Эталон для калибровки спектрофлуорометра Советский патент 1992 года по МПК G01N21/64 

Изобретение относится к технике оптических измерений, в частности к методам поверки и метрологической аттестации систем регистрации длительности оптических импульсов в наносекундном диапазоне длительностей и в видимой области спектра электромагнитного излучения.

Известны кристаллические этанолы уровня рассеянного света, величины коэффициента поглощения, длины волны испускания и возбуждения.

Однако известные этанолы не позволяют проводить калибровку систем измерения длительности импульсов флуоресценции. Между тем надежность и правильность флу- орометрических измерений определяются двумя основными условиями: качеством конструкции прибора и качеством метрологического обслуживания при проведении измерений. Первое условие определяет стабильность работы самого прибора и зависит от его основных параметров. Второе условие включает в себя обеспечение сохранности показаний прибора, единства и точности измерений, что составляет основную метрологическую задачу эксперимента. В связи с этим перед измерениями прибор необходимо стандартизировать, т.е. приводить к одной и той же чувствительности. Без проверки прибора незадолго до измерений и сразу после них трудно приписать определенный физический смысл параметрам наблюдаемого закона затухания. Это справедливо как для импульсных, так и для фазово-модуляционных измерений. Наиболее надежным методом, позволяющим судить о качестве аппаратуры, является исследование соединений с известным временем затухания, для которых закон затухания можно описать одной экспонентой. Для

00

о ел со

таких соединений импульсная аппаратура должна дать только одно время затухания, для фазово-модуляционной аппаратуры должны получаться одни и те же значения фазовых и моделяционных вре- мен затухания независимо от частоты модуляции. Если это не так, регулируют оптику и (или) электронные устройства, включая ФЭУ таким образом, чтобы результаты измерений удовлетворяли ука- занным требованиям.

Кроме того, как для импульсных, так и для фазово-модуляционных измерений необходимо точно определять зависимость интенсивности возбуждающего света от времени с целью учета влияния аппаратной функции. Для импульсных измерений это временная зависимость интенсивности лампы, для фазово-модуляционного метода необходимо определять фазу возбуждаю- щего света и степень его модуляции. Такие измерения для возбуждающего света обычно проводят, используя рассеянный свет (нулевое время затухания), а не отраженный, поскольку временные характеристики ФЭУ зависят от геометрии засветки фотокатода. Для этого на месте образца помещают рассеиватель и все измерения проводят в тех же условиях, что и для образца, однако регистрацию проводят не при длине волны испускания, а при длине волны возбуждения. Вследствие этого из-за зависимости временных характеристик ФЭУ от длины волны излучения могут возникнуть ошибки, связанные с различием длин волн при реги- страции флуоресценции образца и лампы. Величина этих ошибок определяется как зависимостью временной характеристики фотокатода от длины волны света, так и оптическими факторами, связанными с тем, что рассеянный свет и излучение флуоресценции дают различные изображения на фотокатоде.

В импульсных измерениях по измеренному с помощью данной аппаратуры времени жизни т эталона и известному его действительному значению проводят обратные расчеты по определению влияния аппаратной функции.В фазово-моду- ляционных измерениях эталоны позволяют получать сигналы, для которых известны соотношения между фазой и степенью модуляции возбуждающего пучка света. Флуоресценцию как стандарта, так и образца наблюдают через интерференционный фильтр или через монохроматор, благодаря чему сравнение этих двух сигналов проводится при одинаковой геометрии, если оптические плотности D эталона и объекта примерно

одинаковы (в этом случае изображения на фотокатоде в обоих случаях однотипны), и при близких длинах волн, если свечение эталона расположено в той же или в близкой спектральной области, что и флуоресценция эталона, При этом необходимо иметь ввиду следующее.

При расчете действительной функции высвечивания (исключение влияния аппаратной функции) в расчет закладывается одно- или многоэкспоненциальная модель и рассчитываются отклонения между этой моделью и полученной чистой функцией высвечивания, Вначале используется простейшая одноэкспоненциальная модель, а затем двух-или п-экспоненциальная. Для более сложной модели расчетные отклонения всегда меньше, чем для более простой, однако если усложнение модели не дает заметных уменьшений систематических изменений и флуктуации отклонений, считается, что действительный спад описьшается более простой моделью. Следовательно, если эталон имеет одноэкепо- ненциальный спад известного значения, то при закладке в расчет модели с этим значением т должны быть получены минимальные значения отклонений рассчитанных значений от полученных в эксперименте. Иными словами, одноэкспоненциальный спад, являясь наиболее жестко детерминированным во всем диапазоне спада, позволяет наиболее полно устранить влияние аппаратной функции, поскольку он в наименьшей степени подвержен произволу при выборе модели.

