Способ культивирования и исследования гетерогенной культуры опухолевых клеток и устройство для его осуществления Российский патент 2025 года по МПК C12M1/00 C12N5/71 C12Q1/06 

Изобретение относится к аналитическому и медицинскому приборостроению, биоинженерии, биофизике, биохимии, молекулярной биологии, клинической биохимии и может быть использовано при исследовании жидких биологических и медицинских проб. Наиболее эффективно его использовать в диагностике заболеваний в составе миниатюрных аналитических систем (лабораторий-на-чипе).

Разработанный способ культивирования и исследования гибели гетерогенной культуры опухолевых клеток и устройство для его осуществления относятся к области исследования или анализа биологических материалов.

Достижения технологий микроэлектроники, микросистемной техники и принципы миниатюризации в инструментальном анализе открыли возможности развития нового поколения технических средств – микроаналитических систем, называемых также: μ-TAS, lab-on-a-chip (лаборатории-на-чипе), биочипы, биологические микрочипы, микрофлюидные системы и др. (Manz A. Miniaturized total chemical analysis systems: A novel concept for chemical sensing / A. Manz, N. Graber, H.M. Widmer // Sensors and Actuators. B.1. - 1990. Vol. 1, Р. 244-248; Зимина Т.М. Интегральные капиллярные сепарационные микросистемы для химического анализа / Т.М. Зимина // Петербургский журнал электроники. - 2000. № 3-4, C. 79-91). Представляя собой миниатюрные устройства, изготовленные с помощью планарных и гибридных технологий, такие системы предназначены для проведения различного рода химических и биомедицинских анализов. Они позволяют повысить производительность при осуществлении биомедицинского анализа. Разработка микроаналитических систем позволяет также решать задачи снижения стоимости, материало- и энергоемкости изделий. Эти усовершенствования возможны благодаря формированию таких устройств с помощью микро- и нанотехнологий, позволяющих реализовывать прецизионную геометрию, обеспечивающую возможность геометрической комплементарности компонентов на молекулярном уровне, повышение скорости анализа без дополнительных затрат, управление массопереносом и автоматическое регулирование в микромасштабе стадий аналитического процесса в интегрированных функциональных модулях и подсистемах. Перенос биологических объектов в таких системах может осуществляться с помощью проточного анализа, с использованием принципов микрофлюидики. Усовершенствование способов традиционного микробиологического анализа, а также микрофлюидных устройств может быть осуществлено именно с использованием технологий микро- и наноэлектроники.

Известно устройство (заявка WO № 2023159044, МПК C12Q 1/00, G16H 50/20), представляющее собой биоинженерную трехмерную модель глиобластомы мозга. В указанной модели на едином чипе сформирован гематоэнцефалический барьер, емкость для нейронов, мозговая паренхима и органоид опухоли, а внеклеточный матрикс моделируется гидрогелем на основе гиалуроновой кислоты, коллагена и желатина химически модифицированных для образования межмолекулярных связей и формирования объемной сеточной структуры. В данном устройстве опухоль мозга моделируется как органоид без участия естественного окружения, что снижает точность исследования характеристик опухоли.

Известно устройство (заявка WO № 2020252225, МПК B01L3/00, C12N5/074, G01N33/483), представляющее собой многослойную микрофлюидную систему, содержащую микрокамеры с разнообразными гелями, пути доставки лекарственных препаратов, в которую пробы клеток пациентов доставляются после сортинга и очистки и анализируются в виде гомогенных органоидов. Такой подход снижает точность анализа эффективности лекарственных препаратов.

Известно устройство (заявка US № 2022113300, МПКC12M3/06, G01N33/50), в котором изготовлена микрофлюидная система, содержащая по крайне мере три слоя, входы и выходы для жидких реагентов, микроканалы и микроемкости для культивирования клеток злокачественных опухолей определенного вида, а также для повышения селективности метода применяется параллельное культивирование различных микроорганизмов. В данном изобретении также используется очищенная культура клеток, а питание клеток проводится с помощью тангенциального квазипланарного потока. Это снижает селективность метода, в отличие от культивирования гетерогенных нативных культур.

