ШТАММ ДРОЖЖЕЙ Phaffia rhodozyma - ПРОДУЦЕНТ АСТАКСАНТИНА Российский патент 2010 года по МПК C12N1/16 C12P23/00 C12N15/01 

Изобретение относится к микробиологической промышленности, к способу производства каротиноида астаксантина и касается нового штамма - продуцента астаксантина, принадлежащего к дрожжам вида Phaffia rhodozyma.

Астаксантин (AX) - пигмент каротиноидной природы, который можно выделить из ряда природных источников: морских животных (лососевых рыб, крабов, креветок), морских бактерий и микроводорослей, а также дрожжей рода Phaffia rhodozyma. AX широко используется в сельском хозяйстве, например, в качестве премиксов, определяющих красную окраску желтков яиц и характерную красно-розовую окраску мяса лососевых рыб (особенно форели) при искусственном их разведении. В медицине АХ используется как мощный антиоксидант для лечения ряда заболеваний сердечно-сосудистой системы, онкологических заболеваний, заболеваний, связанных с нарушением работы иммунной системы. В косметике АХ применяется как эффективное средство защиты от УФ-излучения.

Известны способы получения АХ путем ферментации с использованием зеленых микроводорослей Gaematococcus pluvialis (патент США №6,022,701) и с использованием дрожжей Phaffia rhodozyma (патенты США №6,015,684; 5,972,642; 5,922,560).

Водоросли Gaematococcus pluvialis способны накапливать до 30 мг АХ на 1 г сухой биомассы, однако имеют низкую скорость роста, что значительно увеличивает длительность процесса получения АХ. Кроме того, для культивирования водорослей необходимо постоянное освещение.

Дрожжи Phaffia rhodozyma способны наращивать большую биомассу (50-60 г сухой биомассы на 1 л среды), но на накопление АХ также существенное влияние оказывает наличие дополнительного освещения.

Штамм дрожжей Phaffia rhodozyma (патент США №6,413,736), рассматриваемый нами в качестве ближайшего аналога, способен накапливать до 100 г сухой биомассы на 1 литр среды при удельной продуктивности по АХ около 7,0 мг/г сухой биомассы. По заявлению авторов, выход АХ 700 мг/л питательной среды может быть получен при освещенности интенсивностью от 15 до 25 ватт на 1 килолитр ферментационной среды.

Задача изобретения - расширить арсенал штаммов дрожжей Phaffia rhodozyma, способных продуцировать АХ, в том числе в условиях слабой освещенности.

Задача решена путем создания штамма Phaffia rhodozyma К-16-43-34, депонированного во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под регистрационным номером ВКПМ Y-2982 и способного продуцировать АХ в количестве 7,0-8,0 мг/г сухой биомассы в условиях оптимальной (60 lux) и слабой (5 lux) освещенности. В темноте штамм продуцирует АХ в количестве до 5,5 мг/г сухой биомассы. Доля АХ в общем пуле каротиноидов до 70%.

Заявляемый штамм получен из коллекционного штамма Phaffia rhodozyma ВКПМ Y-989 путем обработки нитрозогуанидином (НГ) и последующей многоступенчатой селекции с отбором наиболее продуктивных по АХ мутантов.

1. Культурально-морфологические признаки.

Рост на мальтозном экстракте. После 3 дней культивирования при 20°С клетки элипсоидальные (3,8-7,5)×(5,5-10,5) мкм, встречаются одиночные или в парах, или в коротких цепочках. Почкование происходит главным образом в одних и тех же местах. Сфероидальные хламидоспоры с хорошо выраженными гранулами могут формироваться через несколько дней. Тонкое кольцо и пленка формируются одновременно с небольшим осадком.

Рост на мальтозном агаре фирмы «Difco».

После 7 дней культивирования при 17°С штамм образует колонии ярко-красного цвета. Колонии выпуклые, шероховатые, край колоний неровный. При микроскопии 2-3-суточной культуры обнаруживаются крупные, овальные клетки с ярко выраженной грануляцией. Размеры (4,0-7,0)×(6,0-10,5). Количество жировых гранул резко возрастает после 4-х суток культивирования.

Рост на модифицированной полной дрожжевой среде следующего состава (мас.%): глюкозы - 10,0, дрожжевого экстракта - 0,5, пептона - 0,5, агара - 2,0, вода - остальное.

Рост культуры аналогичен росту на мальтозном агаре. Красная окраска колоний наиболее выражена на 7-9 сутки. На этой стадии внутренняя часть клеток сильно гранулирована, иногда гранулы сливаются в единую жировую глобулу.

2. Культивирование штамма.

Среда культивирования может быть синтетической или природной, включающей источники углерода, азота, минеральные соли, а также микроэлементы и витамины (в том числе биотин).

