Способ получения изолированных клеток печени Советский патент 1982 года по МПК C12N9/00 

Изобретение относится к экспериментальной медицине.

Известен способ получения изолированных клеток печени путем пролелвания печени через кровеносную систему органа npoNMBHHM раствором с последующим извлечением печени, перфузированием ее солевым раствором с добавлением кбллагеназы, дезагрегацией, инкубированием и отделением полученных клеток .

Однако при известной способе выход жизнеспособных клеток неалсок и составляет 75-90%.

Целью изобретения является повышение выхода жизнеспособных клеток.

Цель достигается тем, что согласно способу получения изолированных клеток печени путем промывания печени через кровеносную систему органа про1ф1вным раствором с последукадим извлечением печени, перфузированием ее солевым раствором с добавлением крл-т лагеназы дезагрегацией,инкубированием и отделением полученных клеток,отличительней особенностью является то, что промывание печени, проводят оксигенированным раствором, содержащим вес.%:

0,83-0,85

Хлористый натрий 0,95-0,97 .;

Лимоннокислый натрий (0,5-1, о). 10

Гепарин 0,05-0,15

Глюкозу

Дистиллированную

Остальное

воду

в течение 20-30 мин при температуре раствора 16-18°С, перфузируют оксигенированным раствором, содержащим,

10 вес.%:

0,79-0,82

Хлористый натрий 0,035-0,045

Хлористый калий

Фосфорнокислый ка0,005-0,007 лий однозамещеннып

15

Фосфорнокислый натрий двузамещенпый 0,014-0,016

0,04-0,09

Хлористый кальций

0,025-0,05

Коллагеназу

0,05-0,15

Глюкозу

20

Дистиллированную

Остальное

воду

инкубирование осуществляют в течение . 20-30 мин при 37°С.

Пример. Вскрывают бркшную и

25 грудную полости декапитированной крысы. Перевязывают нижнюю полую вену выше места ответвления правой почечной вены и перерезают дист.альнее лигатуры. Надсекают нижнюю полую вену

30

В в месте впадения ее в предсердие просвет сосуда вводят притупленную инъекционную иглу соответствующего диаметра и с помощью перистальтиче .кого насоса проводят промывку пече рае т вором, содерж ащим, ве с.%: Хлористый натрий О,84 Лимоннокислый нат0,96 , рий 0, Гепарин 04 Глюкоза ДистиллированОстальноеная вода перерезают сосуды портальной триады после чего фиксируют лигатурой иглу и освобождают печень от связок. Про мывку осуществляют со скоростью 6 МП/мин при температуре 1б-18с. Количество раствора берут примерно равным массе животного. Раствор за 20-30 мин, до промывки и в процессе промывки насыщают кислородом. По окончании этой операции печен переносят на воронку с ситечком из нержавекядей стали и рециркуляторно перфузируют 75 мл раствора, содержащего вес.%: Хлористый натрий 0,8 Хлористый калий 0,04 Фосфорнокислый калий 0,006 Фосфорнокислый натрий 0,016 Хлористый кальций 0,07 Коллагеназа0,035 Глюкоза0,1 Дистиллированная вода Остальное Перфузионный раствор также насыщают кислородом и поддерживают рН в пределах 7,35-7,60 с помощью 10%-ного бикарбоната натрия. Перфузию проводят со скоростью 6 ivm/мин при 37°С в течение 20 мин. После прекращения перфузии дают стечь избытку раствора из органа, взвешивают 5-6 г ткани, надрезают в нескольких местах капсулу, помещают в стакан с 40 мл раствора, использовавшегося при перфузии, и инкубируют в термостате при 37°С и постоянном помешивании. Через 15 мин клетки, перешедшие в суспензию, фильтруют через слой батиста, к остатку ткани добавляют оставшиеся 35 мл перфузионного раствора, вторично инкубируют 10 мин, и вновь фильтруют. В объединенном фильтрате - первичной клеточной суспензии - определяют количество клеток и процентное содержание неповрежденных гепатоцитов, например цитологическими методами с триПановым синим. В таблице представлены данные по выходу жизнеспособных гепатоцитов при суспенжировании печени крысы предлагаемым способом.

Выход клеток при использовании предлагаемого способа составляет 225,5 млн. в пересчете на 100 г массы тела крысы, из которых живых 214,2 млн (95%), тогда как известным способом можно получить только 111,4 млн. (82,5%) живых при общем количестве 135 млн. клеток, т.е. в 1,9 раза меньше. При этом воспроизводимост-ь предлагаемого способа значительно выше по сравнению с известным, т.е. выход клеток при применении предлагаемого способа варьирует в пределах t 1,1%, а известном i7,5%.

Формула изобретения

Способ получения изолированных клеток печени путем промывания печени через кровеносную систему органа промывным раствором с последующим извлечением печени пер|фузированием ее- солевым раствором с добавлением коллагеназы, дезагрегацией, инкубированием и отделением полученных клеток, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода железоспособных клеток, промывание печени проводят оксигенированным раствором, содержащим, вес.%:

0,83-0,85

Хлористый натрий Лимоннокислый нат0,95-0,97 рий

г 6

0 Гепарин (0,5-1,0) 10 0,05-0,15 Глюкозу

Дистиллиров ан ную

Остальное воду в течение 20-30 мин при температуре

5 раствора 16-18с, перфузируют оксигеированным раствором, содержащим ес.%:

Хлористый натрий

0,79-0,82

Хлористый калий 0,035-0,045

Фо сфор н о ки слый

калий однозамещенный

0,005-0,007

Фосфорнокислый

натрий двузамещен0,014-0,016.

ный

Хлористый кальций

0,04-0,09

Коллагеназу

0,025-0.,05 .

Глюкозу0,05-0,15

Дистиллированную

воду - Остешьное инкубирование осуществляют в течение 20-30 мин при 37°С.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. In vitro, Robert f. Bonney Adultiver parenchymal cells in primary culture i characteristics and cell recognition, 1974, 10, 1-2, p.p.130-142.