Изобретение относится к биотехнологии, в частности к производству ферментов и пищевых добавок, и касается нового бактериального штамма, продуцирующего внеклеточную нейтральную металлопротеиназу. Нейтральные металлопротеиназы широко используются в народном хозяйстве и могут применяться в медицине и парфюмерии, в пищевой и кожевенной промышленности, а также в сельском хозяйстве. Металлопротеиназа, секретируемая культурой Bacillus megaterium, может быть использована также при производстве пищевого подсластителя аспартама.
Известен штамм B. megaterium ВКПМ В-3937 - продуцент нейтральной металлопротеиназы, которую можно использовать для синтеза аспартама. Активность этого штамма составляет в среднем 9,4 ед/мл по модифицированному методу Ансона. Штамм-прототип обладает недостаточно высоким уровнем продукции нейтральной металлопротеиназы, что затрудняет его использование в промышленном производстве.
Цель изобретения - повышение уровня продукции нейтральной металлопротеиназы B. megaterium, пригодной для синтеза аспартама.
Цель изобретения достигается созданием штамма Bacillus megaterium, зарегистрированного во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов под номером ВКПМ В-5818.
Штамм B. megaterium ВКПМ В-5818 получен из штамма B. megaterium ВКПМ-3937 в результате мутагенеза N-нитро-N- метилнитрозогуанидином и отбора мутантов с повышенной продуктивностью нейтральной протеиназы на чашках с молочным агаром и устойчивых к антибиотику стрептомицину в концентрации 20 мкг/мл.
При культивировании на дрожжеполисахаридной среде в течение 23-25 ч с интенсивной аэрацией при 30о С штамм ВКПМ-5293 выделяет только один фермент - нейтральную металлопротеиназу, активность которой достигает 3-5 ед/мл при определении с помощью синтетического субстрата DNP-Gly-Gly-lle-Arg (Люблинская Л. А. и др. Биоорг. химия, 1987, 13, 1331-1337) и 20-25 ед/мл при определении модифицированному методу Ансона с казеинатом натрия в качестве субстрата (ГОСТ 20264.2-74). Подобная активность соответствует наличию 800 мг очищенного до гомогенности фермента в 1 л культуральной жидкости.
Нейтральная металлопротеиназа, продуцируемая штаммом B. megaterium ВКПМ В-5818, не содержит примесей других протеиназ, обладает высокой специфичностью и активностью при гидролизе пептидных связей, образованных с участием аминогруппы фенилаланина, и устойчивостью к ингибированию высокими концентрациями реагентов, используемых при синтезе аспартама, что является важным фактором для ее использования при синтезе этого пищевого подсластителя.
Культурально-морфологические признаки штамма B. megaterium ВКПМ В-5818.
Морфология. Грамположительная палочка размером 2,0х5,0х1,2 мкм, образует цепочки клеток. Спор не образует.
Клетки растут на минимальных солевых жидких и агаризованных средах, содержащих углеводы.
При росте на мясопептонном агаре, агаре Хоттингера и L-агаре при 30о С на 2-е сутки роста образует плоские шероховатые колонии с приподнятым центром, диаметром 3-5 мм. Пигмент не выделяет.
На молочном агаре на 2-е сутки роста при 30оС образует плоские шероховатые матовые колонии с приподнятым центром, диаметром 3-5 мм и зоны гидролиза молока вокруг колоний, диаметром 4-6 мм. Пигмент не выделяет.
На казеионовом агаре на 2-е сутки роста при 30оС образует плоские шероховатые колонии диаметром 2-3 мм и зоны гидролиза казеина диаметром 3-5 мм. Пигмент не выделяет.
Биохимические свойства.
Желатину разжижает, молоко пептонизирует и коагулирует. Нитраты восстанавливает в нитриты. Крахмал гидролизует. Усваивает глюкозу, сахарозу, фруктозу, галактозу, арабинозу, ксилозу, мальтозу, маннит, глицерин.
Штамм хранят в лиофильно высушенном виде, а также на минимальной солевой агаризованной среде с глюкозой.
П р и м е р 1. Штамм B. megaterium ВКПМ В-5818 выращивают в течение 16 ч при 30оС на косяках с агаром Хоттингера. Бактерии смывают с агара физиологическим раствором и полученную суспензию используют в качестве посевного материала в количестве 1-2% от объема ферментационной среды.
В качестве ферментационной используют дрожжеполисахаридную среду следующего состава (мас. % ), имеющую после стерилизации рН 7,0;
белково-витаминный концентрат из дрожжей 3 кукурузная мука 1,5 СаCl 0,3 вода остальное
Через 24 ч культивированная на лабораторной качалке "Infors" (ФРГ) при 270 об/мин и 30оС в колбах емкостью 750 мл с 25 мл среды уровень накопления нейтральной металлопротеиназы составляет 25 ед/мл (по модифицированному методу Ансона).
