СПОСОБ ХРАНЕНИЯ ПРЕПАРАТА ПРОТЕИНАЗ Российский патент 1994 года по МПК C12N9/96 C12N9/99 

Изобретение относится к биохимической технологии, а именно к способам хранения (консервации) протеиназ и других ферментов, применяемых в медицине, биотехнологии, научных исследованиях.

Известны различные способы хранения ферментов. Высушивание ферментов при низких температурах (лиофилизация) в присутствии стабилизирующих добавок является одним из наиболее распространенных способов их хранения. Нужно однако отметить, что лиофилизация - это достаточно трудоемкий и энергоемкий процесс, требующий специального дорогостоящего оборудования. При лиофилизации, кроме того, часто происходит значительная потеря ферментативной активности. Перед использованием лиофилизированные препараты необходимо растворить. Срок хранения лиофилизи- рованных ферментов зависит от природы самого фермента, температуры, влажности и других условий хранения и колеблется от нескольких месяцев до нескольких лет. Хранят лиофилизированные препараты, как правило, при низких температурах.

Ферменты, производимые в промышленных масштабах (например, протеиназы, амилазы и др. ), отличающиеся достаточно высокой стабильностью, высушивают на специальных распылительных сушках при температуре +70-+100^оС. При распылительной сушке также происходит потеря ферментативной активности. Кроме того, при таком способе высушивания ферментов часто происходят выбросы сухого ферментативного препарата в атмосферу, что приводит к загрязнению окружающей среды. Нужно также отметить, что распылительные сушки - весьма энергоемкие и малопроизводительные установки.

Наибольшие проблемы возникают однако при хранении водных растворов ферментов. Достаточно эффективным и широко распространенным является хранение водных растворов ферментов и других белков в замороженном состоянии при -70^оС. Хранение ферментов в условиях глубокой заморозки является однако дорогостоящим, требует специального холодильного оборудования и поэтому не всегда доступно.

Многие ферменты, используемые в научных исследованиях, хранят в виде водных растворов при температуре -10, -20^оС в незамороженном состоянии в присутствии криопротекторов. В качестве криопротекторов наиболее часто используют глицерин, метанол, диметилсульфоксид. Концентрация ДМСО в водных растворах ферментов, подлежащих хранению при -10, -20^оС, составляет 10-20% .

Нужно отметить, что растворы ферментов и других белков с 10-20% ДМСО или другими криопротекторами не способны длительное время храниться при комнатной температуре вследствие наличия примесных протеиназ. Сказанное справедливо и в отношении самих протеиназ, биологическая функция которых состоит в том, что они расщепляют белки до более простых пептидов. Обладая способностью расщеплять пептидные связи в других белках, протеиназы подвержены также и самоперевариванию (автолизу). По этой причине протеиназы в водных растворах при комнатной температуре крайне нестабильны.

Цель изобретения - создание простого и дешевого способа хранения протеиназ в виде водно-солевых растворов, позволяющего увеличить время хранения ферментов при комнатной температуре.

Это достигается путем введения в водно-солевые растворы протеиназ ДМСО в концентрации 25-60% , преимущественно 35-50% , что позволяет хранить растворы ферментов (протеиназ) при комнатной температуре в течение по крайней мере одного года без значительной потери их ферментативной активности. Предлагаемый способ не требует введения в растворы ферментов детергентов и бактерицидных веществ. В литературе не найдено сведений о применении ДМСО для хранения протеиназ и других ферментов при комнатной температуре.

Решение проблемы хранения протеиназ в водных растворах заключается в том, чтобы найти вещество, обладающее способностью ингибировать на 100% (причем обратимо) протеолитическую активность. Показано, что ДМСО в диапазоне концентраций от 25 до 60% обратимо ингибирует активность протеиназ различного происхождения. О таком свойстве ДМСО ранее не было известно.

