Способ определения активности антитромбина Ш в плазме крови Советский патент 1989 года по МПК G01N33/68 

1

Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике нарушений свертываемости крови.

Цель изобретения - повышение точ- ности способа в условиях гепарино- терагога.

Цель достигается тем, что в способе определения активности антитромбина (AT) III в плазме крови, вклю- . чающем связывание AT III дефибрини- рованной плазмы экзогенного тромбина, где об активности AT III судят по активности остаточного тромбина, удаление гепарина из плазмы осуществляется путем адсорбции сульфатом бария,

Способ осуществляют следующим образом.

Реактивы: 3,8%-ный раствор цитрата натрия, буфер Михаэлиса, рН 7,4, рабочий раствор тромбина (Каунасское предприятие бакпрепаратов) в буфере i

Михаэлиса, рабочий раствор фибриногена (Каунасское предприятие бакпрепаратов) в буфере Михаэлиса, сульфат бария.

Приготовление исследуемой плазмы. Из вены обследуемого силиконирован- ной иглой берут кровь и смешивают ее в силиконированной пробирке с 3,8%-ным раствором цитрата натрия в соотношении 9:1, затем центрифугируют 6 мин при 300 об/мин. Снимают бо- |Гатую тромбоцитами плазму и вновь центрифугируют ее в силиконированной пробирке при 1200 об/мин в течение 20 мин. В полученную бедную тромбоцитами плазму добавляют суль- .фат бария из расчета 900 мг/мп, затем в течение 5 мин тщательно перемешивают их стеклянной палочкой.

После этого центрифугируют при 300 об/мин 6 мин. Плазму снимают.

4аь

Ф О СО

роверки качества aAcop6LaiH провоятся с помощью определения протром- бинового времени по Квику, которое в хорошо адсорбированной плазме должно ,. превышать 3 мин при активности добавляемого тромбопластина (проверяется на контрольной нормальной плазме) 15-20 с. Адсорбированную бедную тромбоцитами плазму прогревают на10

водяной бане при 56 С в 5 мин. Пссле тепловой дефибринации осаждают фибриноген центрифугированием (10 мин при 1200 об/мин), Надо- садочный слой снимают для проведения 15 исследования.

Приготовление рабочего раствора тромбина. Разводят тромбин в небольшом количестве буфера Михаэлиса (маточный раствор). Часть маточного ра- 20 створа постепенно разводят буфером Михаэлиса, проверяя его коагуляцион- ную активность добавлением 0,2 мп раствора тромбина к 0,3 мп раствора фи бриногена. Свертьшание должно про- 25 исходить за 15-16 с. При избыточном разведении для повышения коагуляци- онной активности добавляют маточный раствор тромбина. Рабочий раствор тромбина готовят непосредственно пе- 30 ред исследованрЕем, так как он быстро теряет свою активность.

Приготовление рабочего раствора фибриногена. Навеску сухого фибрино- гена растворяют в буфере: Михаэлиса gg до концентрации 0,6% Затем по мето ду Рутберг определяют содержание коагулирующего белка (с добавлением 15-секундного тромбина) и вновь до- бавляют буфер.Михаэлиса, доводя кон- 40 центрацию коагулирующего белка до .0,4%,

Ход определения. В силиконирован- ную пробирку набирают 0,8 мл рабочего раствора тромбина, прогревают его 45 на водяной бане при в течение 2 мин и добавляют к 0,2 мл исследуемой дефибринированной адсорбированной плазмы и немедленно включа™ ют секундомер. Ровно через 3 мин н н- 50 кубации этой смеси на водяной бане при 0,2 мл ее переносят в пробирку с 0,3 мл рабочего раствора фибриногена, предварительно также прогретого в течение 1 мин при 37 С, 55 Немедленно включают второй секувдомер и регистрируют время свертьшания. По калибровочной кривой находят процентное содержание AT-III,

Построение калибровочной кривой. Цитратнлпо плазму, полученную у 10 здоро вых людей, адсорбируют и дефиб- ринируют по указанной методике, после чего все образцы смешивают в равных объемах в одной пробирке. Эту смесь разводят буфером Михаэлиса в 2,4,8 и 16 раз, чем достигается снижение концентрации AT III соответственно до 50-, 25, 12,5 и 6,25%.

По указанной методике опредааяют активность AT III каждого разведения в секундах (измерения проводятся трижды и при совпадении результатов берется их среднее арифметическое). На кривой разведения по оси ординат откладывается десятичный логарифм времени свертывания в секундах, а по оси a6c jjicc - активность AT III в- процентах в соответствии с приготовленными разведениями.