Известно микрофлюидное устройство (патент GB № 2600648, МПК C12M3/00, C12N5/00, G01N33/50), которое содержит корпус, имеющий центральный микроканал; пористую мембрану, расположенную внутри центрального микроканала для разделения указанного микроканала на первый микроканал и второй микроканал; мембрану, имеющую верхнюю и нижнюю поверхности. При этом верхняя поверхность указанной мембраны содержит живые эпителиальные клетки и живые опухолевые клетки, контактирующие с эпителиальными клетками, а нижняя поверхность мембраны содержит живые эндотелиальные клетки. Мембрана может быть покрыта прикрепляющей молекулой, например внеклеточным матриксом, который облегчает адгезию клеток. Опухолевые клетки могут быть получены в результате биопсии. Верхняя поверхность мембраны может дополнительно содержать живые стромальные клетки. Опухолевые клетки могут контактировать с иммунными клетками, которыми могут быть лимфоциты, Т-клетки или дендритные клетки. Микрофлюидное устройство может моделировать условия, вызывающие инвазию опухоли. Кроме того, взаимодействие с иммунными клетками можно проверить, соединив первый раковый чип со вторым лимфатическим чипом.

Известно устройство (патент US № 9267938, МПК G01N33/50, G01N33/574), моделирующее динамическую множественную миелому (ММ) ex vivo в микрофлюидном устройстве, включающее трехмерную тканевую конструкцию, содержащую фрагменты костного мозга (КМ) ex vivo, которые содержат минерализованную костноподобную ткань с жизнеспособными остеобластами, самоорганизованными в сплоченные множественные клеточные слои и внеклеточный матрикс, который секретируется жизнеспособными прикрепившимися остеобластами; и микроокружение, динамически насыщенное питательными веществами и молекулами растворенного газа; и клетки миеломы человека, высеянные из композиции биообразца, содержащей мононуклеарные клетки и клетки множественной миеломы. Устройство выполнено как стеклянная подложка в виде предметного стекла 1 × 3 дюйма, на поверхность которой нанесена система столбиков, а герметизирующий слой выполнен методом 3D-литья из силикона. Недостатком данного метода является доставка питательной среды в виде сыворотки крови пациента через верхние отверстия, что не обеспечивает равномерное снабжение клеток культуры питательными веществами.

Ближайшим аналогом предлагаемых способа и устройства является патент CN № 108117988 «Establishment method and application of a tumor intravasation model based on microfluidic chip» (МПК C12M 3/00, C12N 5/071, C12Q 1/06), который относится к области техники применения технологии микрофлюидных чипов в тканевой бионике. Указанный патент защищает модель инвазии опухоли на основе микрофлюидных чипов. Изобретение раскрывает способ создания и применение модели инфильтрации опухоли на основе микрофлюидного чипа. Микрофлюидный чип содержит впускное отверстие для клеток, камеру для культивирования клеток и выпускное отверстие для отработанной жидкости, причем впускное отверстие для клеток соединено с верхней частью клеточной культуры, а выпуск отработанной жидкости соединен с нижней частью камеры клеточной культуры. Этапы технологии создания модели включают: (1) модификацию чипа, (2) инокуляцию и культивирование клеток в чипе и (3) создание модели воспалительных микрососудов головного мозга. Согласно настоящему изобретению, модель может имитировать адгезию и миграцию опухолевых клеток на поверхности эндотелиальных клеток микрососудов головного мозга и с помощью этого способа можно объединить моделирование микрососудистого поражения головного мозга в условиях воспаления и обогащение циркулирующими опухолевыми клетками.

Общим недостатком выявленных аналогов является невозможность испытания различных ингибиторов клеточной деятельности на различных пробах с идентичными свойствами и характеристиками, что уменьшает информативность исследования.

Основными недостатками прототипа способа являются:

1. Использование в качестве тестируемого объекта изолированных опухолевых клеток, что не позволяет воспроизвести микроокружение опухоли, в частности ее гетерогенность и внеклеточный матрикс. Это осложняет применение способа в формате устройства для персонализированной медицины.

