Способ отбора регуляторных мутантов фотосинтезирующих микроводорослей и штамм водоросли СнLоRеLLа Sp-продуцент углеводов Советский патент 1991 года по МПК C12N15/01 C12N1/12 A01G33/00 C12P19/04 

Изобретение относится к селекции микроводорослей и может быть использовано в биотехнологии фотоавтотроф- ных биосинтезов.

Целью изобретения является повышение эффективности отбора регуляторных мутантов фотосинтезирующих микроводорослей с повышенной продуцирующей способностью фотосинтетического аппарата и получение штамма, обладающего более высоким синтезом углеводов.

Сверхпродукция фотосинтеза в данном случае является следствием нарушений регуляторного механизма, действующего по принципу отрицательной обратной связи, где роль эффектора выполняет один из конечных продуктов фотосинтеза - глюкоза.

На фиг. 1 изображен уровень репрессии карбоакгидразной активности аналогом глюкозы; на фиг. 2 - синтез

штаммом и .

16 штаммом

углеводов известным Chlorella sp. CRS-03

Способ предусматривает последовательное проведение двух этапов селекции микроводорослей: выращивание колоний на питательной среде с добавлением неутилиэируемого клеткой аналога глюкозы (2-деэокси -Д-глюкоэы, 2дДГ) в количестве, полностью подавляющем рост исходной культуры, и культивирование всех полученных на первом этапе резистентных к селективному агенту мутантных клонов на среде, содержащей глюкозу, в темноте.

Известный из практики селекции микроорганизмов прием отбора мутантов с нарушениями механизма регуляции продуктивности некоторых ферментов глюкозой, состоящий в выращивании культур на питательной среде с 2дДГ, обычно приводит к получению достаточно широкого спектра мутантных форм и нуждается в последующем длительном отборе клонов с целевыми свойствами.

Учитывая то, что у фотосинтезирую- щих микроводорослей рост колонии на 2дДГ может быть обусловлен в основном двумя причинами - нарушением регуляции уровня фотосинтеза и мутациями по белку - переносчику глюкозы, для массового отсева второй группы мутантов (нерегуляторного характера) в предложенном способе клоны, резистентные к 2дДГ, сразу переносят на питательную среду с глюкозой (1%), инкубируют их в течение 3-5 сут в темноте.

Благодаря введению второго этапа селекции, представляющего собой достаточно простую и нетрудоемкую процедуру, удается добиться существенного роста эффективности отбора регу- ляторных мутантов с повышенным уровнем продукции фотосинтезирующего аппарата, а именно, более 80% полученных предложенным способом клонов демонстрируют ту или иную степень сверх продукции фотосинтеза.

Q 5

0 5

0

5

0

5

Морфологические признаки штамма. Темно-зеленые клетки с гладкой поверхностью, шаровидной формы, на агаризо- ванной среде Тамийя, размер клеток равен 4,5-5 мкм. Клетка содержит небольшое ядро и крупный чашеобразный хлоропласт. Размножение вегетативное.

Физиологические признаки. Оптимальными условиями для выращивания является среда Тамийя, в качестве источника углерода использует углекислый газ, бикарбонат, газовоздушную смесь, содержащую 1,5-2% углекислого газа, в качестве источника азота - мочевину, рост при 35-37°С.

Отношение к освещенности. Требует круглосуточного освещения.

При описанных условиях накопление биомассы составляет 3,1 мг/мл, скорость роста составляет кл./мл, при этом получают биомассу следующего состава, %: белок 50; углеводы 15,5; липиды 15.

При культивировании штамма на среде Тамийя или на среде Тамийя без источника азота при рН среды 6,3, температуре 42°С, круглосуточном освещении 40 Вт/м2 получают биомассу, содержащую 60% углеводов. Штамм устойчив к контаминации, агглютинации и автолиза не наблюдается, имеет маркерный признак - рост на среде с У. дДГ и глюкозой (в темноте).

Штамм поддерживают на агаризован- ной среде Тамийя при 27-28°С, освещенности 4 эрг/см2. Хранят при 10- , освещенности 0,4 эрг/см5 .

