Способ определения суммарной протеазной активности панкреатического сока Советский патент 1992 года по МПК G01N33/68 A61K35/00 

Изобретение относится к медицине, а именно к клиническим лабораторным методам исследования.

Известен способ определения протео- литической активности панкреатического сока по расщеплению трипсином того или иного субстрата, например М-бензоил-D-ap- гинин-паранитроанилида.

Однако спектрофотометрическое определение кинетики ферментной реакции с образцом мутного дуоденального содержимого затруднено из-за сниженной точности устаномения концентрации конечного продукта рэакции - п-нитроанилина.

изобретения - сокращение времени анализа и повышение точности определения.

Поставленная цель достигается путем преинкубации образца панкреатического сока с раствором тромбина и последующим определением тромбинового времени после добавления к смеси донорской свежей

цитратной плазмы, значения которого сравнивают с аналогичным показателем, определенным для стандарта с известной протеазной активностью.

Способ осуществляют следующим образом.

А. Построение калибровочной кривой.

1. 1 таблетку фармакологического препарата Панкреатин (Финляндия) или аналогичного препарата с протеазной активностью 12500 ед. осторожно растирают в ступке, растворяют в 12,5 мл 0,9%-ного раствора натрия хлорида и встряхивают в течение 15 мин. Суспензию переносят в центрифужную пробирку и центрифугируют 10 мин при 2000 д. К 8 мл супернатанта добавляют 2 мл 0,9%-ного раствора натрия хлорида. Таким образом получают исходный стандартный раствор с протеазной активностью 800 ед/мл. Из этого раствора методом серийных разведений готовят

w

Ё

О 00

О

стандартные растворы активностью 400: 200; 100; 50; 25; 12,5; 6,25 ед в 1 мл.

2.Готовят раствор тромбина 1 г/л, растворяя 10 мг тромбина в 10 мл буфера Ми- хаэлиса (рН 7,35).

3.Свежецитратную, смешанную от нескольких пациентов плазму стандартизируют, добавляя к ней необходимое количество 0,9%-ного раствора хлорида натрия с таким расчетом, чтобы тромбиновое время плазмы стало 15-18 с.

4.В пробирки Вассермана после маркировки (Мг 1,2,3,4,5,6) вносят по 0,2 мл стандартных растворов с протеазной активностью 200; 100; 50; 25: 12,5 и 6,25 ед/мл. Затем в каждую пробирку добавляют по 0,2 мл раствора тромбина (1 мг/мл), инкубируют в течение 15 мин на водяной бане при 37°С, затем пробы охлаждают в воде или в ледяной бане.

5.Из каждой пробирки отбирают 0,2 мл смеси в пробирку Вассермана, прогревают 1 мин на водяной бане при 37°, добавляют 0,2 мл свежецитратной плазмы и измеряют сразу тромбиновое время. Это повторяют дважды для каждой пробы смеси и рассчитывают среднее тромбиновое время для каждого уровня протеазной активности.

Если используется одна серия тромбина и готовится свежецитратная плазма с одним и тем же постоянным тромбиновым временем, например 15 с, то калибровочную кривую можно использовать многократно.

Б. Исследование образца.

1. Разводят пробу панкреатического сока в 10разО,9%-ным раствором натрия хлорида. Доводят рН исследуемой пробы до 7,35 растворами 0,1 н соляной кислоты или 0,1 н гидрооксида натрия.

2. К 0.2 мл пробы добавляют 0,2 мл раствора тромбина 1 г/л и инкубируют эту смесь 15 мин при 37°С на водяной бане. Охлаждают смесь на ледяной бане.

3. К 0,2 мл смеси добавляют 0,2 мл свежецитратной плазмы и отмечают тромбиновое время. Процедуру повторяют еще раз, предварительно выдержав смесь 1 мин при 37°С на водяной бане.

4. Используя среднее по двум анализам значение тромбинового времени, находят соответствующую данному образцу проте- азную активность по калибровочной кривой с учетом разведения,

Пример. Определение суммарной протеазной активности панкреатического сока.

1.Образец панкреатического сока (5 мл), полученный после дуоденального зондирования с использованием двухканально- го зонда, разводят в 10 раз, добавив 45 мл 0,9%-ного раствора натрия хлорида. Исходное рН образца равно 7,2,

Доводят рН образца до 7,35 с помощью

0,1 н раствора NaOH.

2.Готовят стандартные растворы препарата Панкреатин и раствор тромбината 1 г/л согласно описанной методике.

3.К свежецитратной смешанной от 5 пациентов плазме, тромбиновое время которой без разведения было 10 с, постепенно добавляют 0,9%-ный раствор NaCI, пока ее тромбиновое время не станет равным 15 с.

4.Используя эту плазму, по описанной методике измеряют тромбиновое время стандартных растворов Панкреатина (200; 100; 50; 25: 12,5 и 6,25 ед/мл). Получают следующие данные:

Изобретение относится к медицине, а именно к клиническим лабораторным исследованиям. Цель изобретения - сокращение времени анализа и повышение точности определения. Сущность изобретения: преин- кубация образца панкреатического сока .с раствором тромбина и определение тромбинового времени после добавления к алик- воте этой смеси донорской свежей цитратной плазмы, уровень которого сравнивают с аналогичным показателем, определенным для стандарта с известной протеазной активностью. Изобретение позволит в 1,5 раза повысить точность определения и в 1,5 раза ускорить проведение анализа.

Тромбиновое время, с 170 152 128 87 64 42 Протеазная активность,ед/м„ 200 100 50 25 12,5 6,25

Использование способа позволит в 1,5 раза повысить точность определения и в 1 5 раза ускорить проведение анализа

Формула изобретения

Способ определения суммарной протеазной активности панкреатического сока.

включающий исследование дуоденального содержимого, отличающийся тем, что, с целью сокращения времени анализа и повышении точности определения, в качестве субстрата используют 10%-ный раствор

тромбина, который инкубируют с пробой в соотношении 1:1 в течение 15 мин при 37°С, затем к аликвоте из этой смеси добавляют равный обьем свежей цитратной плазмы, стабилизированной по тромбиновому времени, определяют тромбиновое время, уро

вень которого сравнивают с аналогичным ного ферментного препарата с известной показателем, определенным для стандарт- протеазной активностью.