СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ И ИДЕНТИФИКАЦИИ БИОЛОГИЧЕСКИХ МИКРООБЪЕКТОВ И ИХ НАНОКОМПОНЕНТОВ И УСТРОЙСТВО ДЛЯ ЕГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ Российский патент 2010 года по МПК G01N21/01 C12Q1/06 

Изобретение относится к области медицины, микробиологии, пищевых и промышленных биотехнологий, а именно к исследованию биологических материалов путем определения их физических и химических свойств с помощью оптических средств, к системам, в которых материал зондируется или возбуждается оптическими средствами и он флуоресцирует.

Известен способ обнаружения и идентификации микробов из смесей микробов, который основан на двумерном центрифугировании по степени седиментации полос равной плотности и на обнаружении связанных частиц по свойствам отраженного света и флуоресценции специфических флуоресцентных меток (United States Patent 7070739).

Способ позволяет различать инфекции, идентифицировать известные микробы, изучать и характеризовать новые микробы. Также способ позволяет достаточно уверенно проводить идентификацию микробов и способствует более эффективному лечению соответствующей инфекции.

Однако применение способа и соответствующей аппаратуры с расходными материалами требует существенных финансовых затрат. Также способ не обладает неинвазивностью диагностики, является не клиническим, а лабораторным, что затрудняет его применение врачом, так как требуется транспортировка исследуемого материала в лабораторию и передача результатов исследования обратно в клинику, что дополнительно затрудняет мониторинг процесса лечения и оценку его эффективности.

Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому изобретению является способ селективной оптической диагностики микробов и устройство его реализации, который основан на регистрации как абсорбционных, так и флуоресцентных характеристик исследуемого вещества, помещенного в приспособленную для этого кювету. При этом в качестве значимых диагностических данных используют спектральные характеристики на всех предварительно выбранных длинах волн поглощения и флуоресценции, которые обрабатывают с помощью ЭВМ и программного обеспечения (ПО) на основе статистических регрессионных методов с получением информации о видовых концентрациях микроорганизмов в субстрате (М.Т.Александров. Лазерная клиническая биофотометрия. М., 2008).

Данный способ позволяет в режиме реального времени определять концентрации микроорганизмов в биологических субстратах.

Однако он не позволяет диагностировать нефлуоресцирующие биологические вещества, а также не содержит возможности интракорпорального обследования. Нами он выбран в качестве прототипа.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является возможность качественного и количественного анализа содержимого органических веществ на основе оптического измерения для целей промышленности, медицины, экологии и пищевых технологий.

Указанный технический результат достигается тем, что в способе применяются технические решения, заключающиеся в том, что в качестве феномена, имеющего действующий фактор, например лечебный, и характеризуемого физическими величинами, несущими диагностическую информацию, используют конверсию излучения лазерного (ЛИ) или иного источника света и/или другого электромагнитного излучения, имеющую такие аспекты, соответствующие характеристики количественных мер в отдельности и/или в совокупности которых измеряют с помощью соответствующих устройств, как, например, отражение, рассеяние, поглощение, флуоресценцию, комбинационное и нелинейное рассеяния, эффекты фотоакустический, термо-оптический и др., в исследуемых образцах объектов живой и неживой природы медицинского, промышленного, экологического, пищевого, биосферного, космического и др. назначения, с последующим портированием получаемой информации и диагностической и аналитической обработкой ее в соответствии с основанным на статистической регрессионной модели концентраций компонент аппаратно-адаптированным алгоритмом способа на ЭВМ, который заключается в том, что полученные характеристики сохраняют на устройстве для хранения информации на ЭВМ и приводятся в линейную по диагностическому параметру форму, и далее их обрабатывают согласно аппаратно адаптированному алгоритму способа таким образом, что сначала нормируют все измеренные характеристики, например, с использованием эталонов на пропускание, отражение, флуоресценцию и др. явлений конверсии ЛИ в диагностируемых объектах, с помощью которых находят соответствующие аппаратные функции для нормировки характеристик с помощью умножения на последние, и/или, например, в медицинской диагностике в случае экзокорпорального обследования, например, используя условие постоянства интегральной интенсивности отраженного в обратном направлении возбуждающего излучения, и/или используя условие постоянства интегральной интенсивности полосы комбинационного рассеяния воды при специально подобранной длине волны возбуждающего излучения, и/или используя условие постоянства интегральной интенсивности полосы флуоресценции добавляемых в образцы в стандартной концентрации квантовых точек и/или флуорофоров с узкополосной флуоресценцией, а при эндокорпоральном обследовании, используя условие постоянства какой-либо характеристики конверсии ЛИ в биологическом объекте (БО) либо линейного по характеристикам гомеостатического параметра биологического вида человека, и/или используют уровненную нормировку, учитывающую локальную величину на фоне общеорганизменного, по формуле

X_pi=X_ai/(1-α_i·X_эi),

где X_pi - уровненная характеристика конверсии, X_ai - экзокорпоральная абсолютная характеристика конверсии, Х_эi - эндокорпоральная относительная характеристика конверсии, α_i - коэффициент при i-й характеристике в выражении для гомеостатического параметра Р=Σα_k·I_k, и/или при этом и/или при других видах диагностик восстанавливают корректные спектры флуоресценции, используя ранее измеренные спектральные характеристики экстинкции с помощью измерительного тракта комплекса спектров реальной флуоресценции по формуле

X_{i corr}=X_i/(a₁+а₂·э_i+а₃·э_i ²),

где X_{i corr} - значение корректированной спектральной характеристики от i-го канала прибора, X_i - значение соответствующей спектральной характеристики без корректировки, a₁, a₂ и а₃ - поправочные коэффициенты, зависящие от геометрии образцов и способа сбора излучения, э_i - пространственный декремент затухания, обусловленный экстинкцией на i-й длине волны, дальше часть сохраненной спектральной информации для достаточно большого количества образцов органического вещества с заранее известным аналитическим содержимым используется для создания модели концентраций путем реализации, согласно аппаратно адаптированному алгоритму способа, процедуры регрессии аналитической информации на статистические главные компоненты спектральных характеристик этих образцов, а для остальных образцов неизвестное содержимое находится при вычислении согласно аппаратно адаптированному алгоритму способа, использующему полученную модель, и вычисленные количественные и/или качественные характеристики, которые могут характеризовать биологический или молекулярный состав, используют в целях промышленности, медицины, экологии, пищевых, биосферных, космических и др. технологий, при этом производят контроль за лечением до полного выздоровления в медицине и следят за циклами превращений БО в производстве, и в случае заканчивания цикла производства или при выздоровлении пациента диагностика прекращается, а также лечебно-диагностические установки используют для проведения радиационной терапии больных пациентов, также перед началом каждой серии диагностики измеряют характеристики эталонов сравнения и вносят их в ЭВМ для вычисления аппаратной функции, а образцы приготовляют, например, взятием некоторого количества исследуемого жидкого, твердого или газообразного объекта живой и/или неживой природы и помещением в стандартизованные кюветы для измерения спектров пропускания и лазерно-индуцированной флуоресценции и иных характеристик конверсии излучения лазерного или иного источника света, которые могут быть как большого объема, объемом приблизительно в несколько миллилитров, так и маленького, объемом приблизительно в доли микролитров и собранные на планшетную основу, содержащую также и проточную кювету, при этом также сюда могут входить интегрированные с планшетой устройства для фотоакустической, опто-термической, и др. диагностик, с помощью которых измеряют соответствующие характеристики конверсии излучения в помещенных в планшетные кюветы образцах, а для разбавленных растворов с исследуемым содержимым предварительно увеличивают концентрацию содержимого фильтрованием субстрата, с последующим определением концентрации и вида вещества, например на фильтре, а в случае неразделяемых объектов с пространственно-протяженной поверхностью часть измерений, связанных со световым откликом, выполняются непосредственно поднесением светособирающего устройства к поверхности органического вещества, и что в глобальном варианте реализации оптической диагностики с помощью дистанционных методов по измеряемым характеристикам конверсии излучения лазерного или другого источника определяют количественные и качественные параметры близких или удаленных проб, при этом диагностический комплекс стоит из единого блока анализа информации обрабатывающего спектры флуоресценции сразу нескольких блоков измеряющих эти спектры и передающих свою информацию для обработки блоку анализа по локальным или глобальным сетям связи с использованием стандартных протоколов, в том числе и протоколов шифрования, также и/или проводят реализацию индивидуально-нормированного диагностического диспансера, для чего измеряют спектральные и сигнальные характеристики конверсии оптического излучения в живом веществе каждого индивидуального организма в норме на разных стадиях его развития и заносят в базу данных головной ЭВМ, а потом используют для анализа, по приведенному выше принципу, и сравнения его результатов с анализом, сделанным в текущее время, и в случае отклонений текущих параметров диагностики как от индивидуальных, так и от коллективных диапазонов нормы делают диагноз о соответствующей вычисленному параметру патологии,