ДМСО - жидкость с температурой замерзания +19^оС и температурой кипения +189^оС, с водой смешивается во всех отношениях. ДМСО является растворителем для широкого круга органических веществ, в том числе биополимеров - пептидов, белков, нуклеиновых кислот, полисахаридов. ДМСО способен храниться, не разлагаясь, в течение длительного времени (от нескольких лет до 10 лет и более) и не накапливает токсичных продуктов распада. ДМСО не токсичен для организма и обладает терапевтическим (антиаллергическим, антивоспалительным, аналгетическим) действием. В медицине ДМСО применяют как наружно (в виде аппликаций), так и в виде инъекций. В концентрации 25-50% ДМСО оказывает бактерицидное действие на микроорганизмы, т. е. является консервантом.

Совокупность вышеперечисленных свойств ДМСО в сочетании с его способностью ингибировать активность протеиназ делает его прекрасным консервантом для хранения водно-солевых растворов протеиназ при комнатной температуре.

Влияние ДМСО на активность ферментов исследовано недостаточно полно. Согласно данным литературы в присутствии высоких концентраций ДМСО (5М) ингибируется активность таких ферментов, как уреаза, α-амилаза, различных дегидрогеназ и трансаминаз (В кн. : D. Martin, H. G. Hauthel. Dimethylsulphoxid. Akademie-Verlag, Berlin, 1971). Сильнее всего ингибируется активность (на 62-100% ) малатдегидрогеназы, глутаматдегидрогеназы, щелочной фосфатазы. С другой стороны, известны ферменты, активность которых в присутствии ДМСО, наоборот, возрастает (например, кислая глицерофосфатаза из печени крыс) (D. Martin, H. G. Hauthel, 1971). В присутствии ДМСО обратимо ингибируется активность Na⁺, K⁺-АТР-азы (Мирсалихова Н. М. , Биохимия, 1978, т. 43, вып. 1, с. 34). При этом уже при концентрации ДМСО, равной 25-30% , активность фермента подавляется (обратимо) практически полностью. В цитируемой работе показано, что ДМСО в диапазоне концентраций от 0 до 50% хоть и не стабилизирует фермент, является щадящим в отношении его необратимой инактивации. В присутствии более высоких концентраций ДМСО происходит быстрая необратимая инактивация Na⁺, K⁺-АТР-азы. В то же время в интервале концентраций от 20 до 30% ДМСО проявляет стабилизирующее действие на фермент в присутствии 20% мочевины, которая сама по себе вызывает денатурацию Na⁺, K⁺-АТР-азы.

Что же касается протеиназ, то в литературе нашли лишь данные о воздействии ДМСО на трипсин и химотрипсин (Хургин и соавт. Известия АН СССР, Серия Хим. , 1968, 2840, 2843). Показано, что в 100% -ном ДМСО трипсин и химотрипсин могут образовывать ковалентные комплексы с синтетическими субстратами. В отсутствии воды эти комплексы стабильны и не диссоциируют. Нужно отметить, что растворы протеиназ в 100% -ном ДМСО крайне нестабильны: белки очень быстро выпадают в осадок. В цитируемой работе, к сожалению, не исследовалось поведение трипсина и химотрипсина в смеси вода + ДМСО.

На примере нескольких протеиназ показали, что степень ингибирования протеолитической активности возрастает с увеличением концентрации ДМСО. Так, в буфере 50 мМ трис-HCl, pH 8,5 + 1 мМ CaCl₂ в присутствии 50% ДМСО активность щелочной протеиназы из Bacillus subtilis ингибируется на 99,8% . В том же буферном растворе с 50% ДМСО активность протеиназы К составляет лишь 0,1% , т. е. ингибируется на 99,9% . Сходные результаты по ингибированию активности протеиназ в присутствии ДМСО были получены и для других буферных систем. Так, в универсальном буфере (содержащем лимонную кислоту 6,8 г/л, КН₂РО₄ 3,893 г/л, Н₃ВО₃ 1,769 г/л, диэтилбарбитуровую кислоту 5,266 г/л, NaOH до нужного рН) с рН 8,2 и в 50 мМ глицин-NaOH в присутствии 50% ДМСО щелочная протеиназа В. subtilis ингибируется практически на 100% . Металлопротеиназа из Bacillus megaterium в 50 мМ трис-HCl, pH 8,2 + 2 мМ CaCl₂ и в буфере 50 мМ глицин-NaOH, pH 8,2 ингибируется также одинаково - на 97,5% . Вероятно, при более высоких концентрациях ДМСО можно достичь и 100% -ного ингибирования активности металлопротеиназы. Однако концентрации ДМСО, равной 50% , уже достаточно, чтобы раствор этого фермента длительно хранился при комнатной температуре.

