Способ получения иммобилизованного плазминогена Советский патент 1982 года по МПК C12N11/06 C12R1/80 

(54)) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАННОГО ПЛАЗМИНОГЕНА.

Изобретение относится к технологии получения шммобилизёванных препаратов и может быть использовано S фермептней пр(.- г/ышленности и медицине, а именно в медицине в терапевтических целях, поскольку целый ряд заболеваний человека обуслевлен специфической ферментной недостаточностью.

Иммобилизация биологически активных соединений, в частности ферментов, широко используется для их МОДИ

фикации.--Таким способом повышак1Т температурную стабильность ферментов, устойчивость к действию денатурирующих агентов, продлевают время действия ферментов.

Плазминоген - профермент основного компонента противосверты заю1цей системы крови плазмина, основная физиологическая роль которого - лизис образовавшихся фибриновнх сгустков (тромбов ).

Известны способы иммобилизащии плазминогена с помощью ковалентного связывания с носителем. Например, способ иммобилизации плазминогена на активированной бромцианом сефарозе С13.

Наиболее близким к предлагаемому является способ иммобилизации плазминогена на активированной, бромцианем с,ефарозе. Полученные по этому способу препараты иммобилизованного плаз1 многена содержат 0,7 - 1,3 мг белкг на 1 г сухой сефарозы, а удельная активность препарата после активации составляет 1,5-3,1 каарлнолитн10ческих единиц на 1 мг белка 2 .

Недостатком указанных способов является то, что иммобилизацию плазминогена осуществляют путем ковалентного связывания, в результате чего

15 снижается фибринолитическая активность и ПОЭТОМУ препараты не могут испЬльзеваться в медицинских целях.

Цель изобретения - повышение удельной активности целевого продукта.

20

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения иммобилизованного плазминогена с использованием в качестве носителя активированной бромицианом сефарозы,

25 в качестве носителя используют связанную с фибриногеном активированную бромцианом сефарозу, а иммобилизацию проводят в 0,1 М фосфате натрия рН 7,6 с последующим удалением не30специфически сорбированного плазминогена промывкой тем же буфером с добавлением 0,5 М хлористого натрия При условиях аффинной иммобилизации происходит сорбционное связывание фермента с носителем на основ естественного биоспецифического сре ства, что позволяет получить препар ты с регулируемой способностью эк тивироваться в плазмин. Аффинное связывание плазминогена, а после его активации и плазмина, с фибрино геном реализуется не через активный центр, а через лизин-связывающие /частки. Активный центр плазмина при соединении с фибриногеном остается свободным-и способен взаимодействовать с белковыми субстрами, в частности с.казеином. Пример 1, Активацию сефаро осуществляют по обычной методике, Бычий фибриноген подвергают диализу против ОД М фосфатного буфера при рН 7,8 на колоде в течение 24 ч против 10 л буфера. Затем к 16 мп активированной сефарозы добавляют 71 мл отдиализированного фибриногена, Реак ция связывания протекает при 4°С под аргоном в течение 19 ч-. Несвязавший ся фибриноген отмывают последователь но 0,1 М фосфатным буфером, рН 7,8 (2-3 л), 0,1 М трис-фосфатным буфером, рН 8,6;1 М хлористым натрием, 0,025 И Е-аминокапроновой кислотой (3 л), 0,1 М трис-фосфатным буфером рН 4,1 ; 1 М хлористым натрием и 0,025 М 8-аминокапроновой кислотой, рН 7,6 (2 л;, 0,1 М НзРО4 и 0,2 М глицерином (2 л) 0,05 М трис-НзРО4 0,1 М хлористыгл натрием 0,025 М б-аминокапроновой кислоты рН 7,6 12л Отмытую фибриноген-сефарозу хранят при 4°С с МаМОз, Эффективность связывания - 0,150 г фибриногена на 1 г сефарозьи (сухой) или 40 мг на 1 мл серофазы, 4 мл плазминогена в 0,1 М фосфатном буфере, рН с концентрацией белка 1 мг/мл и удель В 1 и 2 опыте исходная активность 10 ке/мг; в 3-6 опытах исходная активность. С, 5 ке/мг. ной активностью 10 ке/мг медленно пропускают через 1 мл ( осевшей ) фибриноген-сефарозы, упакованной в капиллярную колонку. Неспецифически сорбированный плазМиноген удаляют промыванием колонки этим же буфером,. а затем буфером с добавлением 0,5 М хлористого натрия до исчезновения белка в промывных водах. На геле иммобилизуется 2 мг плазминогена. удельная активность плазминоген-фибриноген-сефарозы после активации стрептокиназой 10 ке/мг сорбировавиюгося профермента. Через этот плазмино- гвн-фибриноген-гель таким же способом пропущено 2 мл раствора плазминогена, содержащего 2 мг белка. После удаления неспецифически сорбировавшегося плаз№1ногена на геле иммобилизовалось еще 2 мг белка, удельная активность геля ке/мг, Пример 2, Через колонку, заполненную 2 г-ет фибриноген-сефарозы пропущено ( как описано в примере I) 2 мл плазминогена с концентрацией 5 мг/мл- и удельной активностью 6,5 ке/мг. Затем удаляют неспецифически связавшийся белок (как описано в примере 1), На фибриноген-сефарозе им1 1обилизовапось 3,8 мг белка на 1 мл геля, Удельная активность геля 5,6 ке/мг,. Через полученную плазминоген-фибриноген-сефарозу тризиды пропускают по 2 мл раствора плазминогена, содержащего 15 мг белка. После каждого пропускания гель отмывают от неспецифически связавшегося белка(пример 1), После 1,2 и 3-го пропускания плазмн л ногена содержание плазминогена в препарате составляет соответственно 15,4; 22,4 и 30,0 мг белка,, а удель-7 ная активность снижается до соответственно 2,3/ 1,5 и 0,8 ке/мг. Результаты испытаний приведены в таблице.