и тем, что в устройстве его реализации, содержащем кювету, к которой подвод возбуждающего излучения и отвод светового отклика идет по сложному оптоволоконному кабелю, который с первого конца выполнен многожильным, со второго конца для передачи возбуждающего излучения выполнен одножильным, жила которого переходит в центральные жилы первого конца, с третьего конца для передачи светового отклика в спектроанализатор выполнен многожильным, жилы которого переходят в периферийные жилы первого конца, второй конец сопряжен с выходом излучения лазера, а кюветы выполнены в форме, размерах и из материалов, определяемых конкретной задачей применения, при этом регистрирующую часть делают из матрицы полупроводниковых фотодетекторов, которые помещают и/или не помещают в термостат, охлажденный до низких температур, и/или многоканального фотоэлектронного умножителя, составленного по принципу конструкции фотоэлектронного умножителя жалюзийного типа с общим катодом и множеством анодов, соответствующих множеству каналов, количеством приблизительно 150-300, а измерения спектров пропускания проводят на спектроанализаторе, соединенном с одножильным световодом, который поставлен со стороны кюветы, противоположной стороне освещения источником полихроматического света, при этом дополнительно и/или отдельно измеряют спектральную флуоресцентную картину образца при помощи флуоресцентного микроскопа, снабженного проецирующей оптической частью, лазерным источником для возбуждения образца, светофильтром, поляризатором, диспергирующим элементом, окуляром для визуального контроля и/или без окуляра, высокочувствительной фотокамерой и устройством оцифровки сигнала и сопряжения с ЭВМ (PC), и система сбора флуоресцентного излучения, испускаемого диагностируемым образцом, может быть реализована в нескольких вариантах, например, представляющем простой торец оптоволоконного катетера, как для экзокорпорального, так и эндокорпорального применения, или, например, представляющем линзовую или зеркальную коллиматорную систему, которая позволяет собирать и фокусировать лучи, исходящие от сравнительно небольшого по размерам образца под разными углами, в торец приемного световода, или, например, представляющем диэлектрическую антенну, собранную из двух склеенных между собой диэлектрических пластин, одна из которых на внешней от первой пластины стороне имеет форму замедляющей волновой структуры, а граница раздела диэлектриков на одном краю пластины, где происходит максимальная фокусировка возбужденной поверхностной волны, переходит в оптоволокно, а также с целью увеличения собирательной силы антенны, в объеме второго диэлектрика располагают сеть тонких оптоволоконных жил, которые позволяют эффективно транслировать поверхностную волну в приемный световод, или, например, представляющем оптический резонатор, с возможностью вмещения в него образцов в кюветах, специальной формы, например эллипсоидальной с приемным окном световода около вершины большой полуоси, а кюветы для измерения характеристик флуоресценции и экстинкции содержимого в них выполнены в виде емкостей луночной формы с прозрачными стенками и объемами, например в десятые, в сотые доли миллилитра для визуального просмотра объектов живой и/или неживой природы и измерения характеристик конверсии, и расстояния между стенками кювет лежат в пределах, превышающих поперечные размеры микробов на 5-10% и/или в тысячные доли миллилитра для очень мутных объектов, и что для автоматизации и ускорения измерения больших партий образцов объектов живой и/или неживой природы кюветы равных и/или разных объемов 0.001-1 мл собирают в планшеты, а также кюветы выполняются с большим объемом, и/или дополнительно встроенными в планшеты, в том числе в проточном варианте, для измерения доступных в больших количествах образцов субстратов, также сюда могут входить интегрированные с планшетой устройства для фотоакустической, опто-термической и др. диагностик, с элементами сопряжения с ЭВМ, а также устройства для сбора интегрированного и/или неинтегрированного светового отклика, сопряжения с флуоресцентным микроскопом и механизмом горизонтального и вертикального перемещения планшеты, часть кювет в планшете при этом могут быть заполнены веществами, служащими эталонами, положительным, отрицательным и т.д.

Описание способа

Способ оптической диагностики живого вещества выполняют с помощью устройств, схема первого из которых приведена на фиг.1. Флуоресцентное устройство для диагностики снабжено интерфейсом для подключения ЭВМ. Оно реализуется с применением многоканальных светочувствительных элементов и аналогово-цифровых преобразователей, передающих спектральный сигнал с каждого канала, являющийся аналогом спектральной интенсивности на определенном участке спектра, на входной канал компьютера (интерфейс). Применение устройства в предложенном способе происходит при использовании соответствующего аппаратно-адаптированного алгоритма способа для установки лазерно-флуоресцентной диагностики (фиг.1), состоящей из лазера 17 с соответствующе подобранной длиной волны генерации, сложного оптического кабеля с волокнами для подвода возбуждающего излучения 11 к анализируемому образцу и снятия флуоресцентного отклика и подвода его к спектроанализатору 9, спектроанализатора 6, состоящего из оптического фильтра по длине волны возбуждения 11, диспергирующего элемента, и многоканального оптикоэлектронного детектора 3, усилителя электрического сигнала, аналого-цифрового преобразователя (2) и ЭВМ (1) с соответствующим аппаратно-адаптированным алгоритмом способа для обработки и хранения спектральной информации. Также для измерения спектра экстинкции субстрата используется источник немонохроматического (многочастотного) излучения 7. При применении планшетных кювет излучение лазера 17 проходит через выделенную ячейку планшеты, а световой отклик от ячейки 15 собирается на торце оптоволокна 12 и направляется на вход спектрофотометра 6, далее спектр оцифровывается и передается ЭВМ (1). Также на фиг.1 изображены следующие элементы: 4 - аналогово-цифровой преобразователь измерителя спектров пропускания, 5 - матрица полупроводниковых детекторов измерителя спектров пропускания, 8 - исследуемый образец, 13 - световодный оптический тракт измерителя спектров пропускания, 14 - планшета, 16 - проточная кювета планшеты. Планшета выполнена из оптически прозрачного материала и содержит на фронтальной поверхности несколько (2-500) углублений - кювет, с небольшим объемом порядка 0.1-0.001 миллилитра, причем часть из них может быть одинакового размера, а часть разного, а также может содержать проточную кювету, входной и выходной концы которой подсоединены к шлангам, сообщающимся с резервуаром входной жидкости и резервуаром для слива жидкости из кюветы и/или эталонную кювету с водой для калибровки спектров комбинационного рассеяния. Для измерения иных характеристик конверсии лазерного и/или оптического излучения используются соответствующие устройства для регистрации 19, сигнал с которых оцифровывается в АЦП 20 и подается на вход ЭВМ 1. Для сбора флуоресцентного излучения и передачи его по оптоволокну используется светособирающее устройство 18, варианты схем реализации которого приведены на фиг.2. В первом варианте светособирающее устройство представляет простой торец оптоволоконного катетера 7, который содержит центральную жилу, предназначенную для подвода возбуждающего излучения к образцу 1 и периферийные жилы для сбора и отвода флуоресцентного отклика 2. Во втором варианте светособирающее устройство представляет линзовую или зеркальную коллиматорную систему, позволяющую собирать и фокусировать лучи, исходящие от сравнительно небольшого по размерам образца 1 под разными углами, в торец приемного световода 2. Эта система состоит из зеркала 3 и одной линзы 4 или из двух линз 4 и/или без зеркала 3, собранных так, что происходит фокусировка флуоресцентного излучения образца 1 в приемное окно световода 2. В третьем варианте светособирающее устройство представляет диэлектрическую антенну 5, собранную из двух склеенных между собой диэлектрических пластин с разными показателями преломления n1 - 1 и n2 - 2, одна из которых на внешней от первой пластины стороне имеет форму замедляющей волновой структуры (фиг.3). Граница раздела диэлектриков на одном краю пластины, где происходит максимальная фокусировка возбужденной поверхностной волны, переходит в оптоволокно. Также с целью увеличения собирательной силы антенны, в объеме второго диэлектрика располагают сеть тонких оптоволоконных жил 3, которые позволяют эффективно транслировать поверхностную волну в приемный световод 4 (фиг.3). С помощью такого устройства можно сбирать флуоресцентное излучение как с объектов с большой поверхностью (стол, стена, поверхность инструментов и кожи), так и с небольших образцов флуоресцирующих жидкостей. В четвертом варианте светособирающее устройство (фиг.2) представляет оптический резонатор 6 с возможностью вмещения в него образцов 1 в кюветах приспособленной для этого формы 1. Резонатор выполнен специальной формы, обеспечивающей более эффективный сбор и передачу излучения в приемное окно световода 2, например, в форме эллипсоида 6 с зеркальной внутренней поверхностью, к которому световод подводится к вершине большой полуоси эллипсоида.

