Способ определения токсичности промышленных сточных вод Советский патент 1992 года по МПК G01N33/18 

Изобретение относится к биологической очистке промышленных сточных вод, может быть использовано для установления токсичности сточных вод отдельных производств, индивидуальных компонентов и многокомпонентных систем загрязнителей при приеме на биологическую очистку и сбросе в водоемы, а также для оценки функционального состояния экосистем активного ила и оперативного контроля за работой .сооружений биологической очистки.

Известен способ биотестирования токсичности промышленных сточных вод, заключающийся в установлении нарушения способности белков микроорганизмов экосистемы активного ила связывать специфический краситель при действии токсичных сточных вод и их компонентов.

Способ осуществляют следующим образом: в колбы помещают по 200 мл иловой суспензии действующих очистных сооружений. Одну колбу оставляют в качестве контроля, в другую (ие) добавляют разные количества сточных вод (от 10 до 50 мл в зависимости от вероятной токсичности) или компонентов сточных вод в разных концентрациях. Колбы помещают на магнитные ме- шалки и, перемешивая, проводят инкубацию в течение 1 ч при 37°. По окончании инкубации из контрольной и опытных образцов берут по 10 мл иловой суспензии, 3-кратно промывают фосфатным буфером рН 7,0, центрифугируют при 5000 об/мин 10 мин. Осадок переносят в механический дезинтегратор, дезинтеграцию проводят 5 мин при 4°. Дезинтегрируемую иловую смесь переносят в колбу, добавляют 5 мл фосфатного буфера рН 7,0 и тритона Х-100 20 мг/мл в конечной концентрации, Колбы помещают на магнитные мешалки и продолжают дезинтеграцию и солюбилизацию белков 2 ч при 37°С. Дезинтеграт центрифугируют при 8000 об/мин в течение 10 мин. В суперна- танте определяют общее количество белка биуретовой реакцией и фракции белков методом электрофореза в плоских блоках по- лиакриламидного геля. Для этого анализиИ

VI

СП

а

з

руемые образцы в объеме 50 мкп в смеси с 40%-ным раствором сахарозы наносят на линию старта. В качестве электродного буфера используют 1 М трис-ЭДТА-боратный буфер рН 9,2. Электрофорез проводят при силе тока 5,0 мА/см в первые 30 мин, затем 10,0 мА/см до окончания электрофореза. Фракции белков фиксируют и окрашивают, для чего электрофореграммы помещают в 1 %-ный раствоо амидочерного в 7%-ной уксусной кислоте на 10 мин. Удаление избытка красителя проводят вымачиванием гелевых пластинокв7%-шйуксуснойкислоте Дляускорения I обесцвечивания фона раствор уксусной кислоты меняют 4 раза в день Для качественной оценки действия токсичных сточных вод и их компонентов на микроорганизмы активного ила достаточно визуального исследования электрофореграмм без сканирования гелей. Действие минимальных токсичных концентраций компонентов сточных вод приводит к изменению электрофоретиче- ской подвижности фракций белка по сравнению с контролем, причем фракции выявляются в виде подков с зубчиками на краях, что указывает на начало токсического действия сточных водчи их компонентов на микроорганизмы активного ила. Увеличение концентрации токсичных компонентов ведет к постепенному увеличению нарушения фиксирования белками микроорганизмов ила красителя вплоть до полного исчезновения окрашенных фракций с поля электрофореграмм.

Недостатками известного способа являются его незначительная точность и информативность, поскольку неизвестно, какие именно белки - ферментные или неферментные - подвержены действию токсикантов, следствием чего является нарушение их структурных особенностей.

Цель изобретения - увеличение точности способа определения токсичности компонентов промышленных сточных вод по отношению к микроорганизмам активного ила.

Способ осуществляют следующим образом.