2. Объектом изучения являются только адгезия и роллинг опухолевых клеток на поверхности эндотелиальных клеток, которые являются лишь одним из этапов метастазирования, тогда как для выбора эффективного противоопухолевого препарата для конкретного пациента необходимо учитывать различные аспекты лекарственной резистентности, чувствительности, скорости миграции клеток опухоли под воздействием различных ингибиторов клеточной деятельности.

Основными недостатками прототипа устройства являются:

1. Использование верхнего слоя из полидиметилсилоксана (ПДМС), который является пористым газопроницаемым материалом, что не позволяет предусмотреть возможность управления газовым составом и обеспечить герметичность системы.

2. Технология получения микрофлюидных чипов с использованием слоев из стекла и ПДМС является длительной в связи с необходимостью проведения ультрафиолетовой стерилизации поверхности слоев в течение не менее 8 ч, что осложняет массовое производство разработанных чипов.

3. Использование ряда изолированных каналов, что не позволяет проводить параллельную загрузку для анализа влияния на нее различных ингибиторов клеточной деятельности при одинаковых условиях среды.

Задачей изобретения является повышение степени полноты информативности исследования гибели культуры опухолевых клеток для целей дальнейшего выбора эффективного противоопухолевого препарата для конкретного пациента с учетом различных аспектов лекарственной резистентности, чувствительности, скорости миграции клеток опухоли под воздействием различных ингибиторов клеточной деятельности и параллельного их применения на одной пробе.

Задача решается за счет того, что в способе культивирования и исследования гибели гетерогенной культуры опухолевых клеток, при котором на основе отобранной пробы опухоли обеспечивают имитацию адгезии и миграции опухолевых клеток на поверхности сосудов и моделирование инвазии опухоли. При этом обеспечивают разделение пробы опухоли по меньшей мере на три части, к каждой части пробы добавляют питательную среду для культивирования клеток. Затем подвергают каждую часть пробы воздействию ингибитора клеточной деятельности, который добавляют в питательную среду. Далее исследуют состояние каждой части пробы с помощью выбранных методов.

Задача решается за счет того, что устройство для осуществления способа культивирования и исследования гибели гетерогенной культуры опухолевых клеток содержит камеру для культивирования клеток и выпускное отверстие для отработанной жидкости. Причем устройство представляет собой структуру из трех слоев, герметично соединенных между собой с помощью термокомпрессионного связывания (Евстрапов А.А. и др. Микрофлюидные чипы из полиметилметакрилата: метод лазерной абляции и термического связывания / Евстрапов А.А., Лукашенко Т.А., Горный С.Г., Юдин К.В. // Научное приборостроение. – 2005. – Т. 15. – №. 2. – С. 72-81), содержащую слой оптически прозрачной подложки, слой с культивационной камерой и отходящими от нее каналами для жидкости, оптически прозрачный слой, герметизирующий микрофлюидные каналы. А также содержит порты, сопряженные с герметизирующим слоем для обеспечения подачи и отвода пробы и реагентов в каналы и культивационную камеру. При этом все каналы отходят от культивационной камеры, имеющей порт для ввода и вывода клеточной пробы с крышкой, и каждый канал содержит порт ввода и вывода препарата с крышкой. Устройство содержит по меньшей мере три канала, предназначенные для элюирования пробы опухоли.

Техническим результатом изобретения является обеспечение возможности испытания различных ингибиторов клеточной деятельности на различных пробах с идентичными свойствами и характеристиками и обеспечение возможности параллельного анализа разделенной пробы.

Технический результат достигается за счет того, что обеспечивается пространственное разделение одной пробы культуры опухолевых клеток малого объема на несколько частей без необходимости ее механического разделения и разведения, что дает возможность независимого воздействия на каждую из них и выполнения параллельного анализа разделенной пробы.

