Способ подбора электропроводности буфера и установка для его осуществления Советский патент 1980 года по МПК C25B7/00 G01N27/26 

(54) СПОСОБ ПОДБОРА ЭЛЕКТРОПРОВОДНОСТИ БУФЕРА И УСТАНОВКА ДЛЯ ЕГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ

1

Изобретение относится к технике разделения электрофорезом смеси веществ или дисперсны Г частиц и. ъ/южет быть использовано в исследованиях по молекулярной и клеточной биологии, в 5 медицинских исследованиях для разделения клеток крови.

Известен способ подбора электропроводности буфера для электрофореза, заключающийся в том, что текущий слойО буфера с введенной в него струей разделяемой смеси подвергают воздействию постоянного электрического поля при различных удельных электро- .. проводностях буфера,анализируют полу- 5 ченные фракции по составу и затем выбирают для применения электропрородность буфера, которая дает наилучшее разрешение 1. Устройство для осуществления способа содержит 20 проточную злектрофоретическую камеру, электроды, инжектор для ввода разделяемой смеси, емкость для буфера, насос для подачи буфера в проточную камеру, источник постоянного напря- 25 жения.

Недостатком описанного способа является большая длительность подбора (3-4 часа), вызываемая необходи- 30

мостью многократного разделения смеси и последующего анализа фракций.

Целью настоящего изобретения яв.ляется увеличение скорости подбора электропроводности буфера.

Указанная цель достигается тем, что струю разделяемой смеси вводят я текущий слой буфера с удельной электропроводностътб 10 2«10 затем подвергают слой воздействию переменного электрического поля непрерывно добавляя в текущий слой буфер с удельной электропроводностью 10 -2,10 см до получения удельной электропроводности буфера, при которой диаметр струи разделяемой смеси при наложении поля равен ее диаметру без воздействия поля. При этом получают удельную электропроводность буфера с максимально раэрешаюбзей способностью.

Подбор проводят в интервале параметров; напряженности электрического поля 40-60 в/см, скорости протока слоя буфера 0,5-1 см/сек, толщине слоя .буфера 0,5-1 мм, диаметра струи смеси 0,1-0,2 мм, температуре буфера 10-20 С. Эти параметры, соответствуют тем, которые используют при электрофорезе в свободной среде. Длину области воздействия поля выбирают в интервале 10-15 см, что обеспечивает: во-первых, регистрацию в процессе подбора расширения труи смеси при недостаточной электропрово ности текуще.го слоя; -во-вторых, при этом изменение температуры слоя по длине вследствие выделения джоулева теплане превышает 2-3с и при скоростях протока 0,5-1 см/сек не требуется охлаждение слоя для подавления тепловой конвекции. Ширину слоя буфера выбирают в интервале 1-3 см, чтобы исключить расш рение Тструи смеси, обусловленное параболическим профилем скорости потока по ширине слоя. Применяют переменное электрическое поле с частотой 0,5-1 КГЦ, чтобы исключить дополнительное расширение струи сме си, вызываемое электроосмотическим движением буфера на границах слоя. Для подбора электропроводности буфера используют текущий буфер с , т.е. в 510 раз меньше удельной электропровод ности обычно используемой для электрофореза, т.к. максимальное разрешение может быть достигнуто и при значительно меньшей электропроводности В качаетв е добавки применяют буЛ Iфар с -2-10 ом см , чтобы добавление его в процессе подбора в текущий слой не изменяло скорости течения-более чем на 5-10%, при этом не требуется средств подцер жания постоянной скорости течения .слоя . I - . Разделяемую смесь объемной концентрации 3-10% суспензируют или J. о -J 4 t4--J i). JTlrf-LJT в буфере с удельной элект растворяют ;тью К, 10 -2-10 -ОМ см ропроводностью который обычно применяют при электро форезе. В случае клеточных смесей буфер с удельной электропроводностью K lOj-2 10 ; см и буфер .с -2-10 см добавляют для изотоничности сахарозу или глюкозу до концентрации 7-10%. Указанная .цель достигается также там, что в установке перед проточной камерой установлена смесительная камера, соединенная с емкостями для буферов, электроды присоединены к генератору переменного напряжения, а в нижней части проточной камеры установлен микроскоп. На фиг, 1 представлен общий вид установки. Установка содержит емкост 1 для буфера с -2-10 см насос для его.подачи 2, смесительную камеру 3, емкость 4 для буфера с .10 ом см , насос для его подачи 5, проточную камеру б с электродами 7, генератор переменного напряжения 8, инжектор для ввода. разделяемой смеси 9, микроскоп 10, Прим е р. Проводился подбор электропроводности для разделения смеси нативных и фикЪированных формалином эритроцитов кролика в фосфатцитратном буфере с рН 7,2. Использовали удельные электропроводности К. 10 ом см , Kn 210 OMW Ьм см . В буфер с К, добавляли 10% сахарозы и в буфер с 8% сахарозы и смесь равных объемов нативных и фиксированных эритроцитов до концентрации 5%. Подббр проводили в переменном электрическом поле с частотой 0,5 кгц. и напряженностью 50 в/см при толщине слоя буфера 1 мм, ширине слоя 2 см .и длине области воздействия поля 10 см и температуре буфера 20°С. Из емкости 1 буфер с ом см вводили насосом 2 со скоростью б мл/мин в смесительную камеру 3, а из нее впроточную камеру 6. Через инжектор 9 вводили в камеру 6 струю смеси, измеряли микроскопом 10 в нижней части камеры б диаметр струи смеси,который был равен 0,14 мм. От генератора 8 подавали на электроды : Т переменное напряжение , при этом ; диаметр струи смеси в нижней части камеры 6 увеличился до 2 мм. Непрерывно добавляя в смесительную каме- , ру 3 насосом 5 буфер с ом см из емкости 4 регулировали скорость его поступления в смесительную камеру 3 до получения исходного значения диаметра струи 0,14 мм в нижней части камеры б. При этом расход буфера с К.,10 ом см составлял 0,5мг/мин, а удельная электропроводность буфера в камере 6 - ,55-10 ом см , Полученные результаты разделения показывают, что максимальное разрешение фракций достигается при удельной электропроводности буфера 1,55х viO см . х10 ом см Предложенный способ и установка для его осуществления позволяют повысить скорость подбора электропроводности буфера не менее, чем в 10 раз по сравнению с известным. Формула изобретения 1. Способ подбора электропроводности буфера для разделения смеси веществ электрофорезом в свободной среде путем введения струи разделяемой смеси в текущий слой буфера при воздействии электрического поля, отличающийся тем, что, с целью ускорения-подбора, струю разделяемой смеси вводят в текущий слой буфера с тоельной электропроводностью 10 -210 ом см, затем подвергают слой воздействию переменного электрического поля непрерывно добавляя в тек5шшй слой буфер с . удельной электропроводностью 10 -210 ом см до получения удель электропроводности буфера, при

которой диаметр струи разделяемой смеси при наложении поля равен ее диаметру без воздействия поля.

2. Установка для осуществления способа по , включающая проточную камеру, электро;, нижектор для ввода разделяемой смеси, емкость для буфера, насос для подачи буфера в проточную камеру, 1,0 т л и ч щ ая с я тем, что,перед проточной камерой установлена смесительная камера, соединенная с емкостями для буферов, электроды присоединены к генератору переменного напряжения, в нижней части проточной камеры установлен микроскоп.

Источники информации, принятые во внимание, при экспертизе 1. K.Hannig, 1969, Sb. «Ptoaress in separation and ,pureficatlon, V.2, t.Gerritsen (Ed) N.J,London/ Jnterecience, p.45 (прототип).