Таким образом, как для метрологического обслуживания флуорометров, так и для учета влияния аппаратной функции необходимы эталоны моноэкспоненциального высвечивания флуоресценции.

Известны растворы, которые могут быть использованы в качестве эталонов квазизк- споненциального высвечивания. Наблюдае- мая интенсивность, длительность и спектральное распределение интенсивности флуоресценции могут зависеть от оптической плотности образца и условий его освещения. Оптимальным является наблюдение флуоресценции под прямым углом к середине центрально освещенной кюветы. Фронтальное освещение (флуоресценция поступает с той же поверхности, на которую налравляется излучение возбуждения), во- первых, увеличивает вероятность попадания на детектор флуоресценции отраженных фотонов возбуждения, что уменьшает измеряемое значение т по сравнению с действительным. Во-вторых, уменьшается чувствительность вследствие того, что большая часть возбуждающего света отражается от поверхности образца. Однако при наблюдении флуоресценции ортогонально к направлению возбуждения за счет поглощения возбуждающего света при прохождении им образца его интенсивность уменьшается, а следовательно, уменьшается и интенсивность флуоресценции. В связи с этим фокусировку возбуждающего света необходимо проводить в центр кюветы, с тем, чтобы наиболее интенсивная флуоресценция наблюдалась в центре кюветы, т.е. из области, которая оптической системой отображается на катоде фотоприемника, а оптическую плотность D раствора выбирать не более 0,2 - 0,3.

Кроме того, при перекрытии спектров поглощения и флуоресценции наблюдается вторичное поглощение (реабсорбция) света флуоресценции. В этом случае свечение коротковолновой части спектра, которое попадает в область перекрытия, выходит из толщи образца ослабленным по сравнению с длинноволновой частью, которая не меня- ется. В результате наблюдаемый спектр оказывается существенно искаженным за счет вторичного поглощения в его коротковолновой части. Вследствие зависимости постоянной времени ФЭУ от спектрального состава флуоресценции этот эффект может вносить погрешность в измерения т, поэтому для эталона должно иметь место минимальное перекрытие спектров поглощения и испускания.

Поглощенный веществом свет флуоресценции может вновь возбуждать его молекулы, приводя к возникновению вторичной флуоресценции. Вторичное свечение также может быть поглощено веществом прежде, чем оно выйдет из исследуемого образца, что может вновь привести к возникновению флуоресценции, и т.д. Спектры флуоресценции вторичных и последующих свечений также могут быть искажены вторичным по- глощением. На опыте наблюдается суммарный спектр флуоресценции всех возникших в растворе свечений, вследствие чего наблюдается и суммарное время высвечивания, которое, во-первых, больше действительного, и, во-вторых, может значительно отличаться от одноэкспоненци- ального. Отсутствуют достаточно надежные методы учета указанных факторов, кроме выбора D раствора не более 0,1 - 0,5 и использования в качестве эталонов растворов с минимальным перекрытием спектров поглощения и испускания,

Выбор размеров кюветы со стандартным раствором проводится следующим образом. С учетом абераций приемной оптической системы, которые для простых оптических систем в длинноволновом участке спектра достигают 1 мм, запаса на неточность наведения и угловую расходимость пучка флуоресценции, излучение флуоресценции редко собирается с площадки диаметром более 3 мм, а излучение лампы - в площадку диаметром менее 3 мм. С учетом удобства использования флуорометра необходим допуск на неточность наведения оптической системы на флуоресцирующий объем. Следовательно, для уменьшения вероятности сбора оптической системой возбуждающего излучения, рассеянного на входной и выходной гранях образца, при одновременном обеспечении возможности получения максимального сигнала диаметра флуоресцирующего объема должен быть не менее 5 мм, а диаметр граней, входных и выходных для возбуждающего излучения, не менее 5 мм. Общепринятым международным стандартом во флуоресцентной спектроскопии является применение кювет размером 10x10 мм. Держателями таких кювет снабжаются все приборы для измерений флуоресценции.