Разделение пробы по меньшей мере на три части в соответствии с количеством необходимых типов препаратов или их концентраций обеспечивает возможность ее параллельного анализа. Такое разделение позволяет обеспечить испытание различных ингибиторов клеточной деятельности на одной пробе малого объема без необходимости ее механического разделения и разведения.

В каждой из частей разделенной с помощью элюирования пробы для определения параметров влияния исследуемых веществ на лекарственную резистентность, чувствительность и скорость миграции опухолевых клеток могут быть применены различные методы исследования, такие, как световая микроскопия, флуоресцентная микроскопия и др. (Сергеева Т.Ф. и др. Современные методы исследования апоптотической гибели клеток (обзор) / Сергеева Т.Ф., Ширманова М.В., Загайнова Е.В., Лукьянов К.А. // Современные технологии в медицине. – 2015. – Т. 7. – №. 3. – С. 172-182). Это позволяет обеспечить более широкую универсальность применения разработанного способа в диагностических лабораториях с различным оснащением, а также повысить надежность результатов за счет возможности сравнения результатов, полученных несколькими методами анализа.

Устройство для осуществления способа дополнительно обеспечивает получение технического результата, заключающегося в повышении стабильности внутренней среды исследуемой пробы, обеспечении возможность проведения параллельной загрузки пробы в каждый из каналов через порт с крышкой.

Совокупность признаков по п. 3 формулы характеризует устройство, в котором подложка может состоять из полиметилметакрилата (ПММА) или стекла, в том числе предметного или покровного стекла, что позволяет обеспечить прозрачность и возможность наблюдения за пробой с помощью различных методов исследования, таких как световая микроскопия, флуоресцентная микроскопия и др., а также обеспечить надежность и жесткость конструкции по сравнению с устройствами на основе мягких полимерных материалов (например, полидиметилсилоксана). Подложка может иметь толщину от 0,1 до 1,5 мм в соответствии со стандартной номенклатурой выпускаемых промышленностью стеклянных или полимерных подложек.

Слой с культивационной камерой и отходящими от нее каналами для жидкости может иметь толщину от 0,1 до 0,5 мм в соответствии со стандартной номенклатурой выпускаемых промышленностью листовых пластиков и содержит каналы шириной от 100 до 1000 мкм в зависимости от требуемого объема пробы для транспортировки пробы и реагентов, а также камеру для культивирования клеток шириной от 100 до 1000 мкм в зависимости от требуемого объема пробы, что обеспечивает возможность варьирования объема исследуемой пробы, а также надежность и жесткость конструкции.

Слой, герметизирующий микрофлюидные каналы, может быть выполнен, например, из ПММА, полипропилена или полиэтилена и иметь толщину от 1 до 1,5 мм в соответствии со стандартной номенклатурой выпускаемых промышленностью листовых пластиков. Таким образом, может быть обеспечена более высокая герметичность устройства, возможность контроля газового состава внутренней среды, а также надежность и жесткость конструкции.

В способе культивирования и исследования гибели гетерогенной культуры опухолевых клеток отбирают пробу цельной опухоли у пациента со злокачественным новообразованием, помещают ее в изотоническую питательную среду для культивирования клеток, которая обеспечивает постоянство условий pH, температуры и других факторов, необходимых для обеспечения жизнедеятельности клеток. Такой питательной средой может быть, например, солюбилизированный матрикс Matrigel. В результате культивирования при инкубационной температуре 37 °C формируются клеточные сфероиды, представляющие собой трехмерные агрегаты опухолевых клеток. Полученными клеточными сфероидами, суспендированными в питательной среде, заполняют культивационную камеру при скорости потока 0,1–1,0 мм/с и закрывают ее с помощью крышки для предотвращения высыхания образца. Затем в порты вводят растворы веществ, влияющих на клеточную жизнедеятельность, после чего порты закрывают с помощью крышек для предотвращения высыхания образца. Объем пробы составляет от 10 мкл до 1 мл в зависимости от количества отобранного материала. После заполнения клеточной культурой и тестируемыми веществами устройство помещают в один из приборов для проведения исследования (световая микроскопия, флуоресцентная микроскопия, спектроскопия и др.). Время наблюдения за пробой может составлять от 30 минут до 24 часов. После проведения исследования с помощью программных средств определяют параметры лекарственной резистентности, чувствительности, скорости миграции клеток опухоли, например, под воздействием различных ингибиторов клеточной деятельности.