Степень ингибирования протеолитической активности некоторых ферментов может зависеть от состава буферных растворов. Так, в универсальном буфере (состав приведен выше) с рН 8,2 в присутствии 50% ДМСО трипсин ингибируется лишь на 80% и через несколько дней хранения при комнатной температуре теряет значительную часть своей активности. Сильное влияние на ингибирование активности трипсина в присутствии ДМСО оказывают ионы Са ⁺⁺. Так, в 0,1 М трис-HCl, pH 8,2 с 50% ДМСО трипсин ингибируется на 98% ; в том же буфере с 2 мМ Са⁺⁺ степень ингибирования трипсина составляет 92% . Следует отметить, что трипсин в небольшой степени сохраняет свою протеолитическую активность (на уровне 2% ) даже в присутствии 60% ДМСО. Эта концентрация ДМСО является предельно допустимой для трипсина, - при более высокой концентрации растворителя трипсин выпадает в осадок. Таким образом, для хранения протеиназ в присутствии ДМСО могут быть использованы различные буферные растворы. Однако при работе с тем или иным буфером для каждого фермента необходимо проводить соответствующее исследование, - в некоторых буферных системах может происходить выраженный автолиз протеиназ даже в присутствии предельно высоких концентраций растворителя, выше которых фермент выпадает в осадок.

П р и м е р 1. ЩЕЛОЧНАЯ ПРОТЕИНАЗА ИЗ BACILLUS SUBTILIS ШТАММ 72.

Щелочная протеиназа из промышленного штамма B. subtilis 72 (по старой номенклатуре - B. licheniformis) относится к классу сериновых протеиназ (Люблинская Л. А. , Якушева Л. Д. , Степанов В. М. Биоорг. химия, 1977, 3, 273). Лиофилизированный препарат фермента с удельной активностью 24 ед. /мг белка (по субстрату п-нитроанилид-бензил-оксикарбонил-L-Ala-L-Ala-L-Leu ) был получен в лаборатории химии белка ВНИИгенетика (Москва).

4 мг лиофилизированного фермента растворяют в 4 мл буфера (50 мМ трис-HCl, pH 8,5 + 1 мМ CaCl₂). Полученный раствор делят на четыре порции. К первой порции добавляют концентрированный ДМСО (свежеперегнанный) до концентрации 25% . К второй порции ДМСО добавляют до концентрации 35% . К третьей порции ДМСО добавляют до концентрации 50% . В четвертую порцию фермента ДМСО не добавляют (контроль). Полученные растворы щелочной протеиназы хранят при комнатной температуре (18-22^оС). Периодически, с интервалом 1-2 недели, определяют активность фермента.

Определение активности фермента проводили, как описано (Люблинская и соавт. Биоорг. химия, 1977, 3, 273). В качестве хромофорного субстрата используют синтетический трипептид-п-нитроанилид-бензил-оксикарбонил-L-Ala-L-Ala-L-Leu (ZAALNA). За единицу активности фермента принимают активность такого его количества, которое в данных условиях гидролизует 1 мкмоль субстрата в 1 мин.

Результаты определения активности щелочной протеиназы из Bac. subtilis 72, хранившейся в присутствии ДМСО и без такового, представлены в табл. 1.