Многоканальный оптикоэлектронный детектор выполняется в нескольких вариантах. В первом варианте это многоканальная матрица полупроводниковых фотодетекторов. Во втором варианте это многоканальная матрица полупроводниковых фотодетекторов, помещенная в охлаждаемый термостат с низкой температурой. Это позволит достичь большей устойчивости к собственным тепловым шумам. В третьем варианте это многоканальный фотоэлектронный умножитель, выполненный по принципу фотоэлектронного умножителя жалюзийного типа (фиг.4). Он содержит один удлиненный фотокатод 1 и множество анодов 2, количеством, соответствующим количеству каналов регистрации, примерно 150-300. Между анодом и катодом расположена система динодов 3, состоящих из металлических пластин, наклоненных под оптимальным углом к плоскости катода, причем пластины стоящих непосредственно друг над другом динодов отклонены в противоположные стороны. В рабочем состоянии на диноды подается каскадное напряжение, умножающее фототок каждого канала. Количество пластин на динодах на один больше количества анодов.

Для проведения диагностики необходимо выполнить коррекцию спектров флуоресценции с использованием спектров экстинкции, поскольку из-за поглощения и рассеяния света в субстрате интенсивность флуоресценции снижается, а спектр при этом еще и меняет форму. Коррекцию спектров проводят по формуле (1).

где X_{i corr} - значение корректированной спектральной характеристики от i-го канала прибора, X_i - значение соответствующей спектральной характеристики без корректировки, а₁, а₂ и а₃ - поправочные коэффициенты, зависящие от геометрии образцов и способа сбора излучения, э_i - пространственный декремент затухания, обусловленный экстинкцией на i-й длине волны.

Кюветы могут быть сделаны как относительно большого, так и небольшого объема и выполнены заключенными в защитный кожух, который светонепроницаем, очернен с внутренней стороны и имеет только крышку для помещения и удаления образцов, отверстия для входного и выходного шланга проточной кюветы и разъемы для соединения со световодным и/или проекционным трактом передачи световой информации. Например, для обнаружения клеток микробов в малых концентрациях применяют тонкие кюветы объемом в несколько сотых долей миллилитра. А для субстратов с большими концентрациями используют кюветы объемом до тысячной доли миллилитра. Такие небольшие, как одинаковые, так и неодинаковые по объему кюветы можно собрать на одной планшетной основе, располагая кюветы в матричном порядке. При этом расстояние между прозрачными стенками кюветы может быть не более чем на 5-10% больше размеров исследуемого микроба и/или микробов, что дополнительно повышает точность измерения концентраций и видов микробов, и кроме этого позволяет получать истинные характеристики флуоресценции микробов без вклада спектра рассеивающей среды, особенно в субстратах с малой их концентрацией, например 10¹-10³ КОЕ/мл, где КОЕ - количество колониеобразующих единиц микробов при их высеве на питательные среды на 1 мл исследуемого субстрата и/или взвеси микробов.

Можно применить специальную планшетную технологию (фиг.12), реализованную в виде лунок 3…4, вырезанных на кварцевой пластине 2, которые изготовляются с одинаковыми и неодинаковыми размерами, такими как различная и одинаковая поперечная площадь или одинаковая и различная высота, а также из прикрывающей сверху пластины 1. Данная технология обладает многими преимуществами по сравнению с подобными технологиями. Например, простота при приготовлении измеряемых субстратов на ней и при очистке, когда содержимое легко смывается водой или спиртом. Также при одинаковых поперечных площадях лунок легко реализовать стандартизацию результатов измерений. Например, при измерении отклика пространственно-интегрирующими устройствами, такими как микроскоп, измеренную величину нормируют на объем лунки:

Х_н=X/V,

где Х_н - нормированная величина, Х - величина без нормировки, V - объем лунки. А, например, при измерении оптоволоконным катетером, поднесенным к поверхности пластины 1, и при равномерном освещении лунки лазером, измеренную величину нормируют так:

Х_н=Х·h/V,

где h - толщина пластины 1. При измерении оптоволоконным катетером, поднесенным к поверхности пластины 1, и освещении лунки из выходного окна катетера измеренную величину нормируют так:

Х_н=X·h³/V.

Измерения флуоресценции дополнительно и/или отдельно проводят на флуоресцентном микроскопе, схема которого показана на фиг.5. Здесь поляризованное излучение, например, эксимерного лазера 8 направляют в кювету 7 с исследуемым образцом 6. Излучение флуоресценции от единичной бактерии через поляризатор 5 и спектральный фильтр 4 попадает в микроскоп 3, снабженный, например, камерой 2. RGB сигнал камеры служит набором характеристик исследуемого образца, фильтра и длины волны возбуждения. Компьютер, на вход 1 которого подается сигнал от CCD камеры 2, сравнивает этот сигнал с имеющейся библиотекой и определяет вид бактерии. Зная объем кюветы и сосчитав «поштучно» бактерии, вычисляют их концентрацию. В некоторых случаях степень деполяризации может уточнить и дополнить спектральный сигнал.

Для измерения спектральных характеристик флуоресценции и экстинкции водных сред с низкой концентрацией микробов применяют предварительное обогащение субстрата диагностируемым конституентом при прогонке большого объема водной среды через фильтр. При этом на фильтре остаются микробы, которые либо снимают и растворяют в воде до необходимых концентраций и помещают в кюветы для измерения, либо все диагностические измерения проводят непосредственно на фильтре, и зная, например, объем прошедшей через него жидкости, скажем воды, легко пересчитать полученные результаты диагностики концентрации вида микроба или микробов на единицу обследуемого общего объема жидкости, например воды.