В качестве источника углерода используют глюкозу, сахарозу, различные органические кислоты. В отдельных случаях можно использовать спирты, например этанол и глицерин.

В качестве источника азота можно использовать различные соли аммония, аммиак, пептон, дрожжевой экстракт и мочевину.

В качестве минеральных солей, как правило, используют фосфаты калия, сульфат магния, сульфаты цинка, марганца и железа, хлорид кальция.

Культивирование проводят в аэробных условиях при температуре 15-22°С (оптимально 17-21°С). Штамм растет при рН среды 3,5-6,5. Предпочтительным является рН 4,5-6,0. рН может быть установлен аммиаком, различными кислотами, основаниями и буферами. Как правило, культивирование проводят в течение 6-8 дней.

Культивирование проводят как в условиях освещенности 5-60 lux, так и в темноте.

Освещенность измеряют на поверхности колб и чашек с помощью люксметра марки Ю117.

3. Физиолого-биохимические признаки.

Штамм ВКПМ Y-2982 способен сбраживать глюкозу, сахарозу, мальтозу и раффинозу, не способен к сбраживанию галактозы, лактозы и мелибиозы. Культура способна ассимилировать сахарозу, мальтозу, целлобиозу, трегалозу, раффинозу, крахмал, ксилозу, L-арабинозу, янтарную кислоту и не способна ассимилировать галактозу, лактозу, D-рибозу, L-рамнозу, эритрит, рибитол, лимонную кислоту, инозитол и нитраты. Уреазная активность положительная.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Получение заявляемого штамма Phaffia rhodozyma К-16-43-34 (ВКПМ Y-2982).

Исходный штамм Phaffia rhodozyma ВКПМ Y-989 подвергают многоступенчатой селекции с отбором наиболее продуктивных по АХ мутантов.

Для этого 1-суточную культуру исходного штамма выращивают в жидкой питательной среде следующего состава (мас.%): глюкозы - 10, пептона - 0,55, дрожжевого экстракта - 0,6, KH₂PO₄ - 0,1, MgSO₄ - 0,05, NaCl - 0,01, CaCl₂ - 0,01, биотина - 2×10^-5; тиамина - 4×10^-4; пантотената Са - 2×10^-4; фолиевой кислоты - 2×10^-6, инозитола - 1×10^-2; никотиновой кислоты - 4×10^-4; парааминобензойной кислоты -

2×10^-4; пиридоксин гидрохлорида - 4×10^-4; рибофлавина - 2×10^-4; борной кислоты - 5×10^-6; CuSO₄ - 5×10^-6; KI - 1×10^-5; FeCl₃ - 2×10^-5; MnSO₄ - 4×10^-5; Na₂MoO₄ - 2×10^-5; ZnSO₄ - 4×10^-5, вода - остальное.

Культивирование проводят при температуре 17°С и рН 5 в качалочных колбах объемом 750 мл при 250 об/мин. Объем культуральной жидкости 25 мл.

Культуру обрабатывают НГ в концентрации 0,1 мг/мл и высевают для отбора мутантов на чашки с твердой питательной средой, которая имеет тот же состав, что предыдущая, но дополнительно содержит 2% агара.

Инкубирование осуществляют в течение 7 суток при температуре 17°С. Всего проводят 25 циклов селекции, причем сначала при освещенности 60 lux, а последние три этапа селекции осуществляют в темноте.

На первых этапах мутанты отбирают визуально по увеличению интенсивности окраски отдельных клонов.

У отобранных клонов определяют удельное содержание АХ с использованием спектрофотометра и хроматографической колонки высокого давления HPLC.

Определение суммарных каротиноидов проводят следующим образом. Выращенную семисуточную биомассу дважды отмывают от питательной среды дистиллированной водой. Каротиноиды из биомассы экстрагируют ацетоном с одновременным разрушением клеток стеклянными бусами фирмы "Sigma" (425-600 мкн) на шейкере. Сумму каротиноидов определяют по общепринятой методике (J. Gen. Microbiol. 1979. V.115. P.173-183) с использованием спектрофотометра "Shimadzu UV-120". Измерения проводят в кварцевых кюветах при длине волны 474 нм, что соответствует максимуму поглощения астаксантина в ацетоне. Удельную продуктивность штаммов рассчитывают с использованием формулы

где V ацетона - объем добавленного ацетона;

А₄₇₄ - поглощение раствора образца при длине волны 474 нм.

Коэффициент экстинкции для 1% астаксантина = 2,100.

Процентное соотношение каротиноидов определяют с использованием жидкостной хроматографической системы HPLC (колонка С-18). В качестве стандартов используют чистые кристаллические препараты астаксантина (АХ) и β-каротина фирмы "Sigma". Зная общую сумму каротиноидов и процентное соотношение АХ, определяют удельное содержание АХ.