Как видно из данных, представленных в таблице, исходная активность фермента в контрольном растворе (без ДМСО) составляет 20,33 ед/мл. При хранении активность фермента падает и к концу шестой недели хранения она составляет всего лишь 3,97 ед/мл, т. е. около 19% от начальной. В то же время через четыре недели хранения фермента в растворе с 25% ДМСО активность фермента составляет 21,04 ед/мл (67% от исходной), а к концу 11 недели активность фермента падает до 19,2 ед/мл (62% от исходной). В присутствии 35% ДМСО наблюдается еще более выраженная стаби- лизация фермента. В этом случае к концу четвертой недели активность фермента составляет 21, 46 ед/мл, т. е. сохраняется около 79% от исходной активности, и при дальнейшем хранении раствора (вплоть до 11 недель) падения активности протеиназы не происходит. Дальнейшее повышение концентрации ДМСО до 50% приводит к полному прекращению автолиза, падения активности протеиназы при хранении не регистрируется.

Эксперимент по консервации растворов щелочной протеиназы из B. subtilis 72 был продолжен. Пробирки с раствором щелочной протеиназы без ДМСО (контроль) и с раствором, содержащим 50% ДМСО, продолжали хранить в течение 52 недель. После этого в контрольном и опытном образцах была проверена ферментативная активность. Как оказалось, в контрольном образце активность практически отсутствовала. В растворе, содержащем 50% ДМСО, сохранилось 80% активности фермента. Небольшое падение активности щелочной протеиназы (на 20% ) может быть связано с процессами окисления ДМСО, происходящими в присутствии кислорода на свету (растворы хранили в 1,5 мл полиэтиленовых пробирках фирмы Eppehdorf на свету). Хранение соответствующих растворов в бескислородной атмосфере (в запаянных ампулах) могло бы еще более увеличить сохранность фермента.

П р и м е р 2. ПРОТЕИНАЗА К ИЗ TRITIRACHIUM ALBUM.

Протеиназа К принадлежит к сериновым протеиназам. Лиофилизированный препарат фермента производства фирмы SERVA имел удельную активность 12,5 ед. /мг (по субстрату п-нитроанилид-бензил-оксикарбонил-L-Ala-L-Ala-L-Leu).

Готовят раствор протеиназы К в буфере (50 мМ трис-HCl, pH 8,5, + 1 мМ CaCl₂) с концентрацией 1,6 мг/мл. Полученный раствор делят на четыре порции. К первой порции добавляют ДМСО до концентрации 25% , к второй - до концентрации 35% , к третьей - до концентрации 50% . Четвертая порция служит контролем (не содержит ДМСО). Растворы хранят при комнатной температуре. Определение активности протеиназы К производили, как в примере 1.

Результаты определения активности фермента в процессе хранения растворов представлены в табл. 1. Как видно из данных, представленных в таблице, протеиназа К является очень стабильным белком и хорошо хранится в водно-солевом растворе даже в отсутствии ДМСО. Статистически достоверное падение активности фермента (на 3-5% ) в отсутствии ДМСО наблюдается лишь к концу 4-й недели хранения раствора. К концу 11-й недели активность фермента в растворе без ДМСО составляет 14,87 ед/мл (75% от исходной).

Присутствие в растворе ДМСО стабилизирует протеиназу К. Так, уже при концентрации ДМСО в растворе, равной 35% , активность фермента при хранении не падает и к концу 11 недели составляет 100% от исходной.

Контрольный раствор протеиназы К (без ДМСО) и раствор с 50% ДМСО продолжали хранить при комнатной температуре в течение 52 недель. После этого в растворах определяли ферментативную активность. Как оказалось, в контрольном растворе сохранилось около 8% от исходной ферментативной активности. В то же время в растворе, содержащем 50% ДМСО, сохранилось 83% активности протеиназы. Небольшое падение активности протеиназы К, как и в случае с протеиназой из B. subtilis 72, может быть связано с тем, что растворы хранили на свету в кислородной атмосфере.

П р и м е р 3. МЕТАЛЛОПРОТЕИНАЗА ИЗ BACILLUS MEGATERIUM B-3937.