П р и м е р 2. Культивирование штамма B. megaterium ВКПМ В-5818 осуществляется в дрожжеполисахаридной среде вышеуказанного состава при 30оС в 1-литровом ферменте фирмы Marubishi (Япония) при аэрации 1: 1 и скорости перемешивания 500 об/мин. Засев ферментера с 700 мл среды проводят смывом бактерий, выращенных как в примере 1, в количестве 1% по объему. Через 24 ч культивирования активность нейтральной металлопротеиназы в культуральной жидкости составляет 20 ед/мл (по модифицированному методу Ансона).
Таким образом, продуктивность заявляемого штамма B. megaterium ВКПМ В-5818 составляет 20-25 ед/мл нейтральной металлопротеиназы, что в 2-3 раза превышает уровень продукции этого фермента у штамма-прототипа B. megaterium ВКПМ В-3937. Отсутствие примесей других протеиназ, высокая удельная активность и субстратная специфичность, а также устойчивость к реагентам, используемым в процессе синтеза аспартама, являются важными особенностями нейтральной металлопротеиназы, синтезируемой заявляемым штаммом, позволяющими использовать этот фермент при синтезе пищевого подсластителя (заменителя сахара) - аспартама.
Высокая продуктивность заявляемого штамма, короткое время ферментации, а также дешевая среда культивирования позволяют рекомендовать штамм B. megaterium ВКПМ В-5818 к использованию в производстве для получения нейтральной металлопротеиназы, которую можно применять для синтеза аспартама, а также для замены других бациллярных нейтральных протеиназ, используемых в пищевой и кожевенной промышленности и в сельском хозяйстве. (56) Авторское свидетельство СССР N 1440921, кл. С 12 N 9/52, 1988.
| название | год | авторы | номер документа |
|---|---|---|---|
| Штамм бактерий BacILLUS меGатеRIUм-продуцент металлопротеиназы | 1987 |
|
SU1440921A1 |
| РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pBANP 464, КОДИРУЮЩАЯ МЕТАЛЛОПРОТЕИНАЗУ BACILLUS AMYLOLIQUEFACIENS A-50 И ШТАММ БАКТЕРИЙ BACILLUS AMYLOLIQUEFACIENS - ПРОДУЦЕНТ МЕТАЛЛОПРОТЕИНАЗЫ. | 1989 |
|
RU1679800C |
| СПОСОБ СИНТЕЗА МЕТИЛОВОГО ЭФИРА N-БЕНЗИЛОКСИКАРБОНИЛ-L-АСПАРТИЛ-L-ФЕНИЛАЛАНИНА | 1993 |
|
RU2043419C1 |
| СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-СЕРИНА | 1991 |
|
RU2008356C1 |
| ШТАММ STREPTOMYCES BAMBERGIENSIS - ПРОДУЦЕНТ МОЕНОМИЦИНА А | 1992 |
|
RU2013448C1 |
| ШТАММ STREPTOMYCES FRADIAE - ПРОДУЦЕНТ ТИЛОЗИНА | 1992 |
|
RU2018536C1 |
| ФРАГМЕНТ ДНК PCG 12, КОДИРУЮЩИЙ СИНТЕЗ β-ГАЛАКТОЗИДАЗЫ PENICILLIUM CANESCENS, И ШТАММ ГРИБОВ PENICILLIUM CANESCENS - ПРОДУЦЕНТ b-ГАЛАКТОЗИДАЗЫ | 1994 |
|
RU2080387C1 |
| Штамм бактерий BacILLUS SUвтILIS - продуцент L - фенилаланина | 1989 |
|
SU1693056A1 |
| ШТАММ БАКТЕРИЙ BREVIBACTERIUM FLAVUM - ПРОДУЦЕНТ L-ГЛУТАМИНА (ВАРИАНТЫ) | 1994 |
|
RU2084520C1 |
| ШТАММ ESCHERICHIA COLI - ПРОДУЦЕНТ L-ГИСТИДИНА | 1997 |
|
RU2119536C1 |
Использование: биотехнология может найти применение в медицине, парфюмерии, пищевой и кожевенной промышленности, а также в сельском хозяйстве. Сущность изобретения: штамм Bacillus megaterium ВКПМ В-5818 - продуцент нейтральной металлопротеиназы, за 23 - 25 ч культивирования с интенсивной аэрацией при 30C секретирует нейтральную металлопротеиназу в количестве 20 - 25 ед/мл по ГОСТ 20264.2 - 74, что в 2 - 3 раза больше по сравнению с исходным штаммом продуцентом. Металлопротеиназа, секретируемая культурой B. megaterium и не содержащая примесей щелочных протеиназ, может быть использована при производстве пищевого подсластителя аспартама.
Штамм бактерий Bacillus megaterium ВКПМ В-5818 -- продуцент нейтральной металлопротеиназы.