Второе устройство, которое используют в качестве опционального источника диагностической информации в предполагаемом способе, представляет собой аппаратурный узел для измерения фотоакустичксого эффекта, состоящий из стандартного набора комплектующих его устройств. В его состав входят лазер и фотоакустическая ячейка. Кювету с исследуемым веществом помещают в ячейку, включают лазерный импульс и измеряют фотоиндуцированный акустический отклик. Полученный сигнал оцифровывают и заносят в базу данных на ЭВМ. Если сигнал по техническим или иным причинам оказывается нелинейно-искаженным, его предварительно линеаризуют, используя предварительно измеренную аппаратную функцию.

Третье устройство, которое используют в качестве опционального источника диагностической информации в предполагаемом способе, представляет собой аппаратурный узел для измерения опто-термического эффекта. Это устройство выполняется в стандартном варианте. Снимаемый сигнал переводится путем преобразования на ЭВМ в линейный формат данных и заносится в базу данных.

Четвертое устройство, которое используют в качестве опционального источника диагностической информации в предполагаемом способе, представляет собой аппаратурный узел для измерения линий комбинационного рассеяния лазерного излучения. Это устройство тоже выполняется в стандартном варианте. Снимаемый сигнал переводится путем преобразования на ЭВМ в линейный формат данных и заносится в базу данных.

Также с целью получения диагностической информации об исследуемом объекте могут быть дополнительно использованы устройства, принципы и методы работы которых основаны на измерении одного или нескольких из остальных эффектов конверсии электромагнитного излучения в иные формы энергии внутри объекта при соответствующем объекте. Получаемый при этом сигнал оцифровывается и поступает на порт ввода/вывода ЭВМ. На ЭВМ с помощью аппаратно-адаптированного алгоритма способа сигнал преобразуется в линейную по количественным внутренним параметрам объекта форму.

Способ позволяет нормировать измеряемые спектральные характеристики без использования дополнительных устройств нормировки, так как объектом и средством нормировки является сама водная среда исследуемого субстрата и/или вводимые в нее квантовые точки, при применении предложенных способов нормировки. Также можно в начале каждой серии измерений вычислять аппаратные функции для нормировки всех показаний приборов. Для этого измеряют соответствующие характеристики конверсии ЛИ в эталонах и, используя полученные характеристики, вычисляют поправки на аппаратную функцию, используя критерий необходимости постоянства данных характеристик во времени для эталонов.

Для нормировки на абсолютные и относительные величины результатов измерений характеристик конверсии ЛИ в БО и их НК используют два типа калибратора: эндокорпоральный и экзокорпоральный. В первом случае все измеренные характеристики нормируются с учетом соответствующих поправочных коэффициентов на какую-либо индивидуально выраженную и регистрируемую внутреннюю характеристику или на гомеостатический параметр конверсии ЛИ (опто-термическую, фотоакустическую, флуоресцентную, комбинационную и др.), которые пропорциональны интенсивности ЛИ в каждом локальном участке БО как в норме, так и при патологии (а также с учетом предыстории этих параметров до и во время возникновения патологии), при этом непосредственные характеристики нормируются, приводятся к линейному по диагностическому параметру виду:

Х_эi=I_i/Р, P=Σα_k·I_k,

где Х_эi - нормированная величина характеристики, I_i, I_k - непосредственные показания прибора, приведенные к линейному по диагностическому параметру виду, Р - нормировочный коэффициент, определяемый в общем случае в виде суммы от измеряемых величин I_k, умноженных на весовые коэффициенты α_k, находимых по алгоритму, описанному ниже, в результате статистических исследований на определение, например, гомеостатического параметра биологического вида, или другого не меняемого от индивидуальностей константного параметра, i, k - порядковый номер характеристики.

Во втором случае все измеренные характеристики во время экстракорпорального обследования нормируются и корректируются по абсолютным величинам с использованием характеристик конверсии ЛИ в исследуемом объекте как внутреннего источника (нативные молекулы, клетки), так и внешнего источника конверсионного сигнала (флуоресцирующие добавки, квантовые точки, различные эталоны и т.д.), а также вычитанием фоновых эффектов (от прибора, пробирки), что определяется по формуле вида:

X _ai=(I_i-I_iф)/Р,

где X_ai - абсолютная величина характеристики, I_iф - показания прибора на фоне.

Можно использовать уровненную количественную величину, полученную с учетом обеих вышеперечисленных поправок, позволяющую рассматривать локальные изменения характеристик на фоне общеорганизменного:

X_pi=X_ai/(1-α_i·Х_эi),

где X_pi - уровненная величина характеристики.

Для объективной диагностики вида и концентрации химических компонент или микробов с целью нормировки спектров используют несколько способов, в зависимости от специфики субстрата. Используют нормировку на интенсивность отраженного возбуждающего излучения, прошедшего по измерительному тракту и давшему свой вклад в общий спектр светового отклика субстрата. Нормировочный множитель равен обратной интегральной интенсивности отраженного возбуждающего излучения. Так же используют нормировку по интенсивности полосы комбинационного рассеяния молекулами воды лазерного излучения. Этот способ нормировки дает наиболее точный нормировочный множитель, поскольку интенсивность полосы комбинационного рассеяния пропорциональна лишь интенсивности лазерного излучения в субстрате. Нормировочный множитель равен обратной интегральной интенсивности полосы комбинационного рассеяния молекул воды. Для нормировки сигнала можно вместо спектров комбинационного рассеяния использовать спектр Релеевского рассеяния молекул воды, но при этом значительно труднее исключить вклад самого лазерного излучения (бликов). Еще применяют нормировку с использованием флуоресцентных или люминесцентных добавок со стандартной концентрацией непосредственно в субстрате. Этот метод нормировки тоже достаточно точен. При этом требуется применение квантовых точек или флуорофоров с узкими спектральными полосами флуоресценции. Нормировочный множитель равен обратной интегральной интенсивности полосы флуоресценции добавки.

Аппаратно-адаптированный алгоритм способа основан на методе концентраций, позволяя на основе сравнения базы данных и полученных спектров оценивать качественный и количественный состав биологических и химических компонент содержимого диагностируемого вещества в виде концентрации микроорганизма и его видовой принадлежности. Этот алгоритм позволяет проводить количественный специфический анализ микробосодержащего биологического субстрата и растворенных в нем элементов по их спектральной информации посредством реализации линейной регрессии на главные компоненты (ГК) спектральных характеристик. ГК и коэффициенты регрессии хранятся в базе данных и являются статической, исходной информацией в ходе процедуры диагноза. Сигнал, полученный в результате флуоресцентной диагностики, является спектром на заданном диапазоне длин волн и заданным шагом дискретизации. Сигнал для остальных методов, применяемых в способе, тоже можно представить в виде набора данных, как многомерной векторной величины (размерность при этом равна количеству дискретных значений в данных) или спектра.

В основу метода концентраций была положена феноменологическая модель характеристик конверсии ЛИ в образце как суммы соответствующих характеристик молекулярных или иных компонент. Согласно ей, в образцах биологического субстрата присутствуют несколько общих для всех образцов видов таких компонент. При возбуждении излучением красного диапазона этими компонентами, например флуорофорами или хромофорами, обычно являются порфирины. Считаем, что характеристики, снятые в образце, в первом приближении является суммой характеристик содержащихся компонентов. В результате анализа спектров флуоресценции или других характеристик конверсии ЛИ мы получаем дискретный набор интенсивностей флуоресценции или иного измеряемого явления, испускаемых образцами на различных длинах волн. Предполагаем, что любой анализируемый спектр является сверткой нескольких спектров, создаваемых различными компонентами в исследуемом образце. Тогда любое значение интенсивности для каждого образца из этого набора согласно модели является суммой спектральных интенсивностей флуоресцирующих или иных компонент, умноженных на их концентрационные коэффициенты

где x_sj - дискретная спектральная интенсивность s-го образца на j-й длине волны, y_kj - дискретная интенсивность k-го компонента на j-й длине волны, c_sk - концентрационный коэффициент, пропорциональный количественной мере присутствия k-го компонента в S-ом образце.