Выработка режимов адсорбции. Проводится исследование влияния концентрации сорбента на степень удаления факторов свертывания (по протромби- новому времени) и активность AT III (по кривой, построенной на адсорбированной плазме).

Данные приведены в табл. 1

УстаноБлено, что активность AT II стабилизируется при 5-I ин yтнoй адсорбции с сульфатом бария в концентрации 400 мг/мл. Дальнейшее увапичение концентрации сорбента не влияет на определяемую активность AT 111

Для исключения возможного влияния факторов свертывания, удаляемых сульфатом бариЯр на степень адсорбции гепарина используется адсорбированная плазма, в которой: определяется тромбиновое , а затем после г паринизации проводится адсорбция.

В табл. 2 представхсена зависимост между степенью гепаринизации плазмы и концентрацией сорбента, достаточно для полного удаления гепарина (при 5-минут:-1ой адсорбции),

Для определения взаимодействия гепарина и факторов свертывания удаляемых сульфатом барияS определяется активность AT III (по кривой, построенной на адсорбированной плазме) при разлнчшзгх степенях адсорбции в плазме с гепарином и без него (табл, 3).

Установлено (табл, 3), что концентрация сульфата бария,, рекомендуемая для адсорбции, является достаточной

для удаления факторов свертывания и гепарина в концентрации 3 ед/мл плазмы и составляет 900 мг/мл плазмы.

Пример 1. Больная А., 32 года.Диагноз: сепсис, дйусторонняя септическая пневмош я, ДВС-синдром.

В качестве базисной терапии ДВС- синдрома больной подкожно вводили гепарин в суточной дозе 20 тыс.ед.

Результаты лабораторного исследования системы гемостаза приведены в табл. 4.

Известным способом выявилась ложно высокая активность AT III, что объясняется влиянием гепарина.

Вьгавленное предлагаемым способом с.нижение активности AT III явилось

показанием для проведения коррекцией но-заместительной терапии свежезамо- роженной плазмой в дозе 600 мл.

Пример 2. Больная С., 37 лет Диагноз: сепсис, ДВС-синдром.

В качестве базисной терапии ДВС- синдрома больной подкожно вводили ге парин в суточной дозе 25 тыс.-ед.

Результаты лабораторного исследования системы гемостаза приведены в табл. 5.

условиях гепариноте- обработку плазьты в количестве 900 мг

Таблица 1

ьная

2275

5995

180, нет свер-100

тывания

180, нет свер-100

тьшания

1670

Таблица2

Концентрация гепарина, ед/мл

Концентрация сорбента, мг/мп

Изобретение относится к лабораторной диагностике. Цель изобретения - повышение точности способа в условиях гепаринотерапии. Рабочий раствор тромбина прогревают и добавляют к нему исследуемую дефибриниро- ванную адсорбированную плазму, которую предварительно обрабатывают сульфатом бария. После инкубации смесь переносят в пробирку с раствором фибриногена и регистрируют время сверты- ван-ля. По калибровочной кривой находят процентное содержание антитромбина III. 5 табл. (Л

Таким образом, несмотря на сниженне активности AT III, определяемое известным способом, данные цифры являются завышенными, а действительное снижение активности AT III, определяемое предлагаемым способом, является гораздо более глубоким.

Таким образом, при гепаринотера- пии известный способ дает завышение результатов, тогда как результаты, полученные с помощью предлагаемого способа, не зависят от присутствия в плазме гепарина.

Формула изобретения

Способ определения активности антитромбина III в плазме крови, включающий обработку дефибринированной плазмы экзогенным тромбином с последующей оценкой активности анти- ;тромбина III по активности остаточ- ного тромбина, отличающий- с я тем, что, с целью повышения точТа блицаЗ

Таблица4

Тест I НольнаяКонтроль

Активированное парциальное тромбопластиновое

время, с4048

ЭтаноловыйПоложительныйОтрицательный

ПротаминсульфатныйПоложительныйОтрицательный

Количество тромбоцитов151 10 /л Активность AT III, %,по

способу известному 140100

предлагаемому5,5100

Таблица5

ТестВольнаяКонтроль

Активированное парциальное

тромбопластиновое время,, с4955

Этаноловый .ПоложительньйОтрицательный

ПротаминсульфатныйПоложительныйОтрицательный Количество тромбоцитов . д .10 /

Активность AT III, % по

способу известному60100

предлагаемому25100