Способ определения активности антибиотика-лактоцида при спиртовом брожении Советский патент 1980 года по МПК C12K1/00 G01N33/14 

а - количество лактоцада в тит руемой пробе, г; 2,766, 3,48 и постоянные рас;1етные коэффйхщенты. Предлагаемый бпособ осу1цествля ог следующим образом. Питательную среду готовят следую|цим образом. К 500 г размолотого ячХенного солбда в возрасте 9-10 дней iдобавляют 2 л водопроводной воды, подогретой до 50-55°С. Эту суспензию осахаривают в водяном ультратермостате при температуре 60-65°С в течение 1 час, затем при температуре 65-70 С еще в течение 1 час. Полученную суспензию охлаждают до комнатной температуры, фильтруют через два слоя марли и в фильтрате со держание сухих :Вёщёств доводят до 7% с помоецью сахариметра добавлением водопроводной воды. Такой фильтрат разливают по 25 мл в пробирки емкос ти 50 мл, которые закрывйют ватномарлевыми пробками, и стерилизуют автоклаве 30 мин при 0,75 атм и Используют для опытных проб. Питательную среду для размножени посевной бактерии готовят следующим образбм: в колбы, наливают 100 мл та го же фильтрата, добавляют 6 г стер льн&го мела и 10 г осадка, полученного при фильтровании суспензии. Колбы закрывают ватно-м хпевйми про ками и стерилизуют так же, описано выае. . В качестве тест-организма молочнокислых бактерий используют Thermo bacterium cereale La far штамм XII из музея штампов ВНИИПрБ. Thermobac terium cereal-e Lafar является преде тавителем группы Bacterium Del brifki I - термофильных палочковидных бактерий, длина палочек -2,8-7,0 ммк Бактерий гсялоферментативные, образу ют из сахара только молочную кислоту. Оптййал ьнйя температура развити бактерий 48-52с, что является отли чительным признаком культуры. Посевную молочнокислую бгистерию готовят следукхцим образом. К 100 мл стерильной питательной с)ёды с мелом и осадком добавляют в стерильных условиях 20.мл .культуры Thertrfobacterfurn cereale Lafar (штам XII), затем Полученную суспензию ин кубийуют в термостате при 48-52с в т чейие 24 час, размноженную таким образом бактерию задерживают су ки в холодильнике ()/ а непосредственно перед использованием в опыте или для пересева подогревают в термостате с температурой 48-52°с в течение 1,5-2 час. В.опытные образцы используется жидкая фаза приготовленной культуры бактерий, -р.е.без осадка и без , предварительно разбавленная стерильной питательной средой так, чтобы оптическая плотность разведенного в 10 раз дистиллированной водой образца данной бактерии составляла 0,650 (при определении на фотоэлекТрокалоримётре, при длине волны 365 нм в кювете 6 1 мм; контроль разбавленная в 10 раз питательная среда). Оптическую плотность используемой культуры бактерии доводят до этой постоянной величины, выбранЭой экспериментально для того, чтобы по возможности брать во нсех опытах одинаковое количество бактериальных клеток. Приготовление расТвора лактоцида. 0,01%-ный водный раствор исследуемого препарата лактоцида готовят не-. посредственно перед опытом следующим Образом: О,1%-ный водный раствор препарата лактоцида kипятят 5 мин на водяной бане, затем 4 раза фильтруют через бумажный складчатый фильтр и разбавляют фильтрат в 10 раз холодпой дистиллированной водой. Для проведения анализа активности испытуемого препарата берут несколько пробирок (3-5) со. стерильной питательной средой- (без осадка и мела), добавляют в них стерильно оди-, наковое количество водного раствора лактоцида и по 2,5 мл подогретой жидкой фазы бактерий с определенной оптической плотностью (0,650 при разбавлении 1:10) .Затем пробирки энергич-. ЕЮ встряхивают и культивируют 4 час в термостате при . Одновременно готовят два типа контр|0льных проб: контро.аь 1 - для определения количества гидроксида (Vj), оттитров гвающего выносимую с бактерией кислоту, контроль II - для определения количества гидроксида (V{|), оттитровываклцего молочную кислоту, выделенную бактерией за 4 инкубации ее в среде без лактоцида. Для этого в такие же пробирки со стерильной питательной средой (как .и для опытных образцов) заливают 2,5 мл такой же культуры бактерии (что ив опытные образцы) и стерильную дистиллированную воду в объеме, равном объему раствора лактоцида, добавленному в опытные пробы. Контроль 1 титруют сразу, контроль II - культивируют, как и опытные образцы, в термостате 4 час при 52®С, а затем титруют вместе с опытными пробами. Для титрования всех проб - и контрольных и опытных - отбирают из каждой пробирки 20 мл, добавляют 3-г4 капли универсального индикатора марки РСК, титрование проводят 0,025 И раствором гидроксида натрия (NaOH) до образования светло-зеленой окраски титруемой пробы и рН 7,2. Из полученных результатов титрования контроля I I (V) и опытных проб (Vfl) вычитают Vj.. т.