При выборе длины волны возбуждения она должна быть наиболее близка к длине волны самой интенсивной линии источника возбуждения и одновременно быть близкой к длине волны максимума спектра поглощения. Длина волны возбуждающего света и область флуоресценции должны быть спектрально разделены 30 - 50 нм). Это связано с тем, что в приемник вместе с исследуемым излучением (флуоресценцией) частично попадает и рассеянный свет (входная и выходная грани образца, рэлеевское и комбинационное рассеяние растворителя или матрицы). Рассеянный свет уменьшает измеряемое значение г по сравнению с действительным. Причем эти погрешности будут возрастать для веществ с малым квантовым выходом флуоресценции и для регистрирующих систем с высокой чувствительностью. Так, при возбуждении водных растворов сложных органических соединений светом длиной волны 365 нм (линия спектра ртутной лампы) пик рэлеевского рассеяния будет на длине волны 365 нм (первый порядок) и 730 нм (второй порядок решетки монохроматора), при этом будет одновременно наблюдаться пик комбинационного рассеяния на длине волны 416 нм. В том случае, когда длины волн возбуждения и люминисценции близки одна к другой, искажения из-за рассеяния не позволят точно измерить т.

Рассеянный свет можно отличить от флуоресценции по степени поляризации, т.е. его можно отсечь поляризационными фильтрациями. Однако такие фильтры, отличаясь сложностью, сильно снижают величину сигнала и тем самым понижают точность измерений. Для уменьшения влияния рассеянного света регистрируют интен- сивность люминесценции через светофильтр, пропускающий длины волн, отличающиеся от длин волн возбуждения (метод скрещенных фильтров). Однако светофильтр может неравномерно поглощать излучение в зависимости от его спектрального пропускания, что будет вызывать искажение формы спектра флуоресценции и, как следствие, искажение измеряемой величины г вследствие зависимости постоянной времени ФЭУ от спектрального состава излучения. В связи с этим для эталона необходимо задавать спектральный диапазон возбуждения и регистрации. Третьим правилом при выборе длины волны возбуждения является использование длинноволновой полосы поглощения, поскольку вероятность фотохимического разложения образца возрастает с уменьшением длины волны возбуждения.

Таким образом, основными требованиями к эталону т являются следующие: возможность наблюдения флуоресценции ортогонально направлению возбуждения; размер входной и выходной граней для излучения возбуждения флуоресценции и грани, с которой производится наблюдение флуоресценции, ЮхЮмм ; в связи с возможной необходимостью ежедневного использования эталон должен быть механически и фотохимически стабилен; D должна находиться в диапазоне 0,1 - 0,5; слабое перекрытие спектров поглощения и флуоресценции; наличие интенсивной полосы поглощения в диапазоне А, 300 нм; высокий квантовый выход для получения уровня сигнала, достаточного для проведения точных измерений т в большом динамическом диапазоне спада интенсивности и значительно превышающего уровень рассеянного света.

Однако применяемые в известном способе жидкие стандарты вследствие старения требуют периодического приготовления, отличающегося сложностью процедуры. Кроме того, предложенные стандарты имеют двухэкспоненциальное затухание, сильную зависимость времени жизни от температуры и длины волны регистрации, отсутствуют данные об их долговременной стабильности (в течение года и более).

Целью изобретения является повышение точности калибровки системы регистрации длительности световых импульсов при одновременном упрощении процедуры калибровки.

Цель достигается тем, что в качестве эталона для калибровки системы регистрации по форме импульса флуоресценции используют монокристаллический иттрий-алюминиевый гранат, активированный примесью церия (Y3AlsOi2:Ce ) с концентрацией церия

0,05 - 0,3 весовых процента и оптической плотностью 0,1 - 0,3.

Предлагаемый эталон отличается от известного тем, что в нем вместо раствора применен кубический кристалл иттрий-алюминиевого граната, активированный примесью церия с концентрацией (0,05 - 0,3)% и D 0,1 - 0,3. Поскольку использование монокристалла, в том числе кристалла иттрий-алюминиевого граната с примесью церия, в том числе с концентрацией церия (0,05 - 0,3)% в качестве эталона времени высвечивания не обнаружено. Известно применение кристалла иттрий-алюминиевого граната с примесью церия в ядерной физике в качестве сцинцилляторов и сцинцилляционных экранов с максимально достижимой концентрацией церия, которая, как правило, составляет 1%. Однако в этом случае указанный кристалл используется для визуализации излучения и изображений, а не в качестве эталона времени высвечивания, причем с концентрацией церия 1%.