В колбы помещают по 200 мл иловой суспензии действующих очистных сооружений. Одну колбу оставляют в качестве контроля, в другую (ие) добавляют компоненты сточных вод в концентрациях, соответствующих залповым сбросам существующих производств, Колбы помещают на магнитные мешалки и, перемешивая, проводят инкубацию в течение 1 ч пир 37°С. Продолжительность и температура инкубации установлены в результате оптимизации условий эксперимента По окончания инкубации из

контролоной и опытных образцов берут по 10 мл иловой суспензии (45 50 мг сухого остатка), 3-кратно промывают фосфатным буфером рН 7,0, центрифугируют при 5000

об/мин 10 мин Осадок переносят в механический дезинтегратор (стеклянная ступка и пестик на шлифах), дезинтеграцию проводят 5 мин при 4°С Дезинтегрируемую иловую смесь переносят в колбу, добавляют 5

0 мл фосфатного буфера рН 7 0 и тритона X- 10020 мг/мл в конечной концентрации Колбы помещают на магнитные мешалки для солюбилизации белков на 2 ч при 37°С Го- могенат центрифугируют при 8000 об/мин

5 10 мин, В супернатанте определяют молекулярные формы малатдегидрогеназы методом электрофореза в плоских блоках полиакрилполиамидного геля Анализируемые образцы в объеме 50 мкл в смеси с

0 40%-ным раствором сахарозы наносят на линию старта. В качестве электродного буфера используют 1 М трис-ЭДТА-боратный буфер рН 9,2 Электрофорез проводят при силе тока 5,0 мА/см в первые 30 мин, затем

5 10,0 мА/см до окончания электрофореза.

Выявление мопекулярных форм малатдегидрогеназы микроорганизмов активного ила проводят феназинметасульфат-тетразо- лиевой реакцией в инкубационной среде

0 следующего состава: 0,1 М трис-HCI буфер рН 7,1-15 мл, НАД-30 мг, нитросиний тетра- золиевый 10 мг, феназинметасульфат 2 мг, 1 М раствор малЗта натрия рН 7,1 10 мл, вода дистиллированная 70 мл. Неспецифи5 ческие реакции исключают использованием инкубационной среды без мэлата натрия Гелевые блоки заливают инкубационным раствором и инкубируют 2 ч при 37°С Молекулярные формы малатдегидрогеназы вы0 являются в виде темно-синих зон Путем прямой денситометрии определяют относительную активность каждой зоны в контрольной и опытных образцах Снижение активности одной из молекулярных форм

5 малатдегидрогеназы микроорганизмов активного ила (маркер токсичности) на 20% от контроля является критерием токсичности Малатдегидрогеназа участвует в переносе восстановленных эквивалентов через мемб0 ранные системы клетки. Угнетение активности малатдегидрогеназы при действии токсикантов приводит к блокированию участка цикла Кребса малат-оксалоацетат, следствием чего является нарушение окисли5 тельно-восстановительных процессов в микроорганизмах активного ила и ухудшение качества очистки

Пример1,В две колбы помещают по 200 мл иловой суспензии 1-й ступени биологической очистки сточных вод нефтеперерабатывающего завода. Одну колбу оставляют в качестве контроля, в другую добавляют синтетического моющего средства Прогресс (CMC Прогресс) в количестве 110 мг/гила, К указанному детергенту активный ил адаптирован. Колбы помещают на магнитные мешалки и проводят инкубацию 1 ч при 37°С. Дезинтеграцию микроорганизмов ила, получение ферментных образцов, электрофорез и выявление молекулярных форм малатдегидрогеназы микроорганизмов ила осуществляют вышеописанным способом. Данные по известному и предлагаемому способам представлены на табл. 2 и фиг. 1.

Из табл. 1 и 2 видно, что по известному способу действие CMC Прогресс в концентрации 110 мг/г ила приводит к уходу одной фракции с поля электрофореграмм. Это указывает на высокую токсичность детергента в таких количествах для микроорганизмов активного ила. Данные по предлагаемому способу показывают полное ингибирование 8-й зоны малатдегидрогеназы и значительное ингибирование остальных семи молекулярных форм МДГ, что говорит о практически полном блокировании фрагмента цикла Кребса малат-оксало- ацетат и недопустимости приема на биологическую очистку исследуемого детергента в таких концентрациях.

Пример 2. В две колбы помещают по 200 мл иловой суспензии 1-й ступени биологической очистки сточных вод нефтеперера- ботывающего завода. Одну колбу составляют в качестве контроля, в другую добавляют цинка сульфата 35 мг/г ила, характерного для сточных вод завода. Колбы помещают на магнитные мешалки и проводят инкубацию 1 ч при 37°С. Дезинтеграцию, получение ферментных образцов, электрофорез и выявление молекулярных форм малатдегидрогеназы проводят аналогичным способом. Данные по известному и предлагаемому способам представлены на табл. 3 и 4 и фиг. 2.