Таким образом, плаэминоген при связывании с фибриноген-.офароэой в количестве 2 мг на мл геля полностью сохраняют свою активность после активации стрептокиназой. Посл активации стрептокиназой активность: плазмина обнаруживается только в фракции геля и гель может быть многократно использован для определения активности. Это указывает на то, что после активации плазминогена в плазмин он остается в связанном с носителем состояний.

Активность полученных препаратов иммобилизованного плазминогена после активации стрептокиназой близко к исходной активности растворимого плазминогена и значительно превышает удельную активность препаратов, полученных при ковалентной иммобилизации плазминогена 2 3,

Используя предлагаемый способ иммобилизации, можно достигнуть полного сохранения активности плазминогена при иммобилизации,- создавать препараты, обладакицие большой емкостью по отношению к плазминогену для обеспечения организма тромболитическим агентом в случае его дедостаточности; целена5травленр создаватЬ лекарс твенныепрепарйы с заданными свойствами п 5 количеству иммобилизованного плазминогена и активности.

Этот способ может быть использован в медицинских целях для создання лекарственных препаратов тромболитического действия.

В отличие от ковалентного связывания, иммобилизацию плазминйгена осуществляют сорбционно на основе естественного бирспецифического срод.ства, что позволяет получить препараты с регулируемой способностью активироваться в плазми.

Формула изобретения Способ получения иммобилизованного плазминогена с использованием в качестве носителя активированной бромцианом сефарозы, отличающий5с я тем, что, с целью повышения удельной активности целевого продукта, в качестве носителя используют активированную бромцианом сефарозу, связанную с фибриногеном, а иммобилизацию проводят в 0,1 М фосфате натрия, рН 7,6 с последующим удалением неспецифическн сорбированного плазминогена проьывкой тем же буфером с добавлением 0,5 М хлористого натрия.

Источники информации,

5 принятые во внимание при экспертизе

0 1376, V, 25t, p. 5956-5965.

2.КУДИНОВ . C.A.,Ерецкая E.В.Активация плазминогена при его икФлобилизации. Украинский биохимический журнал. Т. 51 1979, 4, с.340-344.