Нафиг.1 приведена функция высвечивания предлагаемого эталона при концентрации церия 0,1 % и размерах кристалла 1x1x1 см3, измеренная на приборе PRA (D 0,2). Точность измерения времени жизни составляла 1 % при значении т 59 не. Длина волны возбуждения Яв 525 нм, длина волны регистрации Яр 400 нм. Наблюдение флуоресценции ортогонально к направлению возбуждения; на фиг.2 и 3 - спектры погло- щения и флуоресценции, измеренные на

приборе Spex. Точность измерений интенсивности в приведенных спектрах не хуже 1%, Длина волны возбуждения при измерении спектра флуоресценции Ав 400 нм. Исследования зависимости формы импульса флуоресценции от концентрации церия, оптической плотности, длины кристалла вдоль направления возбуждения, времени и температуры проводились в течение четырех лет. Рефлектор импульсной

лампы фокусирует ее излучение в пятно с минимальным диаметром 7 мм, в связи с чем размер граней эталона, входной и выходной для возбуждающего излучения, составлял 1 см. Этот размер соответствует стандартному держателю образцов, которыми снабжаются все флуорометры, и позволяет с учетом неточности наведения излучения лампы на объект надежно охватить весь поток возбуждающего флуоресценцию излучения. Длина эталона вдоль направления возбуждения 0,5 - 1 см выбиралась из условия, что с учетом аберраций оптической системы и неточности ее наведения на флуоресцирующий объем вся апертура сбора флуоресценции должна быть заполнена излучением флуоресценции. Это требование объясняется тем, что как эталон, так и исследуемый образец должны дать однотипные изображения на фотокатоде фотоприемника. Исходя из необходимости удовлетворения этому требованию выбирался и диапазон значений D эталона, кото- рый должен был соответствовать диапазону, наиболее часто используемому во флуорометрии и ограниченный значениями D 0,1 - 0,5. Несмотря на то, что перекрытие спектров поглощения и флуоресценции (фиг.2 и 3) незначительно, однако при толщине кристалла 0,5 см и концентрации церия более 0,40% (D 0,4) наблюдалось многоэкспоненциальное затухание. В связи с этим диапазоне допустимых значений D эталона составляет 0,1 - 0,3, что при длине эталона 1 см соответствует диапазону значений концентрации церия 0,05-0,15% при длине 0,5 см-0,1 -0,3%.

В течение четырех лет в пределах погрешности измерений прибора PRA не было обнаружено зависимости гот длины волны возбуждения при изменении ее в диапазоне 350 - 540 нм, от длины волны регистрации при изменении ее в диапазоне 500 - 650 нм, от температуры в диапазоне ее изменений 10 - 50°С, D 0,1 - 0,3, от толщины в диапазоне 0,5 - 1 см и концентрации в диапазоне 0,1-0,3%./

П р и м е р 1. После проведения указа- ных исследований был изготовлен эталон с размером поверхности, на которую поступает излучение возбуждения флуоресценции, 10x10 мм при концентрации церия 0,1%. Толщина эталона равна 10 мм и выбиралась из условия, чтобы D составляла (0,20 ± 0,01)- наиболее часто используемое значение плотности. Поверхности, через которые проходит излучение возбуждения, полировались по 14 классу с целью сведения к минимуму уровня рассеяния возбуждающего излучения. Наблюдение флуоресценции проводится со стороны одной из боковых поверхностей перпендикулярно направлению возбуждения. Сами боковые

поверхности могут быть неполированными, поскольку интенсивности флуоресценции вследствие высокого квантового выхода достаточно для надежных измерений. Поскольку кристалл кубический, нет

зависимости коэффициента поглощения от состояния поляризации излучения, вследствие чего ориентация граней эталона относительно вектора поляризации излучения может быть любой. На фиг.1 в логарифмическом масштабе по шкале интенсивно- стей представлена функция высвечивания предлагаемого эталона.

П р и м е р 2. Второй образец имел размер 10x10x10 мм3, концентрация церия - 0,05%, ,1. Функция высвечивания для данного образца идентична представленной на фиг.1, условия наблюдения те же.

П р и м е р 3. Третий образец имел

размер 10x10x10 мм3, концентрация церия - 0,15%, D 0,3. Функция высвечивания для данного образца идентична представленной на фиг.1. Условия наблюдения те же.