е. объем щелочи. затраченный на титрование вносимой кислоты, и получают таким образом сведения об объеме раствора гйдроксида, затраченного на итрование прироста кислоты за 4 час культивирования с лактоцидом ( - Vfl-Vi) и без лактоцида (, Vfi - Vi).. Разница V. - .t V покажет объ раствора гидроксида, затраченный на титрование молгчной кислоты, выделение которой подавляется заданны ко .ичеств ом лактоцида. Активность лактотдида рассчитываю по формуле:. АиЛ (.766V-3.48)-iOАкЛ - ед.акт/г, где V - разница в количестве гидро ксида, затраченного на титр вание прироста молочной- кис лоты в контрольной (без лак тоцида) и опытной (с лактоцидом) пробах, т.е. V Vb/AOM- (VH -Vi)-(Vo - Mi)Mn a - количество лактоцида в титруемой пробе, г} ,, (2,766; 3,«8) постоянные коэффициенты , определенные экспериментальныс-л путем. За единицу активности лактоцида принято такое его количество, которое за 4 час. подавляет нарастание 1 г молочной кислоты, образующейся при культивировании молочнокислой ба терии и штамма XII. Это количество составляет 20% ной кислоты, которая образуется при отсутствии лактоцида в стандартных условиях на солодовой среде. Пример. Для анализа взят пре парат антибиотика - лактоцида в количестве 100 мг на 1000 мл дистиллированной воды (0,01%). Приготов ленный рабочий раствор содержит 0,1 мг лактоцида в 1 мл раствора. :е пробирку с 25 мл стерильной жидкой солодовой среды fдля опытных проб) наливают 3 мл 0,01%-ного водного раствора лактоцида и 2,5 мл жид кой фазы посевной бактерии (общий объем 31,5 мл) - опытная проба. Контрольные пробы: одновременно в две пробирки с такой же питательной средой наливают по 2,5 мл той же бактерии, что и в опытную пробу, и по 3 мл стерильной дистилпированной воды (вместо лактоцида) для того, чт бы общий объем был таким же, как в опытной пробе. Содержимое одной из контрольных пробирок (к 1) титруют сразу, а опытную пробу и контроль I ставят на 4 час в термостат и культивируют при 52 С, после чего охлаждают лробирки в пррточной воде и содержимое титруют. Для титрования из всех прббирок отбирают пробу 20 мл, добавляют 4 капли универсального индикатора марки РСК и титрование проводят 0,025 и, раствором гидроксида (NaOH) до образования светло-зеленой окраски пробы и рН 7;2. Получили, ЧТО: Vi -; 2,2 мл (на титрование К 1 израсходовано 2,2 мл NaOH), Vj- - 20,2 мл (на титрование К I I 20,2 мл NaOH), Vg - 14,2 мл (на титрование опытной пробы - 14,2 мл NaOH). Следовательно, V (20,2-2,2) (1й,2-2,2) 6,2 мл. Определим количество лактоцида в титруемой пробе (а). Общий объем реакционной пробы равен 30,5 мл, в нем содержите 3 мл 0,01%-ного лактоцида, т.е. 0,3 мг, для титрования берется 20 мл из реакционной пробы. Составим пропорцию: в 30,5 мл содержится 0,3 мг лактоцида/ а з 20 мл X мг. лактоцида; получим Следовательно а ; 0,190«10 г. Подставив полученные величины в расчетное уравнение, получим искомую а ктивностъ дайного rijiefTaiiaTa лактоцида; . . (2,(66.6Д-а,48)-(0 OH 0-iO-SП, Предлагаемый способ позволяет повысить точность определения (погрешность его 12%, а погрешность по известнсжу способу - 50-100%) и ускорить проце зс опреДёлёШй с 25 час до 6 час. Кроме того, он менее трудоемок. Формулу изобретения Способ определения активности ;антибиотика- лактоцида при спиртовом брожении, пре сматривашций кyJiьтивиpoвaниe молочнркислых бактерий в присутствии и отсутствии лактоцида, определение.степени подавления лактоцидсях я:из недеятель ноет и молочнокислых бактерий и расчет активности лактоцяяа, отличающийся тем, что, с целью повышения точности определения и ускорения процесса,.ь качестве молочнокислых бактерий используют Thermobacterium cereale Lafar шгамм ХМ, культивирование их осущес овляют на солодовой питательной среде в течение 4 часов при температуре 52°С, а определение степени подавления лактоцидсж жизнедеятельности бактерий ведут по количеству продуцируемой бактериями молочной кислоты, титруемой раствором гидроксида, с последуквдим расчете активности лактоцида по формуле . . (2,Тб6У-3.4е)ЧОАкА 1-е -окТ/Р, где АкЛ - активность лактоцида, ед/г-, V - разница в количестве гидроксида, затраченного на

1 1

W JI«i-r .ii

7 7688J

титрование прироста мрЛрч-Источники информации,

нрй кислоты в контрольнойпринятые во внимание при экспертизе

(без лактоцнда) и опыт1яой1. Полтина Г.У. Выделение и свой(с .лактоцидом) пробах, мл;ства антибиот;ика, обладающего высоа - крличество лактоцида вкой антибиотической активностью в

титруемой пробе, г;. отнсдаении молочнокислых бактерий.

2,766; и 10 - постоянные рас- Микробиология, 1964, 26, вып. б,

сетныёкоэффициенты.с. 25-30.

7688108