, 2 мм, 2,5 мм, 3 мм, 3,5 мм, 4 мм, 4,5 мм или 5 мм.

С учетом вышеуказанного, большая высота канала, обозначенная на ФИГ. 4 как сторона АВ пятиугольника ABCDE, может варьировать в пределах от 20 мкм до 1 мм. Таким образом, она может составлять 20 мкм, 30 мкм, 40 мкм, 50 мкм, 60 мкм, 70 мкм, 80 мкм, 90 мкм, 100 мкм, 125 мкм, 150 мкм, 175 мкм, 200 мкм, 250 мкм, 300 мкм, 350 мкм, 400 мкм, 450 мкм, 500 мкм, 550 мкм, 600 мкм, 700 мкм, 800 мкм, 900 мкм или 1 мм.

С учетом вышеуказанного варианта осуществления изобретения, меньшая высота канала, обозначенная на ФИГ. 4 как сторона ED пятиугольника ABCDE, может варьировать в диапазоне от 10 мкм до 600 мкм. Таким образом, она может составлять 10 мкм, 20 мкм, 30 мкм, 40 мкм, 50 мкм, 60 мкм, 70 мкм, 80 мкм, 90 мкм, 100 мкм, 125 мкм, 150 мкм, 175 мкм, 200 мкм, 250 мкм, 300 мкм, 350 мкм, 400 мкм, 450 мкм, 500 мкм, 550 мкм или 600 мкм.

С учетом вышеуказанного варианта осуществления изобретения точка раздвоения дистального конца канала может находиться на уровне от 5% до 95% ширины канала. Таким образом, она может находиться на уровне приблизительно 5%, приблизительно 10%, приблизительно 20%, приблизительно 30%, приблизительно 40%, приблизительно 50%, приблизительно 60%, приблизительно 70%, приблизительно 75%, приблизительно 80%, приблизительно 85%, приблизительно 90% или приблизительно 95% от ширины канала. Некоторые варианты реализации продемонстрированы на ФИГ. 6.

В некоторых вариантах осуществления изобретения диаметр спирального инерционного микрогидродинамического канала может быть отрегулирован для достижения числа Дина примерно от 1 до 10, так что длина спирали может быть равна или больше 3, 5,7,9,11,13 или 15 см. Соотношение сторон канала, отношение средней высоты к ширине может находиться в диапазоне от 0,1 до 1. Таким образом, оно может составлять приблизительно 0,11, 0,2, 0,4, 0,5, 0,65, 0,8 или 1.

Углы между сторонами АВ и АЕ, а также между сторонами АЕ и ED равны 90 градусам. Значение угла между сторонами ВС и CD лежит в интервале 125-150 градусов, и может быть равно любому значению из этого интервала.

В заявляемой системе для выделения клеток рака предстательной железы из спермы были использованы следующие параметры поперечного сечения: ширина АЕ 650 мкм, высота АВ 140 мкм, высота ED 100 мкм, в спиральном микроканале с 8 петлями. Угол между сторонами ВС и CD приблизительно равен 132 градусам. Сечение канала и его форма, а также функции проиллюстрированы на ФИГ. 4, ФИГ. 5, ФИГ 6, ФИГ. 7.

Фракции, которые выходят через выпускные отверстия микрогидродинамической системы, могут быть повторно обработаны через микрогидродинамическую систему один или несколько раз для дополнительной очистки. Микроскопическая картина жидкости, выходящей из выпускных отверстий микрогидродинамической системы для отходов и целевых клеток, представлена на ФИГ. 10 и ФИГ. 11. Целевые клетки, прочие твердые частицы, сперматозоиды и мертвые клетки обозначены стрелками. Заявляемая система обеспечивает выделение целевых клеток с минимальным повреждением опухолевых клеток, эпителиальных клеток или других компонентов спермы. Таким образом, выделенные опухолевые клетки могут быть исследованы морфологически или с помощью таких способов, как иммуноцитохимия, полимеразная цепная реакция, иммунофлюоресценция, иммуноферментный анализ, секвенирование генома, проточная цитометрия, а также быть подвергнуты дополнительному фракционированию или сортингу с других устройств для клеточного сортинга. Кроме того, поскольку обычные компоненты спермы также остаются интактными, микрогидродинамическая система может быть также использована для очистки спермы от прочих крупных видов клеток, включающих эпителиальные или опухолевые клетки, для последующего сохранения. В одном из вариантов осуществления изобретения способ применения устройства включал обработку полученной целевой фракции клеток с помощью иммуноцитохимии с применением антител к антигенам рака предстательной железы, а также ядерного красителя, позволяющего определить клеточное ядро. Таким образом, среди прочих клеток целевой фракции были выделены клетки, отнесенные к диссеминирующим клеткам рака предстательной железы. Мечение антителами может производиться как до помещения образца в систему, так и после.