В устройстве для осуществления способа культивирования и исследования гибели гетерогенной культуры опухолевых клеток содержится три слоя, герметично соединенных между собой с помощью термокомпрессионного связывания. Первый слой – слой подложки изготавливают из полиметилметакрилата (ПММА) или стекла, в том числе предметного или покровного стекла, что обеспечивает прозрачность для наблюдения в видимом диапазоне спектра, а также надежность и жесткость конструкции. Во втором слое из ПММА, полиэтилентерефталата (ПЭТФ) или поливинилхлорида (ПВХ) формируются культивационная камера и отходящие от нее каналы, что обеспечивает возможность параллельного распределения пробы объемом от 10 мкл до 1 мл, а также надежность и жесткость конструкции. Соединение первого и второго слоев с герметизирующим слоем методом термокомпрессионного связывания обеспечивает герметичность устройства с возможностью управления газовым составом его внутренней среды, а также позволяет упростить технологию изготовления устройства и дополнительно снизить стоимость устройства. Порты для ввода и вывода пробы имеют возможность многократного закрытия и открытия с помощью крышек, что обеспечивает герметизацию устройства и предотвращает высыхание исследуемого образца.

Изобретение поясняют следующие фигуры:

Фиг. 1. Схема устройства для реализации способа культивирования и исследования гибели гетерогенной культуры опухолевых клеток.

Фиг. 2. Топология устройства на примере шестиканальной топологии для исследования гибели гетерогенной культуры опухолевых клеток и пример технологической реализации на основе полимерных материалов.

Фиг. 3. Пример применения способа для исследования гибели клеток в устройстве шестиканальной топологии.

Фиг. 4. Пример применения способа для исследования воздействия препарата 4-(2,2-дифтор-1,3-бензодиоксол-4-ил)-1H-пиррол-3-карбонитрил на культуру клеток в устройстве шестиканальной топологии.

Фиг. 5. Пример применения способа для анализа движения отростка клеток опухолевого сфероида в устройстве трехканальной топологии.

Фиг. 6. Пример применения способа для исследования миграции цельного опухолевого сфероида в устройстве трехканальной топологии.

Устройство (Фиг. 1) для осуществления способа содержит: 1 – слой подложки из полиметилметакрилата (ПММА), 2 – слой из полиэтилентерефталата (ПЭТФ) с культивационной камерой и отходящими от нее каналами, 3 – герметизирующий слой из ПММА, 4 – порт для ввода и вывода препарата, 5 – крышка для герметизации порта для ввода и вывода препарата, 6 – микрофлюидный канал, 7 – культивационная камера, 8 – порт для ввода и вывода клеточной пробы, 9 – крышка для герметизации порта для ввода и вывода клеточной пробы.

Устройство (Фиг. 1) для осуществления способа содержит микрофлюидный канал 6, заполняемый жидкостью (например, суспензией опухолевых клеток в Matrigel), который образован подложкой из ПММА 1, слоем из ПЭТФ 2 с каналами 6, отходящими от культивационной камеры 7, и герметизирующим слоем из ПММА 3. Герметизирующий слой 3 сопряжен с портами для ввода и вывода препарата 4, закрытыми крышками 5 с целью предотвращения испарения жидкости, и портом для ввода и вывода клеточной пробы 8, закрытым крышкой 9 для предотвращения высыхания пробы. Жидкая проба клеток поступает в культивационную камеру 7 через порт 8 и элюируется по каналам 6 с заданной скоростью, которая определяется кинетикой массообмена в диффузионно-ограниченном процессе сорбции в системе. Далее в порты 5 вводят исследуемые препараты, которые могут ингибировать клеточную деятельность. При элюировании жидкой пробы исследуемые клетки мигрируют по длине канала 6 в направлении портов 5. Миграция исследуемых клеток по каналу и возможное изменение их морфологии наблюдают, например, посредством световой микроскопии и регистрируют с помощью записи видеосигнала или цифровых изображений.