Компонентой может быть и отдельная молекула, и целая биологическая клетка, например клетка микроба. В терминах линейной алгебры спектральные интенсивности образцов представляют собой координаты соответствующих этим образцам векторов в многомерном пространстве, размерность которого определяется числом шагов дискретизации в данных исходных спектров. При таком представлении спектральной информации дискретные спектральные интенсивности компонент y_kj определяют базисные вектора, по которым раскладываются векторы характеристик образцов. Это обстоятельство базисности объясняется тем, что множество векторов образцов входит в линейную оболочку векторов компонент y_kj, поскольку вектора y_kj имеют ту же размерность, что и x_sj, и они полностью исчерпывают возможные варианты построения суммарных спектров флуоресценции, считая при этом, что компоненты присутствуют во всех образцах и только эти компоненты в них присутствуют.

Для устойчивости модели, а также ее универсальности эти базисные вектора находятся не для исходного пространства спектральных характеристик, размерность которого относительно большая, а для пространства параметров пониженной размерности, которое находится с помощью статистического факторного анализа или анализа главных компонент спектральных интенсивностей флуоресценции или иного явления некоторого большого количества образцов с известным содержимым. Такое предварительное преобразование данных необходимо, поскольку вследствие большой схожести спектров флуоресценции таких объектов задача нахождения базиса осложняется из-за вычислений в области, близкой к сингулярности. Такое поведение спектральных характеристик не позволяет находить направления базисных векторов, устойчивых к шумам, обусловленных вкладами аппаратных шумов спектрометра в отдельно взятой ячейке оптико-электронного детектора. Но переход к статистически устойчивым параметрам флуоресценции, являющиеся, к примеру, главными факторами характеристик, вместо пространства зашумленных отдельных спектральных интенсивностей, позволяет обойти такую опасность. Разбиение вектора признаков на факторные и случайные составляющие есть конечный результат циклического итерационного алгоритма, последовательно осуществляющего в каждом цикле расчетов декомпозицию матрицы данных на структурную часть и шум:

Здесь Х - матрица данных, F - матрица, задающая факторы объектов в базисе главных компонент, Q - матрица с размерностью (J×P), являющаяся транспонированной матрицей нагрузок, Е - матрица остатков. При этом алгоритм предполагает исходный набор признаков центрированным, т.е. имеющим нуль системы координат пространства признаков в центре статистического разброса. Предполагается, что вектор остатков е=(е₁,е₂,…,e_k) подчиняется р-мерному нормальному распределению с нулевым вектором средних значений и диагональной ковариационной матрицей V_e.

Для проведения факторного анализа для модели концентраций предварительно систему координат центрируют путем переноса начала координат в точку, определяемую вектором признаков, усредненным по всем образцам, и проводят анализ главных компонент. Далее найденные факторы используют для отыскания регрессионных коэффициентов на шкалы концентраций при реализации регрессии методом наименьших квадратов для экспериментальных точек, соответствующих образцам из эталонной выборки. Это значит, что в модели

где r_0i и r_pi - регрессионные коэффициенты для i - й биологической компоненты (вид микроба), по известным c_si и f_sp ищутся коэффициенты r₀₁ и r_pi с наиболее лучшей аппроксимацией данной модели для всех образцов из эталонной выборки с помощью метода наименьших квадратов.

Результатом регрессии на главные компоненты является градуировочная матрица, с помощью которой можно провести проецирование вектора характеристик (дискретный набор спектральных интенсивностей флуоресценции образца) на шкалы концентраций флуорофорных компонент. Матрица определяются при процедуре регрессии главных факторов на матрицу концентраций компонент этих образцов, т.е. микробов.

где W - градуировочная матрица размерами J×I, С - матрица концентраций размерами S×I, элементами которой являются концентрации флуорофорных компонент с номерами i в образцах из эталонной выборки с номерами s. Процедура регрессии главных факторов на шкалы концентраций позволяет находить градуировочную матрицу и на основе ее вычислять (прогнозировать) концентрации отдельных видов микробов по следующей формуле

Здесь c_i - концентрация i-го компонента (вида микроба), w_oi - значения нулевых коэффициентов регрессии, m_j - значения компонент вектора, переводящего значения компонент вектора признаков x_j диагностируемого образца в центрированную систему координат признаков. Математическое решение задачи распознавания как реализации регрессии на главные компоненты решается в два этапа: ищется пространство линейных характеристик (факторов) исходных признаков (спектры), имеющих наибольший уровень статистической значимости, и внутри данного пространства находятся вектора, отвечающие независимым вкладам аналитических компонент в данные характеристики. Вычисления количественной меры вклада от каждой аналитической компоненты (концентрации компоненты) находятся проекцией вектора линейных статистических характеристик флуоресценции или иного явления на вектор данной аналитической компоненты в пространстве пониженной размерности.

На фиг.13 представлена общая схема проведения диагностики и мониторинга по предлагаемому способу, что позволяет определять патологию и производить контроль за лечением до полного выздоровления в медицине, и следить за циклами превращений БО в производстве, а также в других областях применения. Схема в общей сложности показывает основные этапы аппаратно адаптированного алгоритма способа. Общая схема реализации алгоритма способа. Обозначения: 1 - экстракорпоральное измерение характеристик конверсии ЛИ в БО (кюветный и планшетный технологии), 2 - эндокорпоральное измерение характеристик конверсии ЛИ в БО с использованием различных сигналособирающих устойств, 3 - нормировка на абсолютные величины, 4 - постановка диагноза и накопление данных по мониторингу процесса лечения или преобразовывания объекта в процессе циклов производства, наблюдения экологии и т.д., 5 - конец, 6 - архив БД.

Вычисленные количественные и качественные характеристики образцов используются, например, при медицинской дифференциальной диагностике заболеваний микробной природы, когда компонентной является целая клетка патогенного микроорганизма в пробах, взятых у больных пациентов. В промышленности этот способ может использоваться для оптического метода контроля производства биологических и химических веществ, связанного с биотехнологиями. В экологии - для контроля, например, чистоты питьевой воды, зараженности естественных и искусственных водоемов, диагностики заболеваний флоры. В пищевой промышленности способ используют для контроля производства, связанного с эксплуатацией культур микроорганизмов, или для контроля качества пищевых продуктов. Здесь компонентой является как целая клетка микроорганизма, так может являться и молекула токсина.