На ФИГ. 2 под цифрой 9 обозначен следующий элемент системы, блок регистрации. В данный элемент может поступать целевая фракция клеток из микрогидродинамического устройства. Выпускное отверстие, предназначенное для выхода целевой фракции, соединено трубкой с блоком регистрации. В одном из вариантов реализации изобретения, из цельной спермы выделялась клеточная суспензия, метилась специфическими антителами, затем суспензия загружалась в систему, после чего проводился анализ меченной фракции в блоке регистрации.

Отработанные в системе растворы, а также мусорная фракция образца, попадают в сливную емкость, обозначенную на ФИГ. 2 под цифрой 10. В емкость погружается трубка, соединенная с выпускным отверстием микрогидродинамического устройства, предназначенным для мусорной фракции. Емкость состоит из инертного полимера медицинского назначения или стекла и имеет объем не менее 500 мл. Материал емкости также должен быть совместим со всеми реагентами, применяемыми в составе жидкостей, попадающих в систему.

Непрерывное протекание потока жидкости (образца спермы или иной) по системе обеспечивается трубками, соединяющими все компоненты системы между собой. Трубки состоят из медицинского полимера или аналогичного материала, обладают гладкой внутренней поверхностью. Трубки предназначены для эксплуатации при температуре до +60°С, не выделяют в жидкие среды цитотоксические соединения. Трубки обеспечивают скорость потока жидкости в диапазоне от 0,01 мкл/мин до 100 мл/мин. Внутренний диаметр трубок варьирует в зависимости от заданных параметров системы и составляет от 0,1 мм до 100 мм. Толщина стенок составляет от 0,01 мм до 100 мм. Некоторые участки трубок обозначены на ФИГ. 2 под цифрами 3, 4, 7, 8.

Примеры реализации изобретения

Пример 1. Пилотные испытания со спермой здорового человека, в которую были добавлены опухолевые клетки рака предстательной железы линейных иммортализованных культур аденокарциномы предстательной железы DU-145, С3 и LNCAP, показали, что указанные параметры микроканала позволяют выделить более 80% клеток рака предстательной железы и отделить более 95% сперматозоидов, присутствующих в исходном образце, после выполнения одного цикла обработки образца спермы через микрогидродинамическую систему (ФИГ. 9).

Пример 2. В соответствии с одним вариантом осуществления изобретения были собраны образцы спермы 11 пациентов с диагностированным РПЖ на локализованной стадии и 11 здоровых добровольцев в возрасте до 30 лет. Выделенные предполагаемые опухолевые клетки считались ДОК, если они были размером >12 мкм, имели высокое соотношение размеров ядра и цитоплазмы или множественные ядра, а также были положительными по четырем антигенам: CK (CK+), PSMA (PSMA+) и GPC-1 (GPC-1+). Так, ДОК были обнаружены в образцах спермы 11 из И пациентов (100%), причем количество варьировало от 63 до 460 клеток, что изложено в Таблице 1. В то же время, в случае здоровых доноров клетки, экспрессирующие CK, PSMA и GPC-1, были выявлены в 2 из 11 образцов (27%), при этом было выявлено 3 и 7 клеток соответственно. Также наблюдалась значительная гетерогенность ДОК по экспрессии антигенов, что продемонстрировано на фотографиях на ФИГ. 12 и ФИГ. 13.

Пример 3. Для оценки потенциальной диагностической и прогностической применимости разработанного способа определена корреляция между количеством выделенных с помощью заявляемого изобретения ДОК и традиционными диагностическими/прогностическими показателями, представленными в таблице 1. Так, оценивали корреляцию между количеством ДОК (PSMA+, CK+, GPC1+ клеток) на мл спермы (n/V) и уровнем сывороточного ПСА (PSA) или баллом по шкале Глисона (GS) (ФИГ. 14 и ФИГ. 15). Так, значение r для взаимосвязи n/V с уровнем ПСА в сыворотке крови и n/V с оценкой по ШГ составило 0,48 и 0,68 соответственно.

