(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФЕРМЕНТА, РАЗРУШАЮЩЕГО КАРИОГЕНАН
1 ;
Изобретение относится к производству ферментных препаратов.
Предложен способ получения фермента, разрушающего кариогенан, ранее в патентной литературе не описанный, который заключается в том, что активный микроорганизм, изолированный путем выращивания на полутвердой среде с кариогенаном, инкубируют в среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, и из фильтрата культуральной ЖИДКОСТИ выделяют и очищают целевой продукт известными приемами.
Предложенный фермент способен разрушать кариогенан, являющийся одним из прикрепляющих средств зубного пятна. Фермент является полезной составной частью для средств ухода за полостью рта, таких как зубные пасты, эликсиры для полоскания полости рта, различные мази для втирания, а также для жевательных резинок, лепешек, пастилок, пищевых продуктов, напитков. Кроме того, фермент может содержаться в воде, используемой в виде струи, выходящей с большой скоростью, ИЛИ в качестве растворителя энзиматической составной части, или в виде полезной добавки совместно с другими ферментами, такими как декстраназа и/или лротеазы, уничтожающими пятна на зубе.
Средства для ухода за полостью рта должны составляться таким образом, чтобы однократная доза для обработки полости рта содержала 10-20 тыс. единиц фермента; желательно в течение дня производить от одной до нескольких обработок указанной дозой. В случае применения в сочетании с декстраназой или протеазой, рассеивающими пятна на зубах, или совместно с ними обеИМИ, средства для ухода за полостью рта должны составляться таким образом, чтобы доза для однократной обработки полости рта содержала - 100-200 тыс. единиц декстраназы, 0,4-200 азоказеиновых единиц протеазы, обеспечивающей рассеивание зубных пятен, И 10-20 тыс. единиц фермента.
Микробные организмы, способные энзиматически гидролизовать кариогенан, отделяются от аэробных бактерий путем выдерживания пластинок агара, содержащих надлежащую питательную среду, включающую кариогенан в качестве источника углеводорода, и инкубирования образовавщихся в итоге культур при подходящей температуре, обычно выбираемой в интервале 28-37°С в течение, примерно, до 10 суток. Организмы, которые были определены как активные, подвергаются субкультивированию на аналогичных нластинках агара для изолирования.
Фермент выделяют из питательного бульона путем осветления его, отделения клеточных остатков и других нерастворимых материалов посредством центрифугирования или фильтрования с последующим концентрированием центрифугата в вакууме и получением остатка, который в 5-50 раз меньше первоначального объема, предпочтительно в 10 раз. Затем осаждают протеин с помощью стандартных процедур - растворение в органическом растворителе, образование комплексного соединения с металлом, насыщение такой солью, как сульфат аммония или подобной ей. Предпочтительны многократные осаждения с промежуточными растворениями осадка в буферном растворе и последующими осветлениями полученных растворов посредством фильтрования или центрифугирования. В заключение итоговый продукт осаждения подвергают диализу в водном растворе и сохраняют или в охлажденном растворе или в лиофилизированной форме.
Полученный таким образом фермент отличается специфическим действием в отношении а () глюкозидной связи с соседней а () глюкозидной связью. Данный фермент имеет изоэлектрофокусирующую точку равную 5,1 и оптимум в широком интервале значений водородного показателя рН при наличии пиковой активности при значении рН 6,0. Эти характеристики явно отличают предложенный фермент от любого другого вида распознанной полисахаразы.
Пример 1. Определение фермента. Отбор микробных организмов, вырабатывающих ферменты, гидролизующие дар-иогенан, осуществляют на агаровых пластинках, приготовленных совместно с определенной средой, содержащей кариогенан в качестве источника углевода. Агаровая среда имеет следующий состав: 100 мг триптиказы, 1,5 г агара, 200 г кариогенана, 0,1 мл солевого раствора, имеющего такой же состав, как для стрептококковой среды, в 100 мл 0,1 М фосфатного буфера при рН среды 7,0. Среду автоклавируют 15 мин. Около 10 мл среды, содержащей хорошо суспендированный кариогенан, выливают в чашку Петри. После экспозиции по отношению к аэробным микроорганизмам чащки выдерживают при температуре 28°С 10 суток.