Пример 1. Суспензию клеток Chlorella sp. К с концентрацией 2х хЮ кл./мл наносят на агаризован- ную среду Тамийя с добавлением 0,25- 0,5% 2дДГ, которая полностью подавляет рост исходной культуры, и равномерно распределяют по поверхности шпателем. Такой же газоновый засев делают на контрольной чашке, т.е. без 2 дДГ. Появившиеся на опытной чашке колонии рассевают на агариэованную

Изобретение относится к селекции микроводорослей и может быть использовано в биотехнологии фотоавто- трофных биосинтезов, в частности к получению углеводов. Целью изобретения является повышение эгЬЛечгивности отбора регуляторных мутантов фото- синтеэирующих микроводорослей с повышенной продуцирующей способностью фотосинтетического аппарата и получение штамма, обладающего более высоким синтезом углеводов. Способ заключается в том, что проводят последовательное проведение двух этапов селекции микроводорослей и выращивание колоний на питательной среде с добавлением неутилизируемого клеткой аналога глюкозы 2-дезокси-Д-глюкозы (2дДГ) в количестве, полностью подавляющем рост исходной культуры, и культивирование всех полученных на 1-м этапе резистентных к селективному агенту мутачтных клонов на среде, содержащей глюкозу, в темноте. В результате данного способа получен новый штамм водоросли Chlorella sp. C-/5, депонированный в коллекции микроводорослей Института физиологии растений им. К.А.Тимирязева. Полученный штамм синтезируют до 60% углеводородов. 2 с.п.ф-лы, 2 ил., 5 табл. 3 (Л 0 ел 4ь со со 1

Из отобранных новым методом мутан- 50 питательную среду Тамийя с глюкозой

тов получают соответствующие мутант- ные штаммы хлореллы, в т.ч. и штамм Chlorella sp, - продуцент углеводов.

Вновь полученному штамму присвоили номер CRS ОЭ-2дДГКе5. Штамм депонирован в коллекции одноклеточных водорослей Института физиологии растений им. К.А.Тимирязева под номером С-75.

55

(1%) и помещают в темноту в термоста при 36 С. Колонии, растущие в этих условиях в течение 3-5 сут, анализируют затем на способность к накоплению продуктов фотосинтеза.

В данном случае из 11 резистентных к 2 дДГ мутантов лишь 7 обладают способностью расти в темноте на сред с глюкозой.

питательную среду Тамийя с глюкозой

(1%) и помещают в темноту в термостат при 36 С. Колонии, растущие в этих условиях в течение 3-5 сут, анализируют затем на способность к накоплению продуктов фотосинтеза.

В данном случае из 11 резистентных к 2 дДГ мутантов лишь 7 обладают способностью расти в темноте на среде с глюкозой.

Данные роста резистентных к дДТ мутантов Chlorella sp. на различных средах приведены в табл. 1.

Пример 2. Для создания условий направленного синтеза углеводов Chlorella sp.K полученные мутанты помещают в сосуды для интенсивного выращивания на питательную среду Та- мийя без азота. Барботирование культур осуществляют газовоэдушной смесью с 2% СО, выращивание проводят при 36°С. Освещение 5J Вт/м2 круглосуточное „ Начальная концентрация клеток в 1 мл 111х106 .

Содержание углеводов в исход но Г, культуре и культурах мутантов опр-гдг - ляют методом фенол-серная кислота.

Через определенные интервалы времени отбирают 0,05-0,1 мл суспензии, добавляют 0,05 мл 80%-ного растр фенола и 5 мл концентрированной 4 Оптическую плотность окрашенного глот

К;1 ,.1д-.и ы пиг. 1, при проникно- йегии п клеть и микроводоросли 2 дДГ ачтив тость хлороТ ластноп карбоачгид- рлэы v исходной формы Chlorella sp.K per.nec рфуется до 6, 7, а у Chlorella Ор. (MS J3 ,} дЧГ Res остается на ьысокоч , составляя 86% от нс35

вора измеряют на фотоэлектроколориметре с использованием фильтра с максиму-25 ходного значения.

мом пропускания 490 им.Таким образом, из приведенных приКоличество углеводов рассчитывают меров следует, что предложенный спо- по градуировочной кривой, предвари- соб селекции обеспечивает гораздо метельно составленной по глюкозе. Полу- нее трхдпемкии и бчстрпй, а следова- ченный конечный продукт имеет следую- 30 icyibno, и более -эффективный чем в щий состав, %: водорастворимые сахара случае прототипа этбор регуляторных 5; крахмал 80; гемицеллюлоза 3; клетчатка 1-3.

Сравнительная характеристика накопления углев одов в клетках, исходного и мутантных Chlorella CRS 5 и Chlorella CRS 10, Chlorella CRS 03 лЧГRcs штаммов в условиях роста бет азота приведена в табл. 2 и 3.

