Способ определения активности антитромбина- @ в плазме крови при гепаринотерапии Советский патент 1985 года по МПК G01N33/86 

:о

со

ел

00

4J

1 .

Изобретение относится к области медицины, в частности может быть использовано при лабораторной диагностике нарушений свертьшаемости крови при лечении больных с тромбофилиями, тромбозами, диссеминированным внутрисосудистым свертыванием крови, находящихся на гепаринотерапии.

Цель изобретения- повышение точности способа.

Пример. Приготавливают рабочие растворы тромбина, фибриногена и яда многочешуйчатой эфы. Рабочий раствор тромбина готовят непосредственно перед исследованием, так как в разведенном состоянии он быстро теряет свою коагулирующую активность. Тромбин разводят в буфере Михаэлиса и его активность доводится до 6-8 е- Активность тромбина тестируется на -растворе фибриногена так, чтобы 0,1 мл тромбина свертьшал 0,1 мл рабочего раствора фибриногена за 6-8 с.

Для приготовления рабочего раствора фибриногена сухой фибриноген растворяют в буфере Мизсаэлиса до концентрации 0,6%. По методу Р.Рутберг определяют содержание крагулиркицего белка и вновь добавляют буфер Михаэлиса с таким расчетом, чтобы концентрация коагулирующего белка была в пределах 0,35-0,4%.

Для приготовления рабочего рас7 вора яда многочешуйчатой эфы (Echis multisguamatus) 1 мл яда растворяют в 10 мл буфера. Михаэлиса, (маточный раствор). Из маточного раствора последовательными разведениями получаю раствор, дающий коагуляцию смеси плазм здоровых доноров в системе 0,1 мл плазмы 0,1 мл раствора яда эфы за 20г5 с. Такая концентрация, как 5 -10- - 2-10- г/л, давала необходимую коагулирующую активность. Для исследования использовал образць сухого яда из серпентариев Средней Азии.

Затем из вены обследуемого силиконировайной иглой берут кровь (0,5 мл сливают) и смешивают ее в силиконированной пробирке с 3,8%Hbw раствором цитрата натрия в соотношении 9:1, центрифугируют при

935872

500 в течете 6 мин. Снимают богатую тромбоцитами плазму и вновь центрифугируют ее в силиконированной пробирке при 1600 в течение

5 20 мин. 0,5 мл бедной тромбоцитами плазмы прогревают на водяной бане при в течение 5 мин. После прогревания, фибриноген осаяодают центрифугированием при 1600( .в течение

10 10 мин.

Всиликонированную пробирку набирают 0,1 мл дефибринированной исследуемой плазмы и 1,0 мл рабочего раствора тромбина.Смесь инкубируют на

15 водяной бане в течение 30 мин при для полного связывания АТ-Ш тромбином. Затем дополнительно прогревают в течение 10 мин при 60-65 С, при этом происходит инактивация протромбина и избытка тромбина, и термостабильные комплексы АТ-Ш-Т не разрушаются.

Далее смесь охлаждают до 37 С на водяной бане. После чего в пробирку с 0,1 мл исследуемой смеси добавляют 0,1 мл рабочего, раствора яда многочешуйчатой эфы. Смесь инкубируют -на водяной бане в течение 2 мин при З7с, добавляют в пробирку 0,1 мл рабочего раствора фибриногена и регистрируют время свертывания. По калибровочной кривой находят процентное содержание активности антитромбина-Ш в плазме кро.ви.

Калибровочную кривую строят, исследуя плазмы от 10 здоровых доноров, по следующему принципу. Цитратную донорскую Плазму дефибринируют по описанной методике, после чего все образцы смешивают в равных объемах. Затем полученную смесь разводят буфером Михаэлиса в 2, 4, 8 и 16 раз, чем достигается концентрация АТ-Ш соответственно 50, 25, 12,5 и 6,25%. Определяют ан.титромбиновую активность каждого разве- дения в секундах. Строят кривую разведения, где на оси абсцисс откладьшают активность АТ-Ш в процентах в соответствии с приготовленными разведениями, а на оси ординат время свертьгоания в секундах. Результаты исследования представлены в таблице.. Концентрация гепарина, ед/мин | 0,0 0,1 Активность АТ-Ш, определенная известным способом, %98 102 Активность АТ-Ш, определенная предлагаемым способом, % -96 98 0,3 0,5 .1,0 10,0 160 260 Не определяется 95 96 98 98

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ АНТИТРОМБИНА-lil В ПЛАЗМЕ КРОВИ ПРИ ГЕПАРИНОТЕРАПИИ путем получения бедной .тромбоцитами плазмы, дефибринации ее, инкубации с тромбином при 36-38 С и определения активности антитромбина-Ш по времени свертывания, отличающийся тем, что, с целью повьпиения точности способа, инкубацию с тромбином проводят в течение 20-30мин, затем повторно инкубируют смесь в течение .10-15 мин при 60-65 С, далее добавляют раствор яда многочешуйчатой эфы в концентрации 5-10 - 2-10 г/л. (Л