После проведения 13 циклов селекции при достижении суммой каротиноидов величины, превышающей 5 мг/л, в питательную среду, используемую для отбора мутантов, добавляют ингибитор синтеза каротиноидов, снижающий уровень синтеза. В качестве таких агентов последовательно используют β-ионон (метилвиологен) в концентрации от 0,01 до 1,0 мг/мл; нистатин от 0,01 до 1,0 мг/мл и глифосат от 0,1 до 10 мкг/мл. Мутанты отбирают визуально по увеличению интенсивности окраски отдельных клонов.

Удельная продуктивность по АХ и суммарному количеству каротиноидов первоначального штамма, ряда промежуточных штаммов и заявляемого штамма приведена в табл.1.

Таблица 1 Этапы селекции штамма ВКПМ Y-2982 Штамм № цикла Σкарот. (мг/г) АХ (мг/г)/% ВКПМ Y-989 Исход. штамм 0,62 0,43/69,3 ВКПМ Y-2238 3 1,6 0,85/53 ВКПМ Y-2342 14 6,9 2,2/32 ВКПМ Y-2346 18 7,1 3,0/42 ВКПМ Y-2413 22 10,1 5,9/48 ВКПМ Y-2982 25 11,2 7,7/64

В результате получен заявляемый штамм Phaffia rhodozyma ВКПМ Y-2982.

Примеры 2. Зависимость удельной продуктивности заявляемого штамма по АХ от условий освещенности.

В табл.2 приведены сведения о синтезе АХ при культивировании на качалочных колбах исходного штамма Y-989, промежуточного штамма Y-2413 и заявляемого штамма Y-2982 в условиях оптимальной освещенности (60 lux), в условиях слабой освещенности (5 lux для Y-2982) и в темноте.

Таблица 2 Зависимость удельной продуктивности (по АХ) штаммов-предшественников и заявляемого штамма от освещенности ВКПМ Y-989 ВКПМ Y-2413 ВКПМ Y-2982 освещение 60 lux темнота отношение освещение 60 lux темнота отношение освещение 60/5 lux темнота отношение 0,43 0,11 3,9 5,9 1,5 3,9 7,7/7,2 5,5 1,3

Культивирование осуществляют в круглодонных колбах на 750 мл (объем питательной среды 20 мл) на качалке типа «New Brunswick». Частота оборотов качалки - 300 об/мин. Культивирование проводят в условиях по примеру 1. Время инкубирования - семь суток.

Состав среды, условия культивирования, а также способ определения АХ - как в примере 1.

Из табл.2 следует, что полученный в результате селекции заявляемый штамм ВКПМ Y-2982 выгодно отличается от своих предшественников по уровню удельной продуктивности по АХ как в условиях оптимальной освещенности, так и в темноте, а при уменьшении оптимальной освещенности в 12 раз его удельная продуктивность снижается только на 6,5%.

При этом уровни удельной продуктивности по АХ у заявляемого штамма как на свету, так и в темноте сопоставими с таковыми у ближайшего аналога.

Пример 3. Получение астаксантина с использованием штамма ВКПМ Y-2982 в 3-литровом ферментере.

Трехлитровый ферментер засевают посевным материалом из расчета 10% от рабочего объема (7,0 г/л сухой биомассы). В качестве посевного материала используют культуру, полученную при выращивании штамма ВКПМ Y-2982 в течение 2-х суток в условиях по примеру 2.

Состав жидкой питательной среды в ферментере - как в примере 1.

Подпитку глюкозой и дрожжевым экстрактом осуществляют со вторых суток культивирования.

Концентрация глюкозы в среде после двух суток не превышает 0,2%. Температура культивирования 17°С. Время культивирования 7 суток. Аэрация высокая (PO₂=60%). рН-статирование (NH₄OH) до 3-х суток (рН=5,0). Конечное значение рН среды 3,5. Культивирование проводят в условиях оптимальной освещенности (60 lux).

Выход сухой биомассы составляет 80 г/л, выход АХ 600 мг/л, удельная продуктивности по АХ 7,5 мг/г сухой биомассы, а доля АХ в общем пуле каротиноидов 70%.

Таким образом, при проведении процесса в ферментере удельная продуктивность заявляемого штамма сохраняется на том же уровне, что и при культивировании его в колбах.

Изобретение относится к микробиологической промышленности. Штамм дрожжей Phaffia rhodozyma, депонированный во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов под номером ВКПМ Y-2982, является продуцентом астаксантина и может быть использован в медицине при лечении ряда заболеваний сердечно-сосудистой системы, онкологических заболеваниях и косметике. Изобретение позволяет расширить арсенал штаммов - продуцентов астаксантина и получать астаксантин как на свету, так и в условиях слабой освещенности. 2 табл.

Штамм дрожжей Phaffia rhodozyma ВКПМ Y-2982 - продуцент астаксантина.