Источники информации

1. Razavi Bazaz, S., et al., Computational inertial microfluidics: a review. Lab Chip, 2020. 20(6): p.1023-1048.

2. Zhang, J., et al., Fundamentals and applications of inertial microfluidics: a review. Lab Chip, 2016. 16(1): p.10-34.

3. Di Carlo, D., Inertial microfluidics. Lab Chip, 2009. 9(21): p.3038-46.

4. Warkiani, M.E., et al., Slanted spiral microfluidics for the ultra-fast, label-free isolation of circulating tumor cells. Lab Chip, 2014. 14(1): p.128-37.

5. Kulasinghe, A., et al., The prognostic significance of circulating tumor cells in head and neck and non-small-cell lung cancer. Cancer Med, 2018. 7(12): p.5910-5919.

6. Khoo, B.L., et al., Clinical validation of an ultra high-throughput spiral microfluidics for the detection and enrichment of viable circulating tumor cells. PLoS One, 2014. 9(7): p.e99409.

7. Kulasinghe, A., et al., Enrichment of circulating head and neck tumour cells using spiral microfluidic technology. Sci Rep, 2017. 7: p.42517.

8. Rzhevskiy, A.S., et al., Rapid and Label-Free Isolation of Tumour Cells from the Urine of Patients with Localised Prostate Cancer Using Inertial Microfluidics. Cancers (Basel), 2019. 12(1).

9. Broncy, L. and P. Paterlini-Brechot, Clinical Impact of Circulating Tumor Cells in Patients with Localized Prostate Cancer. Cells, 2019. 8(7).

10. Sharifi, R., et al., Evaluation of cytologic techniques for diagnosis of prostate cancer. Urology, 1983. 21(4): p.417-20.

11. Nickens, K.P., et al., Prostate cancer marker panel with single cell sensitivity in urine. Prostate, 2015. 75(9): p.969-75.

12. Gardiner, R.A., et al., Abnormal prostatic cells in ejaculates from men with prostatic cancer-a preliminary report. Br J Urol, 1996. 78(3): p.414-8.

13. Barren III, R.J., et al., Method for identifying prostate cells in semen using flow cytometry. 1998. 36(3): p.181-188.

14. Kulasinghe, A., et al., The Use of Microfluidic Technology for Cancer Applications and Liquid Biopsy. Micromachines (Basel), 2018. 9(8).

15. Warkiani, M.E., et al., Ultra-fast, label-free isolation of circulating tumor cells from blood using spiral microfluidics. Nat Protoc, 2016. 11(1): p.134-48.

16. Allen, M.J., E.M. Bradbury, and R. Balhorn, The natural subcellular surface structure of the bovine sperm cell. J Struct Biol, 1995. 114(3): p.197-208.

17. Foxcroft, G.R., et al., Identifying useable semen. Theriogenology, 2008. 70(8): p.1324-36.

Группа изобретений относится к анализу жидких биологических материалов. Раскрыта система для выделения опухолевых клеток из спермы, состоящая из емкости для промывочного буфера, емкости для спермы, насоса, микрогидродинамического устройства, блока регистрации целевой фракции и емкости для слива отработанной жидкости, причем все элементы и блоки соединены между собой трубками; при этом микрогидродинамическое устройство содержит внутри себя первичный криволинейный инерционный микрогидродинамический канал, имеющий спиральную конфигурацию, поперечное сечение которого имеет форму невыпуклого пятиугольника, предназначенный для разделения клеток спермы на две фракции по размеру, разделяющийся на два вторичных криволинейных инерционных канала на дистальном конце, одно впускное отверстие, предназначенное для подачи спермы пациента, два выпускных отверстия для выведения с потоком жидкости выделенную более крупную фракцию клеток через одно из двух выпускных отверстий, и выведение сперматозоидов через одно из двух выпускных отверстий. Также раскрыт способ реализации указанной системы. Группа изобретений обеспечивает эффективное отделение фракции крупных эпителиальных клеток от фракции мелких сперматозоидов в сперме. 2 н. и 14 з.п. ф-лы, 15 ил., 1 табл., 3 пр.