На основании приведенных аппаратных и методологических элементов реализации оптической диагностики живого вещества можно организовать следующее техническое решение, позволяющее исследовать живое вещество для нужд медицинской и др. диагностики. Это система глобальной диагностической сети, состоящей из единого блока анализа информации, обрабатывающего совокупность спектров сразу нескольких блоков измеряющих эти спектры и передающих свою информацию для обработки блоку анализа по локальным или глобальным сетям связи с использованием стандартных протоколов, в том числе и протоколов шифрования. См. схему сетевой мультитерминальной компьютеризированной системы индивидуальной экспресс-диагностики и экспертной оценки эффективности реабилитации и лечения больных с заболеваниями и процессами микробной природы и для системного изучения человека в индивидуальном порядке (фиг.8. Сетевая мультитерминальная компьютеризированная система индивидуальной экспресс-диагностики и экспертной оценки процессов. Обозначения: 1 - отраслевые объекты медицинского приложения, 2 - отраслевые объекты промышленного приложения, 3 - отраслевые объекты пищевого приложения, 4 - головной центр экспертной системы диагностики и контроля процессов, 5 - отраслевые объекты экологического приложения, 6 - отраслевые объекты космического назначения, 7 - отраслевые объекты биосферного назначения), (фиг.9. Сетевая мультитерминальная компьютеризированная система индивидуальной экспресс-диагностики и экспертной оценки эффективности лечения заболеваний и процессов микробной природы, и для системного изучения человека в индивидуальном порядке. Обозначения: 1 - базовый центр акушерства, 2 - базовый клинический центр гинекологии, 3 - базовый клинический центр гастроэнтерологии, 4 - базовый клинический центр педиатрии, 5 - базовый клинический центр стоматологии, 6 - базовый клинический центр терапии, 7 - пункты прижизненной индивидуальной диспансеризации населения по способу и сбора информации об индивидуальных заболеваниях, 8 - компьютерный блок, 9 - измерительный диагностический узел аппаратуры для оптического исследования медицинских, промышленных, пищевых и экологических объектов, 10 - реализация для интракорпорального обследования, 11, 14 - устройство для флуоресцентной диагностики, 12, 15 - устройство для ФА диагностики, 13 - реализация для экстракорпорального обследования, 16 - гастроэнтерология, 17 - хирургия, 18 - терапия, 19 - педиатрия, 20 - стоматология, 21 - удаленный локальный клинический объект, 22 - мобильное средство персональной диагностики со средством портирования с головной ЭВМ, 23 - библиотека микробов (музейные штаммы), библиотека микробов (клинические штаммы). Смеси, дифференциальная диагностика, банк данных по предпочтительному антимикробному препарату) также диагностики для промышленности (фиг.10. Сетевая мультитерминальная компьютеризированная система индивидуальной экспресс диагностики для промышленности, пищевых технологий, экологии и др. назначений. Обозначения: 1 - базовый центр промышленной микробиологии, 2 - базовый центр промышленных биотехнологий, 3 - базовый центр сельского хозяйства, 4 - базовый центр химического производства, 5, 6 - компьютерный блок, 7 - измерительный диагностический узел аппаратуры для оптического исследования медицинских, промышленных, пищевых и экологических объектов, 8 - устройство для флуоресцентной диагностики, 9 - устройство для ФА диагностики, 10 - удаленный локальный объект промышленной микробиологии, 11 - удаленный локальный объект сельского хозяйства, 12 - удаленный локальный объект химического производства, 13 - база данных по промышленным объектам), экологии (фиг.11. Сетевая мультитерминальная компьютеризированная система индивидуальной экспресс-диагностики для промышленности, пищевых технологий, экологии и др. назначений. Обозначения: 1 - базовый центр городской экологии, 2 - базовый центр технической экологии, 3 - базовый центр экологии моря, 4 - базовый центр контроля природопользования, 5, 6 - компьютерный блок, 7 - измерительный диагностический узел аппаратуры для оптического исследования медицинских, промышленных, пищевых и экологических объектов, 8 - устройство для флуоресцентной диагностики, 9 - устройство для ФА диагностики, 10 - удаленный локальный объект городской экологии, 11 - удаленный локальный технической экологии, 12 - удаленный локальный объект экологии моря и др., 13 - база данных по промышленным объектам), пищевых технологий и др. назначений.

Система состоит из единого сервера и удаленных локальных объектов (фиг 8). Сервер содержит систематизированные библиотеки микробов как музейных, так и клинических штаммов, также базу данных по промышленным, пищевым и экологическим объектам, и аппаратно адаптированный алгоритм способа, проводящий диагностику и дающий рекомендации по лечению. Клиентами являются диагностические комплексы на удаленных локальных клинических, целевых промышленных (экологических и др.) и мобильных объектах. Часть клиентов выступает в качестве потребителя информационных возможностей сервера и поставщика дополнительной уточняющей информации по изменчивым видам микроорганизмов (базовые центры).

В централизованную основу системы положена возможность взаимодействия лечебно-диагностических установок в разных учреждениях, находящихся в удаленных географических областях, с головной ЭВМ системы посредством всемирной глобальной сети Интернет. Для этого на соединенных с глобальной сетью ЭВМ лечебно-диагностических установках поставлен аппаратно адаптированный алгоритм способа, производящий связь с сервером головного ЭВМ по стандартным протоколам. ЭВМ удаленных диагностических установок имеют интерфейс для управления комплексом и для управления взаимодействием с головным ЭВМ для обработки диагностической информации. В результате передачи обработанной информации пославшему запрос об обработке удаленному клиенту на экране ЭВМ диагностического комплекса высвечивается результат диагностики и основные рекомендации по лечению пациента, проба которого была исследована. Далее, например, по наблюдениям за процессом лечения оператор диагностического комплекса вводит и направляет на головную ЭВМ записи о прохождении лечения. На основании этой дополнительной информации сервер головного ЭВМ производит корректировку и отправление удаленному клиенту обновленных рекомендаций, что дает возможность улучшить условия лечения а также реализовать экспертную оценку эффективности реабилитации и лечения больных с заболеваниями и процессов микробной природы.

Головная ЭВМ сетевой системы индивидуальной экспресс-диагностики представляет собой базу для обработки и хранения диагностической информации, поступающей от диагностических комплексов в удаленных географических зонах. Также головная ЭВМ содержит диагностические библиотеки микробов как музейных, так и клинических штаммов, а также смесей микробов и фоновых вариантов распространенных биологических субстратов, как чистых, так и зараженных микробами. Кроме того, на ней содержится база данных по остальным, перечисленным в данном предлагаемом изобретении. Такие библиотеки аппаратно-адаптированным алгоритмом способа головной ЭВМ для проведения диагностики и вычисления предварительной статической информации, также используемой в процессе диагностики. Дополнительно на ней хранится банк данных по предпочтительному антимикробному препарату для каждого вида штаммов и с предпочтительным учетом индивидуальной специфики объекта. Библиотеки микробов могут пополняться за счет получения информации о новых видах микробов и за счет проведения измерений клинических микробов на некоторых удаленных клинических центрах. Аппаратно-адаптированный алгоритм способа головной ЭВМ состоит из частей, отвечающих за передачу и прием информации от удаленных клиентов, из частей, обслуживающих библиотеки микробов и банк данных по антимикробным препаратам и из части, проводящей вычисления диагностической информации, выбор антимикробного препарата и экспертную оценку эффективности реабилитации и лечения, а также осуществляющего корректировку диагностических критериев. Процесс работы головной ЭВМ корректируется операторами в нужное время.

Часть клинических объектов выступает в качестве базовых клинических центров, где проводятся специальные наблюдения за диагностикой клинических микробов и за процессами реабилитации и лечения больных с заболеваниями и процессами микробной природы. Эти базовые центры осуществляют процесс проверки резистентности клинических штаммов к антимикробным препаратам и их действенности последних, проверку действия данных препаратов на микробы внутри организма больного и выявления микроба, ставшего причиной болезни. Такая система обеспечит своевременное выявление возбудителей заболевания и оценку ареала распространения микроба. На базовом центре по исследованию промышленных, пищевых и экологических объектов проводят основные специальные наблюдения за образцами указанных объектов с целью пополнения базы данных по данным объектам.

