Способ определения активности анти-биОТиКА лАКТОцидА пРи СпиРТОВОМ бРО-жЕНии Советский патент 1981 года по МПК C12P7/06 G01N33/14 

(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ АНТИБИОТИКА ЛАКТОЦИДА ПРИ СПИРТОВОМ БРОЖЕНИИ

Изобретение относится к спиртовой промышленности, в частности к способам определения активности анти биотика лактоцида,.используемого в качестве антисептика при спиртовом брожении. Лактоцид является специфическим антибиотиком молочно-кислых бактерий. Эти кислотообразующие бактерии могут развиваться при спиртовом брожении, угнетать развитие дрожжей и оказывать ингибирующее действие на ферменты. Поэтому применение лактодида, подавляющего жизнедеятельность кислообразующих бактерий, имеет большое значение в спиртовой промышленности. Повышается эффективность производства за счет снижения потерь углеводов, которые затрачиваются на развитие кислотообразующих бактерий,и уменьшения количества несброженных углеводов в бражках. Известны способы определения акти ности, лактоцида, заключающиеся в, том что культивируют молочнокислую бакте рию в присутствии разного количеств лактоцида и его отсутствии и опреде ляют при каком количестве взятого а тибиотика подавляется им жизнедеяте ность бактерий по прозрачности среды визуальным способом fl. Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности и достигаемому эффекту является способ определения активности антибиотика лактоцида при спиртовом брожении, предусматривающий культивирование молочнокислых бактерий в присутствии и отсутствии лактоцида и определение в опытной и контрольной пробах степени подавления лактоцидом жизнедеятельности молочнокислых бактерий по количеству продуцируемой бактериями молочной кислоты, титруемой раствором гидроксида в присутствии фенолфталеина с последующим расчетом активности лактоцида. .В качестве молочнокислых бактерий используют hermobacteгiurn cereale Zafar штамм УП, культивирование осуществляют на солодовой питательной среде в течение 4 : при 32°С Г2. Недостатком данного способа является сложность прихотовления питательной среды - солодовой, Hcnojiiisye мой для культивирования, образование недостаточного количества молочной кислоты, продуцируемой бактериями Dhermobacteгiurn cereale Zafar. что требует применение разбавленных сантинормальных растворов гидроксида так как применение более концентриро ванных - децинормальных, снижает точ ность анализа, вследствие малого рас хода титранта на определение. Цель изобретения - повышение точности определения, упрощение и ускорение процесса. Цель достигается тем, что согласно способу определения активности ан тибиотика лактоцида при спиртовом брожении, предусматривающему культивирование молочнокислых бактерий в присутствии и отсутствии лактоцида и определение в опытной и контрольной пробах степени подавления лактоцидом жизнедеятельности молочнокислых бактерий по количеству продуцируемой бактериями молочной кислоты, титруемой раствором гидроксида в присутствии фенолфталеина с последую щим расчетом активности лактоцида, и молочнокислых бактерий используют L ас t оЬа с te i urn bulgaricum, культивирование их осуществляют на обезжирен ном молоке при температуре 38-40°С, а определение количества продуцируемой бактериями молочной кислоты ведут путем титрования всего количества культуральной жидкости опытной и Рконтрольной проб, содержащих молочну кислоту, децинормальным раствором гидроксида в присутствии фенолфталеи на . Способ осуществляют следующим об разом. Готовят питательную среду. Для этого отвешивают 90 г сухого обезжи ренного молока и растворяют его в 1 л воды. Вначале 100-150 мл водопр водной воды нагревают до и заливают ею Осадок молока, приливая к нему воду маленькими порциями, тщательно перемешивая воду с сухим молоком так, чтобы не образовалось ко ков. Затем суспензию фильтруют чере 4 слоя марли на большой воронке. Остальной порцией водопроницаемой воды (900-850 мл) количественно омы вают емкость, где растворялось моло ко (ступка, стакан или другая посуда) , эти сливы фильтруют через тот же фильтр, одновременно растворяя о тавшиеся на фильтре комочки молока. Получают 1 л обезжиренной молочной среды. Эту среду по 100 мл разливаю в колбы 250 мл и по 20 мл - в пробирки емкостью 50 мл. Затем пробирки и колбы закрывают ватномарлевыми пробками и стерлизуют в течение 20 мин при давлении 1 МПа (1 атм). В качестве тест-организма молочнокислых бактерий используют Lactobaс.terium bulgaricum. Посевную молочнокислую бактерию готовят следующим образом. 100 мл приготовленной молочнокис лой среды стерильно заливают культу ой молочнокислых бактерий и инкубиуют в течение 4-ч при . Для подержания культуры бактерии в активом состоянии ее пересеивают на свеую среду через каждые 10-15 дней. ля пересеивания берут 10 мл культуы бактерий и инкубируют, как было казано.. Полученную культуру бактерии хранят в холодильнике. Для проведения анализов требуется свежая культура бактерии, которая олжна быть пересеена на сутки до проведения опыта и инкубирования. После инкубации перед использованием бактерии хранятся в холодильнике до следующего дня. На следующий день перед использованием культуры бактерии в опыте ее из холодильника переносят в термостат с температурой , там ее разогревают в течение 1,5-2,0 ч и используют для определения активности. Приготовление 0,05%-ного раствора препарата лактоцида в воде. На аналитических весах отвешивают 100 мг препарата лактоцида и растворяют в 100 мл кипящей дистиллированной воды в колбе вместимостью 250 мл, закрывают колбу ватномарлевой пробкой, помещают в кипящую водяную баню, где вьщерживают в течение 5 мин. Затем содержимое колбы перемешивают и в горячем состоянии фильтруют через бумажный пластный фильтр. Если получился мутный фильтрат его вторично фильтруют через тот же фильтр до образования прозрачного фильтрата. Этот фильтрат разбавляют в два раза холодной дистиллированной водой. Полученный 0,05%-ный водный раствор лактоцида используют сразу для определения активности. Для проведения анализа активности испытуемого препарата берут две пробирки вместимостью 50 мл и наливают в каждую по 20 мл стерильной молочной среды, нагретой до 40°с. В каждую пробирку в стерильный условиях приливают по 2 мл раствЬра культуры бактерии Lactobacteгiurn bulgaricum. Содержимое пробирок перемешивают, в одну добавляют 1 мл 0,05%-ного раствора препарата лактоцида и 2 мл стерильной дистиллированной воды. В другую пробирку добавляют 3 мл такой же воды, эта проба является контрольной. Пробирки закрывают ватномарлевыми пробками, энергично перемешивают и инкубируют в термостат-е при 40°С в течение 4 ч. По истечении этого времени пробирки с опытными и контрольными пробами вынимают из термостата и содержимое каждой пробирки переносят в две конические колбы вместимостью 200 мл.Пробирки споласкивают 50-55 мл дистиллированной воды и ополоски помещают в колбы с реакционной жидкостью. В колбы добавляют по 3-4 капли раствора фенолфталеина и образовавшаяся