1. Система для выделения опухолевых клеток из спермы, состоящая из емкости для промывочного буфера, емкости для спермы, насоса, микрогидродинамического устройства, блока регистрации целевой фракции и емкости для слива отработанной жидкостей, причем все элементы и блоки соединены между собой трубками; при этом содержит емкость для промывочного буфера, обеспечивающего предварительную и заключительную очистку системы, емкость для жидкого биологического образца, из которой обеспечивается подача образца в систему, насос, обеспечивающий прокачивание жидкого биологического образца через систему, микрогидродинамическое устройство, содержащее внутри себя первичный криволинейный инерционный микрогидродинамический канал, имеющий спиральную конфигурацию, поперечное сечение которого имеет форму невыпуклого пятиугольника, предназначенный для разделения клеток спермы на две фракции по размеру, разделяющийся на два вторичных криволинейных инерционных канала на дистальном конце, одно впускное отверстие, предназначенное для подачи спермы пациента, два выпускных отверстия для выведения с потоком жидкости выделенную более крупную фракцию клеток через одно из двух выпускных отверстий, и выведение сперматозоидов через одно из двух выпускных отверстий, блок регистрации, обеспечивающий анализ параметров клеток целевой фракции, емкость, вмещающая отработанные в системе растворы и биологические жидкости; поток жидкости через систему обеспечивается при помощи трубок, непрерывно соединяющих между собой все элементы системы.

2. Система по п. 1, характеризующаяся тем, что способствует отделению сперматозоидов от опухолевых клеток в поступающей клеточной суспензии, включающей сперматозоиды, опухолевые клетки, клетки крови, эпителиальные клетки, тромбоциты, частицы пыли и остатки разрушенных клеток, где движение клеточной суспензии в криволинейном микроканале обеспечивает разделение компонентов клеточной суспензии на основе размера на две или более жидкостных фракции такого размера, что каждый компонент получает свою фракцию равного или разного объема и равную или разную долю компонентов в клеточной суспензии.

3. Система по п. 1, характеризующаяся тем, что первичный криволинейный микроканал имеет спиральную конфигурацию и одно впускное отверстие, предназначенное для приема клеточной суспензии или цельной разжиженной спермы.

4. Система по п. 1, характеризующаяся тем, что первичный криволинейный микроканал со спиральной конфигурацией включает в себя по меньшей мере 3 петли с 1 раздвоением на два вторичных криволинейных микроканала.

5. Система по любому из пп. 1-4, характеризующаяся тем, что ключевой элемент представляет собой микрогидродинамическое устройство, сконструированное для приема непрерывного потока клеточной суспензии через одно впускное отверстие и для обеспечения отделения опухолевых клеток и (или) сперматозоидов от других компонентов, присутствующих в сперме, при непрерывном потоке; опухолевые клетки, присутствующие в клеточной суспензии, могут происходить из любого органа или жидкости, участвующих в образовании человеческой спермы, таких как предстательная железа, яички, придаток яичка, семенные пузырьки, бульбоуретральная железа и кровь, при этом конфигурация системы подразумевает, что опухолевые клетки выпускаются через одно выпускное отверстие микрогидродинамического устройства и далее проходят через блок регистрации для учета параметров, а большинство других клеток, присутствующих в сперме, включая сперматозоиды, выпускаются через еще одно выпускное отверстие; сперма, используемая для получения клеточных суспензий, может быть приготовлена с использованием чистого жидкого образца спермы или может быть специально подготовлена перед исследованием путем нагрева, отстаивания, разбавления исходного образца спермы, центрифугирования и последующего ресуспендирования образца спермы для получения концентрированной клеточной суспензии, или добавления реологических модификаторов к исходному образцу спермы, или комбинации вышеперечисленных процедур.

6. Система по любому из пп. 1-5, имеющая поперечное сечение криволинейного инерционного микрогидродинамического канала в форме невыпуклого пятиугольника ABCDE, где диагональ BD лежит вне многоугольника, с шириной основания от 50 до 1000 мкм, предпочтительно от 300 до 600 мкм, меньшей высотой от 20 до 150 мкм, предпочтительно 30 или 100 мкм, и большей высотой от 70 до 200 мкм, предпочтительно 90 или 140 мкм, с количеством петель от 3 до 15, предпочтительно от 5 до 8, начиная от внешних петель к внутренним с общей длиной канала от 25 до 75 см, предпочтительно 40-50 см, углами между сторонами АВ и АЕ и сторонами ED и АЕ, равными 90 градусам, углом между сторонами ВС и CD, лежащем в интервале 125-150 градусов, предпочтительно 130-135 градусов.