На основе приведенной выше системы можно реализовать индивидуально нормированный диагностический диспансер. Идея такого диспансера состоит в применении, при диагностике, индивидуальных количественных и качественных критериев для каждого человека. Содержание тех или иных веществ, населенность микроорганизмами полостей, состояние и структура тканей в норме и патологии различны, что дает стимул для создания новой комплектационной парадигмы «норма-норма» и методов реализации ее рекомендаций. Для этого измеряют спектрально-сигнальные характеристики конверсии оптического излучения в живом веществе каждого индивидуального организма в норме, т.е. во время отсутствия болезней, на разных стадиях его развития. Измеренные данные заносят в базу данных головной ЭВМ, а потом используют как для анализа, по приведенному выше принципу, и сравнения его результатов с анализом, сделанным в текущее время. В случае отклонений текущих параметров диагностики как от индивидуальных, так и от коллективных (по принципу народности, географии, и вообще человечества в целом) диапазонов нормы делают диагноз о соответствующей вычисленному параметру патологии. Также на основе статистического анализа проводят прогнозирование вероятностей возникновения тех или иных заболеваний в будущем для каждого организма.

Положительный эффект.

Данное техническое решение обладает следующими преимуществами (возможности и перспективы):

- скрининг - при экспресс-оценке инфекционных заболеваний (туберкулез, СПИД, сифилис, холера и др.),

- диспансеризация населения с целью выявления заболеваний и процессов микробной природы и регистрации фоновых (контрольных) показателей различных биологических жидкостей (моча, слюна, кровь и др.) для создания паспорта здоровья населения,

- население получает современную высокоэффективную, экологически чистую технологию без применения расходных материалов и экономическую выгоду (стоимость одного анализа в 10-100 раз дешевле стандартных применяемых аналогов),

- экспресс-диагностика и оценка эффективности лечения дисбактериоза (страдает 90% населения),

- самообучаемость системы с получением новых информативных возможностей, учитывающих изменения видов микроорганизмов в медицинских учреждениях, находящихся в разных климатических, экологических и географических условиях, экономическая целесообразность и существенное сокращение расходов на диагностику вследствие централизованности системы,

- возможность реализации системы индивидуального наблюдения, диагностики и прогнозирования каждого человеческого организма начиная с момента рождения и до текущего на основе данного технического решения и комплектационной парадигмы «норма-норма»,

- в промышленных, пищевых и экологических отраслях реализуется принцип кумулятивности данных диагностики.

В состав диагностического комплекса входит универсальное оптическое флуоресцентное устройство определения видовой экспресс индикации и дифференциальной диагностики микробов при различных нозологиях. Это устройство представляет собой флуоресцентный микроскоп, содержащий диспергирующий элемент и приемную CCD камеру, а также лазеры для возбуждения флуоресценции в образцах, включая эксимерные лазеры. Предметный столик микроскопа имеет крепление для стандартизованных емкостей, предназначенных для помещения в них диагностируемого биологического субстрата. Дополнительно микроскоп имеет окуляр для визуального контроля за процессом снятия данных. Приемная CCD камера микроскопа передает по кабелю флуоресцентное изображение на порт ЭВМ диагностического комплекса, где аппаратно-адаптированный алгоритм способа проводит дальнейшее обслуживание этой информации.

Примеры применения

Пример 1.

Представленный пример иллюстрирует одно из направлений широкого круга возможностей применения предложенного способа в медицине, промышленности и пищевых биотехнологиях. Для получения достоверных данных об исследуемом микробосодержащем объекте необходимо иметь четкое представление о его характеристиках поглощения, рассеяния, а также о вероятной концентрации в нем тех или иных флуоресцирующих веществ. Поэтому для повышения точности определения микробов и их концентраций в смесях по данному методу были проведены измерения спектров пропускания образцов, с помощью которых корректировали (восстанавливали) спектры лазерно-индуцированной флуоресценции тех же образцов. На основе восстановленных спектров вычисляли концентрацию в образцах, обработанных детергентом.

Таблица концентраций для двух образцов смесей микобактерий, вычисленных с учетом характеристик рассеивания и поглощения.

  1 2 3 4 5 6 321.8 -129.62 287.45 602.29 -130.64 7 260.35 301.79 184.65 460.69 -17.75

(Обозначения: 1 - М. Avium (Mb.a), 2 - M. Vaccae (Mb.v), 3 - Tuberculosis(H37) (Mb.h), 4 - M. Intracellulare (Mb.i), 5 - M. Kansasii (Mb.k). Сверху по горизонтали показаны виды вычисляемых микобактерий, справа по вертикали показаны образцы смесей бактерий (6 (Mix 1): Mb.a. (1)+Mb.h. (3)+Mb.I. (4), 7 (Mix 2): Mb.a. (1)+Mb.b. (2)+Mb.I. (4))).

Данные микробиологического описания дают следующие результаты о составе смесей (справа от знаков двоеточия показаны номера смесей, слева - присутствующие в смеси микобактерии, краткие обозначения которых разделены союзом и):

Mix 1: Mb.a. и Mb.h. и Mb.I.

Mix 2: Mb.a. и Mb.b. и Mb.I.

Из таблицы следует, что вычисленные концентрации микобактерий в смесях Mix1 и Mix2 имеют согласование с микробиологическими данными. Видно, что в первой смеси большее нуля значение концентрации имеют микобактерий Mb.a, Mb.h и Mb.I, а во второй смеси наблюдаются микобактерий Mb.a, Mb.b и Mb.I. что находится в полном согласии с перечисленным списком. Такое хорошее вычисление количественной характеристики происходит благодаря учету оптических свойств субстрата для бактерий.

Пример 2.

Были также исследованы образцы и микс-системы микробов, выращенных на неселективной среде. Смыв со среды разбавили в физрастворе и поместили в планшетные кюветы, имеющие объем 0.01 миллилитра. Далее кювету поместили в крепление флуоресцентного микроскопа, в которой его флуоресценция возбуждалась излучением KrF-эксимерного лазера, с длиной волны генерируемого излучения 248 нм. Спектр излучения лазера отсекали стандартные пробные стеклянные пластинки микроскопа, так как их пропускание начинается примерно с 310 нм. При помощи оптической системы и хроматической диспергирующей системы и CCD камеры микроскопа были выдержаны и оцифрованы флуоресцентные изображения локального участка кюветы с образцом, которые показаны на фиг.7 (Флуоресцентные изображения микробов в смеси, выполненные в трех разных спектральных интервалах: 1-400 нм, 2-500 нм и 3-600 нм. По этим изображениям заметна колония микобактерий туберкулеза в левой нижней части, поскольку имеет отличающиеся от других микробов по интенсивности и цвету флуоресцентные рисунки).

Внизу каждого снимка показаны длины волн, являющиеся областью спектральных диапазонов фиксированного CCD-камерой излучения. Далее результаты измерения обрабатывались с помощью аппаратно-адаптированного алгоритма способа для дифференциальной диагностики, в результате чего были идентифицированы микробы вида Мус.Tuberculosis H37. На снимках они образуют колонию в нижней левой части экрана. Эти эксперименты носят предварительный характер.

Пример 3.

На объект исследования под названием хирургия имеется банк данных микробов хирургических заболеваний в области пульмонологии. При этом он включает характеристики микробов, зарегистрированных с помощью устройства измерения флуоресценции и конверсии лазерного излучения. Эти компоненты включены в программный продукт, и они являются одномоментными и объектами сравнения при диагностике и идентификации возможного этиологического фактора, встречающегося в данном заболевании. В частности, при постели больного А. с заболеваниями легких с подозрением на пневмонию (двусторонняя крупозная пневмония) исследуют и регистрируют характеристики соответствующими устройствами. Затем эти характеристики обрабатывают с помощью диагностического комплекса, содержащего соответствующие устройства, и при получении положительных результатов выявляют патогенные микробы. В последующем действии определяют по аппаратно-адаптированному алгоритму способа в сочетании с анализом временных рядов живые или нет эти микробы, после чего информация передается врачу (графики, таблицы), из которых врач может поставить однозначно диагноз. То, что эта технология выявляет характеристики патологии и определяет биологическое стояние микробов, позволяет достичь цели определения с высокой степенью вероятности, является ли это этиологическим фактором.