Уменьшение D менее 0,1, во-первых, увеличивало время измерений.более чем в 2 раза по сравнению с D 0,2, во-вторых, не соответствовало диапазону значений D, наиболее часто исследуемых во флуорометрии

(что может приводить к неидентичности геометрии засветки фотокатода фотоприемника при измерениях т эталона и объекта). Увеличение D более 0,3, во-первых, приводило к неодноэкспоненциальному затуханию, во-вторых, не соответствовало диапазону значений D, наиболее часто используемых во флуорометрии; в-третьих, приводило к неоправданному расходу церия; в-четвертых, увеличивало вероятность

возникновения дефектов решетки.

При калибровке системы регистрации на место исследуемого объекта квазиортогонально к направлению возбуждения полированными поверхностями

устанавливается эталон. Через центр полированных граней пропускается излучение возбуждения с длиной волны 350 - 450 нм. Квазиортогонально направлению возбуждения, через центр одной из боковых

граней проводится наблюдение излучения флуоресценции системой регистрации, позволяющей измерять форму импульса флуоресценции в спектральном диапазоне 500 - 650 нм. Отладка и настройка системы регистрации и (или) системы цифрового расчета

импульса флуоресценции проводится до тех пор, пока не будет получена одноэкспонен- циальная форма среза импульса флуоресценции с величиной постоянной времени спада интенсивности флуоресценции ве разт 59 нм,

По сравнению с известным предлагаемый эталон обладает одноэкспоненциаль- ным законом затухания флуоресценции; высокой термической и фотохимической стабильностью; высоким квантовым выходом люминесценции, не зависящей от дли- ны волны возбуждающего света. В предлагаемом эталоне отсутствует перекрывание спектров поглощения и люминес- ценции.

Таким образом, предлагаемый эталон, который может быть изготовлен в виде твердого образца необходимого размера, среди известных эталонов обладает наиболее вы- сокой степенью близости функции высвечи- вания к моноэкспоненциальной при постоянстве г и спектров поглощения и испускания в течение не менее четырех лет и в диапазоне температур 10-50°С при неза- висимости тот длины волны возбуждения и регистрации флуоресценции. Положение полосы поглощения эталона совпадает с положением наиболее интенсивных линий в спектре излучения импульсных наносекунд- ных ламп, работающих в воздухе или в азоте и являющихся основным источником возбуждения практически во всех спектрофлу- орометрах, что позволяет проводить,

эффективное возбуждение свечения эталона, Полоса излучения эталона расположена вблизи максимума спектральной чувствительности подавляющего большинства фотоумножителей, вследствие чего имеет место высокий уровень сигнала, необходимый для измерений длительности светового импульса в широком диапазоне изменений интенсивности. Кроме того, высокая степень спектрального разделения спектра поглощения и флуоресценции обеспечивает возможность надежной спектральной фильтрации излучения флуоресценции от излучения лампы и тем самым повышение точности измерений (наличие в сигнале рассеянных фотонов импульса лампы уменьшает измеряемое г по сравнению с действительным). Эталон удобен в обращении и обладает большим сроком службы, поскольку является кристаллом.

Формула изобретения

Эталон для калибровки спектрофлуоро- метра по форме импульса флуоресценции, отличающийся тем, что, с целью повышения точности калибровки при одновременном упрощении процедуры калибровки, в качестве эталона используют монокристаллический иттрий-алюминиевый гранат, активированный церием (Y2AlsOi-2:Ce ) с концентрацией церия 0,05 - 0,3 весовых процента и оптической плотностью 0,1 - 0,3.

Изобретение относится к технике оптических измерений. Цель изобретения - повышение точности. Эталон представляет собой монокристаллический иттрий-алюминиевый гранат, активированный примесью церия, для которого характерны следующие особенности: строго одноэкспоненциаль- ный закон затухания флуоресценции в диапазоне двух порядков; отсутствие перекрытия спектров поглощения и люминесценции; высокая термическая и фотохимическая стабильность; высокий квантовый выход люминесценции, не зависящий от длины волны возбуждения; высокая степень сохраняемости и удобство в эксплуатации.3 ил. fe

СТАНДАРТНО отклонение

-7%

А

ю

б

о 1 «

Зюв

I

i

ю

ЬРЕНЯ, НС

Риг. 1

.о7г±о..

о

еоо

Л

8 -7

.С

P

г .3

1 л

л

2ОО

ЗОО ДАИИА ВОЛКИ, ИМ

Фиг.2

f-О

9 -7

-6

-8

-3

.г

Л

SOO

55

4 DO

50С

«ю

оо