Способ разделения гепатоцитов Советский патент 1992 года по МПК C12N5/00 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способам отделения ж-из 1оспособных гепатоцитов от поврежденных.

Целью изобретения является увеличение выходу жиэнеспособ 1ых клеток за счет разделе1н- я клеток в изотонической сахарозной среде при следующем содержании компонентов: 250 мМ сахарозы, 5 мМ КС1, .0,4 мМ КН2,Р04 , - 1,6 мМ Na I-iPO, , 0,8 мМ MgCl, 1,2 мМ

CaCl

2

1% альбумина.

Прим е р , Перфузию печени крыс-самцов массой 200-250 г проводили in situ, Дл1я этого брюганую полость анестезированного тиопента- лом животного вскрывали, вводили инъекционную иглу в воротную вену и закрепляли лигатурой, а верхшою полую подсекали в месте ответвления правой почечтгой вены для оттока

-Перфузата На первом этапе печень ,, отмывали от крови со скоростью 25- 35 мл/мин раствором, содержащим 140 мМ NaCl, 5 мМ КС, 3 мМ NaHct),, 27 мМ лимоннокислого нлтрия, который насыщали газовой смесью 95% 0 и 5% COj до рН 7,А п течение 10 мин при 37°С со скоростью 25-35 мл/мпн. На втором этапе перфузию проводили с той же скоростью в течение 20-30 чин. На этом зтапе в среду вводили ЭДТА до конечной концентрации 2 . После окончания перфузии печгль извлекали из брюшной полости, быстро охлаждали до 0°С и измельчали ножтпщами п среде, содержащей 250 мМ сахарозы, 5 мМ КС1, 1,6 мМ Na.KFO, 0,4 мМ КН.Р04., 0,8 мМ MgCl;, ,2 мМ СаГЛ, 1% альбумина (рН 7,4). Кусочки ткани подвергали вибрацтв1 в охлажлетгиой сахарозно-солевой среде с частотой 50 Гц

аяД СЛ

lOBi

со

ел

31510356

в течение 60 с с помощью устройства, электродвигатель которого приводит и возврат ю-поступатёльное движение пестик Полученную после вибрации суспеизшо клеток фидьтровали через нейлон и центрифугировали при 50 g в TCMeime 4 мин. При этом суспензия клеток раяделштась на 2 фракции:

стпиё. сукцината (5 мМ) определяли прлярографически. Результаты представлены в таблице,

Из таблицы видно, что в нижней фракции находятся интактные клетки (жизнеспособность 93%), обладающие высоким эндогенным дыханием. Эндогенное дыхание клеток Н жнего слоя

ИзоС рётенцр относится к бно- техпологии, ,я имоино к способам отделения /кпяисспособных гепатоцитов от попрсх денны:-:. Целью изобретения является увеличение пмхопа жизнеспособных клеток, Сусненямю гепато- цитов в изото}гичес 1;пй сахярозе, содержащую 0,8 мМ MgCl, КС1, 1,6 мМ , 0,4 мМ , 1,2 мМ CaClj н 1% альбумина,центри- фуг прутт при 50 g n течение. 4 мин. При зтом суспенчир клеток разделяется на 2 фракции: нижнюю, более темгд ую, и верхшою, светлую. Фракции разл.еляют, после с --спендируют в солевом растворе и смтррде.ттяют жизнеспособность, Инт;) клетки содержатся в нижней, фракции . 1 табл.

нюкшою, более темную, и верхнюю, свет-Ю С1лабо стимулируется сукцинатом, в

лую„ Фракции разделяли, после чего

суспендировали в солевом растворе,

содержащем 140 мК NaCl, 5 мМ KCl,

0,8 мМ-MgSO, 1,6 мМ., 0,4 нМ

KH2P04J 25 мМ NaHCO, 1 мМ СаС

(рН 7,А).

Полученные после промывки клетки исследовали. Жизнеспособность определяли методо 5 окрашивания трипано- пым синим, скорость эндогенног о дыхания

(Vjy.) в отсутствие и присут-

норме не проникающим через плазмат ческую мембрану,

В верхнем слое большинство клет прокрашивается три паковым CKiimif (5 эндогенное дыхание в 8 раз ниже, ч в клетках нижней фракции. стимулирует дыхание более чем в I раз,

Вьтход жизнеспособных клеток из всей печени в нроцентах составил 28,3% по предлагаемому способу

20

1 52{12 122 5У2М5 П2 ° НУ5 - 2 ) 1 общее количест}зо клеток

25

растворе, о т

-19,6% по известному способу,; е, выше на 44% по предлагаемому особу.

ормула изобретен и

тем

ли , что, с целью

жизнеспособности рование проводят харозной среде пр жании компоне}1тов 5 мМ хлористого к форнокислого кали 1,6 мМ фосфорноки замещенного, 0,8 ния, },2 Ml-t хлори альбумина.

Способ разделения гепатоцитов путем дезагрегации печени, фракционирования полученных клеток в среде разделения на две фракции, отделения нижней фракцди -с последутощей очисткой гепатоцитоп протчванием в солевом

норме не проникающим через плазматическую мембрану,

В верхнем слое большинство клеток прокрашивается три паковым CKiimif эндогенное дыхание в 8 раз ниже, чем в клетках нижней фракции. стимулирует дыхание более чем в I раз,

Вьтход жизнеспособных клеток из всей печени в нроцентах составил 28,3% по предлагаемому способу

растворе, о т

тем

личающийся , что, с целью увеличения выхода

жизнеспособности клеток, фракционирование проводят в изотонической сахарозной среде при следующем содер- жании компоне}1тов: 250 мМ сахарозы, 5 мМ хлористого калия, 0,4 мМ фосфорнокислого калия однозамещенного, 1,6 мМ фосфорнокислого натрия, дв у- замещенного, 0,8 мМ хлористого магния, },2 Ml-t хлористого кальция 1% альбумина.