7. Система по любому из пп. 1-6, в которой имеются два выпускных отверстия, расположенных на дистальном конце криволинейного канала, в центре микрогидродинамического устройства.

8. Система по любому из пп. 1-7, в которой один криволинейный микроканал микрогидродинамического устройства предназначен для отделения опухолевых клеток от других клеток, присутствующих в сперме, путем фокусировки опухолевых клеток у одной из стенок криволинейного микроканала, что обеспечивает отделение опухолевых клеток от других клеток, присутствующих в сперме, при этом опухолевые клетки выпускаются из микроканала через отдельные выпускные отверстия с выделением потока жидкости в виде двух жидких фракций.

9. Система по любому из пп. 1-8, в которой одна жидкая фракция, выпущенная из одного выпускного отверстия вторичного канала микрогидродинамического устройства, содержит сперматозоиды в концентрации 90-99% сперматозоидов, присутствующих в образце, полученном через одно впускное отверстие.

10. Способ реализации системы для выделения опухолевых клеток из спермы по любому из пп. 1-9, включающий подачу буфера или иного реагента для предварительной подготовки системы из емкости в систему через одно впускное отверстие системы для выделения опухолевых клеток и сперматозоидов; подачу суспензии клеток, полученных из спермы пациента, либо спермы пациента, через одно впускное отверстие системы для выделения опухолевых клеток и сперматозоидов; выделение опухолевых клеток и сперматозоидов на основе разницы в размере и плотности клеток, представленных в клеточной суспензии, разделяемых на различные жидкостные фракции в месте одного раздвоения одного криволинейного микроканала; выведение с потоком жидкости выделенной более крупной фракции клеток через одно отдельное выпускное отверстие из двух выпускных отверстий и выведение сперматозоидов через одно другое отдельное выпускное отверстие из двух выпускных отверстий; подачу выделенной целевой фракции более крупных клеток в блок регистрации; подачу отработанной в системе жидкости в емкость со сливом.

11. Способ по п. 10, характеризующийся тем, что вторичные микроканалы могут иметь криволинейную форму и соединены с первичным микроканалом для потока жидкости, при этом как первичный, так и вторичные микроканалы могут иметь форму поперечного сечения в виде невыпуклого пятиугольника.

12. Способ по п. 10, характеризующийся тем, что опухолевые клетки выделяются в одном криволинейном микроканале под действием гидродинамических сил, включая инерционные подъемные силы и силы сопротивления Дина, а баланс этих двух сил напрямую коррелирует с диаметром клеток и частиц, и он же обеспечивает фокусировку частиц в различных равновесных положениях.

13. Способ по п. 10, характеризующийся тем, что состоит в отделении опухолевых клеток и сперматозоидов от других клеток, присутствующих в клеточной суспензии, полученной из спермы, в первую очередь сперматозоидов, путем фокусировки опухолевых клеток с одной стороны просвета одного криволинейного микроканала и фокусировки сперматозоидов с другой стороны просвета одного криволинейного микроканала.

14. Способ по п. 10, характеризующийся тем, что включает отделение опухолевых клеток и/или сперматозоидов от любых других компонентов клеточной суспензии, полученной из спермы, таких как лейкоциты, эритроциты, эпителиальные клетки, остатки разрушенных клеток, частицы пыли или тромбоциты.

15. Способ по п. 10, характеризующийся тем, что одна жидкая фракция, полученная через одно выпускное отверстие, содержит сперматозоиды в концентрации 90-99% сперматозоидов, присутствующих в исходной клеточной суспензии, подаваемой через одно впускное отверстие.

16. Способ по п. 10, характеризующийся тем, что опухолевые клетки или сперматозоиды, подаваемые через одно впускное отверстие, выпускаются через два выпускных отверстия и рециркулируют через то же впускное отверстие и выпускаются через те же выпускные отверстия до пяти раз.