Факт получения фермента, обладающего гидролитическим действием, легко распознается по просветлению подложки суспендированного в агаре кариогенана вокруг культуры. Активными оказались различные микроорганизмы, судя по степени просветления основной массы, содержащей суспендированный в агаре кариогенан. Их субкультивируют на аналогичных пластинках агара с целью выделения.
Найдено, что к числу активных микроорганизмов относятся: неиндентифицированные
грибки (MF--4490) NRLL № 5305; Streptococcus sp. (MA-4226, 4227, 4228 и 4229), NRLL № 5306, 5307, 5308 и 5309 соответственно; Bacillus sp. (МВ-2793, 2796 и 2665), NRLL № В-5301, В-5302, В-5303 и В-5300 соответственно; и Corynebacterium sp. (MB- 2795), NRLLA o В-5310.
Культура Bacillus sp. MB-2665, NRLL № В-5300 была выбрана в качестве организма для пояснения рассматриваемого изобретения, хотя можно было применить любую из числа различных других.
Пример 2. Получение фермента. Производят в двзхлитровых колбах, не имеющих отражательных перегородок, содержащих 400 мл среды следующего состава: 800 мг питательного бульона, 800 мг дрожжевого экстракта, 800 мг триптиказы, 0,20 мл солевого
раствора, 8 г кариогенана, в 400 мл 0,1 М фосфатного буфера; рН 7,0. После автоклавирования (15 мин при 121°С) среду инокулируют 1 мл культуры после 48-часового посева, введенной в 50 мл (колба для встряхивання объемом 250 мл) декстрозной среды, содержащей, мг: арадамин (автолизованные дрожжи, поставляемые фирмой «Уэст Продактс Инкорпорейшн) 10000; декстроза 10000; KHsPOi 180; Na2HPO4 190; MgSO47П20 50, растворенных в 1 л дистиллиронной воды. Культуру (MB-2665) получают при температуре 37°С в аппарате для встряхивания (200 об/мин) с амплитудой раскачивания 0,05 М. Культуру собирают после
просветления суспендированного кариогенана, обычно.в пределах 72-96 час.
Пример 3. Выделение фермента. Вульон осветляют от клеточной массы и других остаточных нерастворившихся веществ посредством центрифугирования при температуре 2°С в течение 20 мин при 16000 об/мин. Прозрачный всплывший слой концентрируют в вакууме (от 400 до 40 мл) и к полученному
концентрату добавляют ацетон порциями по 2-3 мл при перемешивании на ледяной бане до получения окончательной концентрации 60% (объем/объем). Выделившийся осадок центрифугируют 10 мин при -20°С, суспендируют в 200 мл охлажденного на льду фосфатного буфера концентрацией 0,05 М при рН 7,0; полученную суспензию перемешивают 1 час, затем осветляют от нерастворимых веществ центрифугированием при 13000 об/мин
в течение 20 мин и при 2°С. Прозрачный светло-желтый всплывший слой доводят до насыщения сернокислым аммонием. Осадок собирают центрифугированием при 13 000 об/мин в течение 20 мин при 2°С. Осадок растворяют
в 40-60 мл охлажденной льдом дистиллированной воды и диализуют 24 час. Прозрачный раствор высушивают вымораживанием. Полученный материал (выход 150-200 мг) оценивают как имеющий активность 400-
500 ед./мг по ферменту. 5 6
Предмет изобретенияриогенаном, инкубируют в среде, содержащей
Способ получения фермента, разрушающе- ли, и из фильтрата культуральной жидкости го кариогенан, отличающийся тем, что выделяют и очищают целевой продукт известактивный микроорганизм, изолированный ну- 5 ными приемами, тем выращивания на полутвердой среде с ка465796
источники углерода, азота и минеральные со