На Фиг. 2 показаны (а) – топология устройства на примере шестиканальной топологии для исследования гетерогенной культуры опухолевых клеток: 2 – слой из ПЭТФ с культивационной камерой и отходящими от нее каналами, 6 – микрофлюидный канал, 7 – культивационная камера и (б) – пример технологической реализации устройства на основе полимерных материалов: 4 – порт для ввода и вывода препарата, 5 – крышка для герметизации порта для ввода и вывода препарата, 8 – порт для ввода и вывода клеточной пробы, 9 – крышка для герметизации порта для ввода и вывода клеточной пробы.

На Фиг. 3 представлен пример применения способа для исследования гибели клеток в устройстве шестиканальной топологии: (а) – исходная суспензия клеток Saccharomyces cerevisiae (в буферном растворе) при увеличении 100×; (б) – клетки после покраски метиленовым синим при увеличении 100×; (в) – процесс гибели клеток в канале микрофлюидной системы при увеличении 40×; (г) – процесс гибели клеток в канале микрофлюидной системы при увеличении 10×; (д) – гистограмма уровня некроза клеток для каждого канала.

На Фиг. 4 представлен пример применения способа для исследования воздействия препарата 4-(2,2-дифтор-1,3-бензодиоксол-4-ил)-1H-пиррол-3-карбонитрил (флуодиксонил) на культуру клеток Saccharomyces cerevisiae в устройстве шестиканальной топологии: (а) – исходный образец дрожжей в буферном растворе; (б) – окраска метиленовым голубым клеток дрожжей без воздействия флуодиксонилом; (в) – после воздействия 0,1% раствором препарата флуодиксонил и окраски метиленовым голубым в течение 60 мин; (г) – гистограмма оценки уровня некроза клеток для каждого канала.

На Фиг. 5 показан пример применения устройства для анализа движения отростка клеток опухолевого сфероида: (а) – микрофотография участка поверхности устройства с нанесёнными сфероидами раковых клеток, масштабный отрезок – 100 мкм, прямоугольником обозначен регион интереса; (б) – регион интереса в трёх временных точках, стрелкой обозначен растущий отросток клетки; (в) – гистограмма значений относительного перемещения для популяций клеток в разных каналах.

На Фиг. 6 показан пример применения устройства для исследования миграции цельного опухолевого сфероида: (а) – в начальный момент времени; (б) – через 30 минут; (в) – через 90 минут; (г) – через 165 минут, масштабный отрезок – 100 мкм; (д) – гистограмма значений скорости перемещения в канале в течение времени исследования для клеточных сфероидов в разных каналах.

Пример 1

Рассмотрим пример применения способа для исследования гибели клеток в устройстве. Для проведения тестирования работоспособности устройства использовали в качестве объектов, моделирующих клетки опухоли, клетки дрожжей вида Saccharomyces cerevisiae. Дрожжи известны как успешный исследовательский инструмент и тщательно изученный эукариот. Они являются одним из предпочтительных модельных организмов для изучения биологии и, в частности, гибели злокачественных клеток, благодаря соответствию размеров, что важно при разработке микрофлюидных модулей для транспорта проб, а также благодаря отсутствию токсичности, быстрому росту популяции и доступности. Это позволяет планировать эксперименты, имитирующие рост и гибель популяций злокачественных клеток. Кроме того, эксперименты, проведенные на дрожжах, можно перенести на высшие эукариоты. Было проведено исследование суспензии дрожжей Saccharomyces cerevisiae концентрацией 1 г на 20 мл фосфатного буферного раствора с 0,1 M NaCl. Суспензию клеток дрожжей вводили в культивационную камеру устройства шестиканальной топологии и закрывали крышкой. Наблюдение за пробой в каналах осуществляли с помощью оптического микроскопа Микромед 3 (U3). Вид исходной суспензии показан на Фиг. 3(а). После выдержки в течение 3 суток при комнатной температуре проведено исследование некроза путем окраски метиленовым голубым (ЧДА, ТУ 6-09-29-76, С₁₆H₁₈СlN₃S·3H₂О). Приготовление раствора метиленового голубого: 100 мл 0,1 M цитрат натрия + 12 мг метиленового голубого. К суспензии дрожжей был добавлен раствора метиленового голубого в объеме 100 мкл. Далее производили выдержку в течение 60 мин. Примеры результата окраски при различных увеличениях оптического микроскопа показаны на Фиг. 3 (б), (в), (г). С помощью программного обеспечения Gwyddion оценили уровень некроза клеток для каждого канала (Фиг. 3 (д)).