Данные показывают, что по известному способу цинка сульфат вызывает уход двух фракций белка с поля электрофореграмм, характеризуя его как высокотоксичное соединение для активного ила в исследуемой концентрации. По предлагаемому способу установлено полное ингибирование 8-й зоны, что указывает на блокирование фрагмента цикла Кребса, нарушение окислительно-восстановительных процессов в экосистеме с вероятной возможностью вывода из строя биоо.чистных сооружений.

Приме, 3. В две колбы помещают по 200 мл иловой суспензии 1-й ступени биоло гической очистки сточных вод нефтеперерабатывающего завода. Одну колбу оставляют 5 для контроля, в другую добавляют ортокре- зола 350 мг/г ила, к указанному фенолу адаптирован. Колбы помещают на магнитные мешалки и проводят инкубацию 1 ч при 37°С. Дезинтеграцию, получение фермент0 ных образцов, электрофорез и выявление молекулярных форм мала тдегидрогеназы проводят вышеописанным способом. Данные по известному и предлагаемому способам представлены в табл. 5 и 6 и фиг 3.

5

Полученные данные по известному способу свидетельствуют о выраженной токсичности орто-крезола в исследуемой концентрации по отношению к микроорга0 низмам активного ила, подтверждением чего является уход одной фракции с поля электрофореграмм. По предлагаемому способу установлено ингибирование активно- сти зоны два на 92%, зоны три на 97%, зоны

5 четыре на 84% и зоны пять на 96%, что несомненно указывает на глубокое нарушение функционирования экосистемы активного ила на участке цикла Кребса малат-оксалоацетат.

0 Применение предлагаемого способа определения токсичности компонентов про- мцшленных сточных вод позволит получить более точную и полную информацию о ин- гибирующем влиянии загрязнителей на

5 ферменты активного ила, определить функциональное состояние экосистемы на уровне одного из ключевых ферментов цикла Кребса, лимитирующего процессы окисления и дыхания.

0Использование способа на сооружениях биологической очистки обеспечит санитарный эффект за счет тонкого контроля состояния сточных вод промышленных производств при приеме на биологическую очи5 стку и выбросе в водоемы.

Формула изобретения Способ определения токсичности промышленных сточных вод, предусмат0 ривающий отбор проб микроорганизмов активного ила, их инкубацию в средах с компонентами сточных вод и контрольной чистой водой, последующее центрифугирование сред, дезинтеграцию, определение

5 фракций белков электрофорезом в плоских блоках полиакрилполиамидного геля, окрашивание фракций белка с установлением молекулярных форм фермента и их активности в опытных и контрольных средах и отнесение опытной среды к токсичной в случае

изменения активности молекулярных форм фермента в опытной среде по сравнению с контролем, отличающийся тем, что, с целью повышения точности определения, в качестве фермента используют малатдегид- рогеназу, окрашивание фракций белка проводят феназинметасульфата-тетразолиевой

реакцией, при этом активность молекуляр ных форм фермента устанавливают денси- тометрией, а отнесение опытной среды к токсичной проводят в случае снижения ак- тивности одной из форм фермента в опытной среде более чем на 20% по сравнению с контролем.

Таблица 1

Использование- определение токсичности промышленных сточных вод. установление токсичности сточных вод отдельных производств, оценка функционального состояния экосистемы активного ила. Сущность изобретения: из проб активного ила определяют фракции белков, устанавливают молекулярные формы малатдегидрогена- зы и определяют активность в опытных и контрольных средах. Опытную среду относят к токсичной в случае снижения активности одной из форм малатдегидрогеназы в опытной среде более чем на 20% по сравнению с контролем 3 ил., 6 табл.

Таблица 2

Таблица 3

Таблица 4

8 7 6 5 ff 327

Фиг./

1751670

10 Таблица 5

Таблица 6

i

III

В 7. В 5 Ч 3 2 1

Фиг. 2

В 7 В