Пример 3. Другим фактором, продуцент углеводов.

вызывающим направленный синтез углего- Применение изобретения в биотех- дов, является экстремальная темпера- нологнн фотоавтотрофшк биосинтезов тура 43°С. Исходную культуру и муглн- п т nonviiaTb более в кокие выхо- ты выра1 ;ивают на полной среде Тамийя ды продуктов фотосинтеза - полисаха- при 36° С, при круглосуточно -, севере- 5 РИДОВ (крахмал) с единицы суспензии, нии (50 Вт/м2) и непрерывном барботи- а также использовать данные мутанты ровании газовоздушной смесью с 17, СО2, для исследования молекулярных меха- а затем переводят в условия экстре- низмов регуляции экспрессии генома

хлоропласта и для конструирования 50 новых продуцентов на основе методов генной инженерии.

мутантов с IIOFI mit иной продуцирующей способностью отосинтетическогс аппарата, отличаю;ы ся гре-кдо всего более высоьимн ВОЗМОАЬОСТЯМИ в плане накопления в клетках уг 1ечодов.

В частности, благодаря использованию гридлага ;ого способа получен штамм Chlorell sp. CRS ,)3 ЛдДГРе5мальной температуры 43°С. Содержание углеводов определяют тем же методом, что и в примере ).. Результаты анализа представлены в табл. 4 и 5.

Пример 4. Одним из доказательств, указывающих на то, что Chlorella sp.CRS 03 2дДГСе5 - регулятор- 55 ный мутант с нарушенным механизмом негативной метаболитной регуляции фотосинтеза на уровне экспрессии генома хлоропласта является отсутствие

Формула изобретения

1 Способ отбора регуляторных мутантов фотосинтезируго дих микроводорослей v включающий выращивание культур в присутствии селективного агента 2-дезокси Д-глюкозь е концентрации,

0

5

репрессии аналогам г.иохозы (,. чЛГ) фермент.1, кодируемого я хлоропласт- ном геноме - хлороипасгной карбоан- гчдра si i.

Chlorilli sp. К и мутант культивируют в ;гловиях интенсивной культуры при постоянном освещении и непрерывном барГютнрованин газовоздушной смесью с /Л С02. Культуру выращивают до плотносш 70-1. ill мл ч клегок в 1 мл, после чего вносят стерильную / дДГ концентрации 0,5%. Активность карбоан- гидрач, опрсдотяют электрометрическим мегодо по пзм( рН в процессе рр гкцч гидратации Гп. Контролем c-vv, е чзимдтическая реакция.

К;1 ,.1д-.и ы пиг. 1, при проникно- йегии п клеть и микроводоросли 2 дДГ ачтив тость хлороТ ластноп карбоачгид- рлэы v исходной формы Chlorella sp.K per.nec рфуется до 6, 7, а у Chlorella Ор. (MS J3 ,} дЧГ Res остается на ьысокоч , составляя 86% от нс

меров следует, что предложенный спо- соб селекции обеспечивает гораздо менее трхдпемкии и бчстрпй, а следова- icyibno, и более -эффективный чем в случае прототипа этбор регуляторных

мутантов с IIOFI mit иной продуцирующей способностью отосинтетическогс аппарата, отличаю;ы ся гре-кдо всего более высоьимн ВОЗМОАЬОСТЯМИ в плане накопления в клетках уг 1ечодов.

В частности, благодаря использованию гридлага ;ого способа получен штамм Chlorell sp. CRS ,)3 ЛдДГРе5Формула изобретения

1 Способ отбора регуляторных мутантов фотосинтезируго дих микроводорослей v включающий выращивание культур в присутствии селективного агента 2-дезокси Д-глюкозь е концентрации,

полностью подавляющей рост исходной культуры, отличающийся тем, что, с целью повышения эффективности отбора регуляторных мутантов с повышенной продуцирующей способностью фотосинтетического аппарата, полученные резистентные к селективному агенту клоны подвергают вторичной селекции на питательной среде с глюкозой в темноте.

2, Штамм водоросли Chlorella sp. КВИФР № С-75 - продуцент углеводов.

Таблица 1

без 2дДГ

а

1654337

И) Таблица

ТаблицаЗ

+ 2ДДГ

Фиг. f

исходная культура мутант

50

W

w

го

A%36

w

60

Vut.Z

&рем. v