Пример 2

Рассмотрим пример применения способа для исследования воздействия препарата 4-(2,2-дифтор-1,3-бензодиоксол-4-ил)-1H-пиррол-3-карбонитрил (флудиоксонил) на культуру клеток Saccharomyces cerevisiae в устройстве шестиканальной топологии с целью наблюдения управляемого некроза клеток.

Суспензию клеток дрожжей вводили в культивационную камеру и закрывали крышкой. Наблюдение за пробой в каналах осуществляли с помощью оптического микроскопа Микромед 3 (Россия). Пример вида исходной суспензии в одном из каналов показан на Фиг. 4(а). Затем добавляли раствор метиленового голубого и выдерживали в течение 30 минут. Пример вида окраски метиленовым голубым клеток дрожжей до воздействия препарата флуодиксонил в одном из каналов представлен на Фиг. 4(б). После введения пробы клеток в культивационную камеру аналогичного чипа (до окраски метиленовым голубым) в порты для ввода добавляли препарат флудиоксонил в разных концентрациях (порты 1 и 2 – концентрация 0,05%, порты 3 и 4 – концентрация 0,1%, порты 5 и 6 – концентрация 0,2%). Воздействие различных концентраций препарата флудиоксонил на культуру клеток в каналах микрофлюидного чипа осуществляли при комнатной температуре в течение 60 минут. Затем во входные порты добавляли раствор метиленого голубого и выдерживали в течение 60 минут. Пример результата воздействия 0,1% раствора препарата флуодиксонил и окраски метиленовым голубым в течение 60 мин на пробу в одном из каналов приведен на Фиг. 4(в). С помощью программного обеспечения Gwyddion оценили уровень некроза клеток для каждого канала (Фиг. 4 (г)).

Пример 3

Рассмотрим пример применения устройства для анализа движения отростка клеток опухолевого сфероида, полученного из образца мультиформной глиобластомы в устройстве трехканальной топологии. Суспензию опухолевых клеток вводили в культивационную камеру и закрывали крышкой. С использованием покадровой съемки произвели анализ движения клеток сфероида (Фиг. 5(а)) в каналах. Для регистрации движения клеток использовали настольную систему цитометрии Image ExFluorer LCI (Южная Корея), представляющую из себя программно-аппаратный комплекс для прижизненной визуализации и анализа параметров клеток. В эту систему помещали устройство с клетками и инкубировали при 37 °C и 5% углекислого газа в течение 24 часов. Изображения получали с помощью лазера с длиной волны 405 нм и освещения в светлом поле с использованием сухого объектива 20×. Выбирали поле зрения, содержащее сфероиды, затем производили микрофотографирование полей зрения в каждом из трех каналов каждые 15 минут в течение 24 часов. На полученных изображениях выявили популяции активно движущихся клеток и оценили их инвазивный потенциал по относительному перемещению за единицу времени. Примеры полученных изображений двигающихся клеток представлены на Фиг. 5(б), а гистограмма значений относительного перемещения для популяций клеток в разных каналах представлена на Фиг. 5(в).