Препарат металлопротеиназы из промышленного штамма B. megaterium B-3937 получен в лаборатории химии белка ВНИИгенетика. Удельная активность лиофилизированного препарата составляла 2,56 ед. /мг белка (по субстрату Dnp-Gly-Gly-Ile-Arg).

Готовят раствор металлопротеиназы в буфере, содержащем 50 мМ трис-HCl, pH 7,0 + 10 мМ CaCl₂. Концентрация фермента в растворе объемом 4 мл составляла 1,5 мг/мл. Раствор фермента делят на четыре порции. В первую из них добавляют ДМСО до концентрации 25% , во вторую ДМСО добавляют до концентрации 35% , в третью - до концентрации 50% . Четвертая порция служит контролем, т. е. не содержит ДМСО. Приготовленные растворы металлопротеиназы хранят при комнатной температуре. Периодически через недельные интервалы проводят определение активности фермента.

Определение активности металлопротеиназы проводили сорбционным методом (Люблинская и соавт. Биоорг. химия, 1987, 13, 1331). В качестве хромофорного субстрата использовали синтетический динитрофенилированный тетрапептид Dnp-Gly-Gly-Ile-Arg. За единицу активности фермента принимали активность такого его количества, которое в данных условиях гидролизует 1 мкмоль субстрата в 1 мин.

Результаты определения активности растворов металлопротеиназ в процессе хранения при комнатной температуре представлены в табл. 1.

Как видно из представленных данных, исходная активность фермента в контрольном растворе (без ДМСО) составляет 2,23 ед/мл. При хранении раствора активность фермента резко падает, к концу 4-й недели хранения она составляет 1,26 ед/мл (55% от исходной активности), а к концу 11-й недели активность фермента составляет 0,66 ед/мл (29% от исходной).

Что же касается активности металлопротеиназы в растворах, содержащих 25% , 35% и 50% ДМСО, то она практически не изменяется, т. е. сохраняется на исходном уровне в течение 11 недель.

Как и в предыдущих опытах, контрольный раствор протеиназы (без ДМСО) и раствор, содержащий 50% ДМСО, оставили на хранение при комнатной температуре. Определение ферментативной активности в растворах через 52 недели хранения показало, что в контрольном образце активность отсутствует. В то же время в образце с 50% ДМСО сохранилось около 81% от исходной активности металлопротеиназы.

П р и м е р 4. ТРИПСИН ИЗ ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ ТЕЛЯТ.

Использовали препарат трипсина фирмы "SERVA". Трипсин является сериновой протеиназой. Удельная активность лиофилизированного препарата составляла 0,862 ед. /мг белка (по субстрату пара-нитроанилид-бензоил-d, l-аргинину).

Готовят раствор трипсина в 0,05 М трис-HCl-буфере рН 8,2, содержащем 0,15 М NaCl, и в том же буфере, содержащем 40, 50, 55 и 60% ДМСО. Концентрация фермента в растворах составляла около 1 мг/мл. Растворы ферментов хранят на свету при комнатной температуре в герметично закрывающихся пробирках. У полученных растворов через определенные интервалы времени определяют активность трипсина.

Определение активности трипсина производили спектрофотометрическим методом (Erlager et all. , Archiv, Biochem. Biophys. 1961. V. 95. P. 271-278). В качестве хромофорного субстрата использовали синтетический пара-нитроанилид-бензоил-d, l-аргинин. За единицу активности фермента принимают активность такого его количества, которое при 37^оС в 0,05 М трис-HCl-буфере с рН 8,2, содержащем 2 мМ CaCl₂, гидролизует 1 мкМ субстрата за 1 мин.

Результаты определения активности трипсина в процессе хранения в течение 12 недель представлены в табл. 2.

Как видно из представленной таблицы, исходная активность фермента в контрольном растворе (буфер без ДМСО) составляет 0,830 ед. /мл. При хранении раствора протеолитическая активность резко падает, и к концу первой недели составляет 0,21 ед. /мл, а к концу пятой недели она близка к нулю.