Изобретение относится к области медицины, а именно к микробиологии, пищевой и промышленной биотехнологии. Для определения и идентификации биологических объектов и их нанокомпонентов проводят облучение, зондирование монохроматическим или немонохроматическим излучением, в том числе лазерным, одной или более проб, содержащих микрообъекты и их нанокомпоненты с использованием совокупности устройств для измерения и регистрации откликов пробы. При этом измеряют характеристики откликов от каждого вида явления конверсии излучения по отдельности или в совокупности, передают и приводят в линейную по диагностическому параметру форму. Производят нормировку, корректировку, создают базу эталонных и диагностируемых параметров микрообъектов и/или их нанокомпонентов. Далее проводят распознавание и сравнение с полученными на основании измерения опытными данными искомых параметров эталонных, диагностируемых и идентифицируемых микрообъектов и/или их нанокомпонентов с использованием матрицы. Использование заявленного способа позволяет провести точный качественный и количественный анализ определяемых, идентифицируемых, диагностируемых параметров микрообъектов и/или их нанокомпонентов на основе оптического измерения. 2 н. и 2 з.п. ф-лы, 12 ил., 1 табл.

1. Способ определения и идентификации биологических микрообъектов и их нанокомпонентов, включающий облучение, зондирование монохроматическим или немонохроматическим излучением, в том числе лазерным, одной или более проб, содержащих измеряемые микрообъекты, измерение и регистрацию параметров отклика пробы на облучение в виде характеристик флуоресценции или экстинкции, обработку полученных данных на ЭВМ, отличающийся тем, что используют совокупность устройств для измерения и регистрации одного или более указанных откликов пробы в форме характеристик конверсии излучения, в том числе путем помещения пробы в кювету, и/или зондируя излучением объекты живой или неживой природы, в том числе путем поднесения светособирающего устройства к поверхности объекта, в том числе измеряют и регистрируют одновременно, последовательно указанные отклики в форме конверсии излучения, в том числе от одного или более источников излучения, измеряют и регистрируют отклики, включающие в себя отражение, рассеяние, флуоресценцию, экстинкцию зондирующего излучения, фотоакустические, оптотермические отклики, нелинейное, в том числе комбинационное рассеяние, пространственное распределение рассеянного и/или флуоресцентного излучения, при этом измеряют характеристики откликов от каждого вида явления конверсии излучения по отдельности или в совокупности в любой комбинации из названных явлений как по месту, так и для удаленных проб, при этом предварительно измеряют и регистрируют характеристики откликов на воздействие излучения на эталонные пробы и/или объекты сравнения, имеющие известные собственные диагностируемые параметры и/или известные собственные параметры отклика, а затем измеряют характеристики отклика проб/объектов с неизвестными диагностируемыми параметрами и/или неизвестными измеряемыми параметрами отклика на воздействие излучения, при этом указанные отклики передают, в том числе с помощью оптико-волоконных световодов, том числе из кювет, из планшетной кюветы на соответствующие матричные элементы фотодетекторов, при необходимости, помещенных в низкотемпературный термостат, и/или через флуоресцентный микроскоп, и/или на фотоакустические, оптотермические и/или кавитационные датчики, в том числе интегрированные на стенках кювет, в том числе измерения спектральных характеристик отклика проводят с помощью блоков анализатора спектров и после передачи в ЭВМ измеренных и оцифрованных сигналов их сохраняют в памяти ЭВМ, приводят в линейную по диагностируемому параметру форму, при этом производят линейную нормировку измеренных характеристик по каждому диагностируемому параметру по формуле
X_pi=X_ai/(1-α_i·X_эi),
где X_pi - уровненная характеристика конверсии, X_ai - экзокорпоральная абсолютная характеристика конверсии, Х_эi - эндокорпоральная относительная характеристика конверсии, α_i - коэффициент при i-й характеристике в выражении для гомеостатического параметра P=Σα_k·I_k, где k - номер измеренной характеристики, далее полученные данные нормируют на ранее измеренные и/или известные значения спектральных характеристик и/или другого гомеостатического параметра эталонных проб/объектов, при этом проводят корректировку данных и аппаратных функций по формуле
X_{i corr}=X_i/(a₁+а₂·э_i+а₃·э_i ²),
где X_icorr - значение корректированной спектральной характеристики от i-го канала прибора (на i-й длине волны), X_i - значение соответствующей спектральной характеристики без корректировки, а₁, а₂ и а₃ - поправочные коэффициенты, зависящие от геометрии образцов и способа сбора излучения, э_i - пространственный декремент затухания, обусловленный экстинкцией на i-й длине волны, соответствующей спектральной характеристики, далее для создания статистической модели диагностируемых параметров комплекс спектральных характеристик, представляющих собой комплекс соответствующих векторов признаков эталонных и диагностируемых параметров микрообъектов и их нанокомпонентов, разделяют на факторные и случайные составляющие, последовательно осуществляют в каждом цикле расчетов декомпозицию матрицы данных на структурную часть и шум по формуле
X=FQ+E,
где Х - матрица данных, F - матрица, задающая факторы объектов в базисе главных компонент, Q - матрица с размерностью (J×P), являющаяся транспонированной матрицей нагрузок, Е - матрица остатков (шум), далее по соответствию выделенной структурной части каждой искомой характеристики ее модели определяют соответствующий искомый параметр диагностируемых микрообъектов и их нанокомпонентов, при этом результаты измерений, расчета и моделирования на ЭВМ характеристик откликов микрообъектов и их нанокомпонентов с известными и соответствующими диагностируемым моделируемыми параметрами сохраняют на ЭВМ и создают базы данных, с помощью которых на ЭВМ с использованием вышеописанного алгоритма проводят распознавание и сравнение с, полученными на основании измерения, опытными данными искомых параметров других идентифицируемых микрообъектов и их нанокомпонентов.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что результаты измерений конверсионного отклика удаленных диагностируемых проб и/или объектов и/или соответствующие им определяемые параметры диагностируемых микрообъектов и их нанокомпонентов передают с помощью дистанционных методов передачи данных по локальным, глобальным, проводным и/или беспроводным сетям связи от близких и/или удаленных проб и/или объектов в диагностический блок анализа информации, который обеспечивает обработку характеристик отклика проб и/или объектов сразу от нескольких блоков, измеряющих эти характеристики, и используют в диагностике процессов, в которых участвуют идентифицируемые микрообъекты и их нанокомпоненты.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что по диагностируемым параметрам микрообъектов и их нанокомпонентов в пробах и/или в объектах in vivo определяет состояние каждого индивидуального организма в норме - как эталонного объекта - на разных стадиях его развития и полученные данные диагностируемых параметров и/или характеристики состояния организма заносят в базы данных (БД) указанных ЭВМ.

4. Планшетная кювета для осуществления способа по п.1, содержащая плотно сложенные вместе две плоскопараллельные пластины, при этом в первой пластине со стороны, обращенной ко второй пластине из оптически прозрачного материала, выполнено одно или более углублений, отличающаяся тем, что планшета содержит на фронтальной поверхности несколько углублений-кювет (2-500) с объемом порядка 0,1-0,001 мл, расстояния между прозрачными стенками кювет лежат в пределах, превышающих поперечные размеры микробов на 5-10%, причем часть этих кювет может быть одинакового размера или объема, а часть разного, при этом кюветы могут быть выполнены в проточном варианте, входной и выходной концы которых подсоединены к шлангам для входа и слива жидкости, и кюветы могут быть снабжены датчиками для регистрации конверсионного отклика пробы на зондирование оптическим излучением.