Пример 4

Рассмотрим пример применения устройства для исследования миграции цельного опухолевого сфероида в трехканальной топологии. Пробу с цельным клеточным сфероидом вводили в культивационную камеру и закрывали крышкой. С использованием покадровой съемки произвели анализ движения цельных сфероидов, пример изображения которого представлен на Фиг. 6(а), в каналах устройства. Для регистрации движения сфероидов использовали настольную систему цитометрии Image ExFluorer LCI (Южная Корея), представляющую из себя программно-аппаратный комплекс для прижизненной визуализации и анализа параметров клеток. В эту систему помещали устройство со сфероидом. Изображения получали с помощью лазера с длиной волны 405 нм и освещения в светлом поле с использованием сухого объектива 20×. Выбирали поле зрения, содержащее сфероид, затем для каждого канала производили микрофотографирование поля зрения в различные промежутки времени. На полученных изображениях выявили направленное движение клеточных сфероидов. Примеры полученных изображений направленного движения клеточного сфероида в одном из каналов представлены на Фиг. 6 (б), (в), (г). Для образцов сфероидов в каждом из каналов оценили скорость перемещения в канале в течение времени исследования (см. Фиг. 6 (д)).

Таким образом, изобретение достигает заявленный технический результат: обеспечение возможности испытания различных ингибиторов клеточной деятельности на различных пробах с идентичными свойствами и характеристиками и обеспечение возможности параллельного анализа разделенной пробы.

Группа изобретений относится к биотехнологии. Раскрыт способ культивирования и исследования гибели гетерогенной культуры опухолевых клеток, при котором на основе отобранной пробы опухоли обеспечивают имитацию адгезии и миграции опухолевых клеток на поверхности сосудов и моделирование инвазии опухоли. При этом имитацию адгезии и миграции опухолевых клеток на поверхности сосудов и моделирование инвазии опухоли осуществляют тем, что обеспечивают элюирование пробы опухоли по меньшей мере на три части и к каждой части пробы добавляют питательную среду для культивирования клеток, затем подвергают каждую часть пробы воздействию ингибитора клеточной деятельности. Также представлено устройство для осуществления способа культивирования и исследования гибели гетерогенной культуры опухолевых клеток, которое представляет собой структуру из трех герметично соединенных между собой слоев. Изобретение может быть использовано при исследовании жидких биологических и медицинских проб за счет обеспечения возможности испытания различных ингибиторов клеточной деятельности на различных пробах с идентичными свойствами и характеристиками и возможности параллельного анализа разделенной пробы. 2 н. и 1 з.п. ф-лы, 6 ил., 4 пр.

1. Способ культивирования и исследования гибели гетерогенной культуры опухолевых клеток, при котором на основе отобранной пробы опухоли обеспечивают имитацию адгезии и миграции опухолевых клеток на поверхности сосудов и моделирование инвазии опухоли, отличающийся тем, что имитацию адгезии и миграции опухолевых клеток на поверхности сосудов и моделирование инвазии опухоли осуществляют тем, что обеспечивают элюирование пробы опухоли по меньшей мере на три части, к каждой части пробы добавляют питательную среду для культивирования клеток, затем подвергают каждую часть пробы воздействию ингибитора клеточной деятельности, который добавляют в питательную среду, исследуют состояние каждой части пробы с помощью методов микроскопии.

2. Устройство для осуществления способа культивирования и исследования гибели гетерогенной культуры опухолевых клеток по п.1, содержащее камеру для культивирования клеток и выпускное отверстие для отработанной жидкости, отличающееся тем, что представляет собой структуру из трех герметично соединенных между собой слоев, содержащую слой оптически прозрачной подложки, слой с культивационной камерой и по меньшей мере тремя каналами для жидкости, предназначенными для элюирования пробы опухоли; оптически прозрачный слой, герметизирующий микрофлюидные каналы; порты, сопряженные с герметизирующим слоем для обеспечения подачи и отвода пробы и реагентов в каналы и культивационную камеру, при этом все каналы отходят от культивационной камеры, имеющей порт для ввода и вывода клеточной пробы с крышкой, и каждый канал содержит порт ввода и вывода препарата с крышкой.

3. Устройство по п.2, отличающееся тем, что подложка может быть выполнена из полиметилметакрилата или стекла, в том числе предметного или покровного стекла.