Что же касается активности трипсина в буферных растворах с ДМСО, то, как видно из табл. 2, она изменяется не столь драматично, т. е. имеет место стабилизация фермента. Однако эта стабилизация не столь ярко выраженная, как в случае бактериальных или грибных протеиназ. Так, исходная активность трипсина в буфере с 40% ДМСО составляет 0,96 ед. /мл. К концу первой недели хранения она падает до 0,90 ед. /мл, а через пять недель хранения активность трипсина составляет 0,64 ед. /мл. К концу 12 недели хранения активность трипсина составляет 0,34 ед. /мл, т. е. около 35% от исходного значения.

При увеличении концентрации ДМСО наблюдается отчетливое замедление скорости автолиза трипсина. Так, к концу 12 недели хранения в буфере с 50% ДМСО сохраняется 45% от исходной активности трипсина. В то же время в присутствии 55 и 60% ДМСО сохраняется соответственно 50 и 57% активности фермента. Дальнейшее повышение концентрации ДМСО нецелесообразно, поскольку при концентрации растворителя, равной 65% , трипсин выпадает в осадок.

Таким образом, раствор трипсина в присутствии ДМСО при комнатной температуре хранится значительно хуже, чем изученные растворы бактериальных протеиназ. Более эффективным должно быть, по видимому, хранение растворов трипсина при температурах от 0 до 10^оС, т. е. в холодильнике.

Изобретение, таким образом, обеспечивает простой, дешевый и эффективный способ хранения препаратов протеиназ при комнатной температуре в течение длительного времени. Важным преимуществом предлагаемого способа является то, что он позволяет хранить ферменты в растворе в широком диапазоне температур - от -20^оС до +30^оС (ДМСО как криопротектор). При этом уже при 4^оС эффективность хранения ферментов может достигать практически 100% , т. е. активность протеиназ в течение по крайней мере одного года при этой температуре практически не будет изменяться. Хотелось бы также обратить внимание на универсальный характер предложенного консерванта. ДМСО может быть использован для хранения в растворе широкого круга белков, отличных от протеиназ. Действительно, примесные протеиназы - основная причина нестабильности многих ферментов. Полное ингибирование этих примесных протеиназ может, очевидно, обеспечить длительное хранение ферментов в растворе при комнатной температуре (это возможно в том случае, если данные ферменты в присутствии ДМСО достаточно стабильны против тепловой денатурации). В настоящее время консервирующий эффект ДМСО продемонстрирован для девяти ферментов, главным образом протеиназ. Благодаря предложенному техническому решению во многих случаях уже сегодня можно отказаться от лиофилизации ферментов или их высушивания на распылительных сушках и хранить их в водных растворах, обходясь даже без холодильного оборудования. Применение ДМСО для консервации белков сулит, таким образом, значительный экономический эффект. Высокая химическая стабильность ДМСО, его антимикробное действие, безвредность для организма животных и человека позволяют к тому же использовать препараты ферментов, содержащие этот консервант, в качестве готовых лекарственных форм. (56) Мирсалихова Н. М. , Биохимия, 1978, т. 43, вып. 1, с. 34.

Хургин и др. Известия АН СССР, Сер. Химия, 1968, с. 2840-2843.

Использование: биотехнология, медицина. Сущность изобретения: используют диметилсульфоксид (ДМСО) в концентрации предпочтительно 20 - 50% для хранения протеиназ в водно-солевом растворе буфера с рН, соответствующим рН-оптимуму фермента, при комнатной температуре в течение по крайней мере одного года без значительной потери их ферментативной активности, что позволяет отказаться от лиофилизации ферментов. 2 табл.

СПОСОБ ХРАНЕНИЯ ПРЕПАРАТА ПРОТЕИНАЗ, предусматривающий приготовление раствора фермента и введение в него диметилсульфоксида, отличающийся тем, что, с целью увеличения срока хранения препарата при комнатной температуре, готовят раствор фермента в буфере с рН, соответствующим рН-оптимуму стабильности фермента.