Способ очистки протеолитических ферментов Советский патент 1979 года по МПК C07G7/02 

Настоящее изобретение относится к микробиологической промышленности, в ча-стности к области получения высокоочищенных и высокоактивных ферментных препаратов, которые могут быть использованы в медицине, биохимии и пищевой промышленности.

Получение высокоочищенных ферментов основано на применении различных химических способов очистки. Для этой цели успешно применяется конообменная хроматография, в частности для очистки и выделения протеолитических ферментов - хроматография на модифицированных силохромах 1. Однако этот метод недостаточно избирателен и не позволяет решить некоторые технические задачи, например извлечение ферментов с высоким выходом непосредственно из смесей с низкой концентрацией активного фермента, содержащих большое количество неорганических и органических примесей (например, из культуральной жидкости).

В связи С этим в настоящее время наиболее перспективным для избирательной очистки ферментов является мотод аффинной хроматографии, основанный «а сродстве ферментов к специфическим аналогам субстрата или ингибиторам, ковалентно связанным с нерастворимым носителем, что

позволяет разделять ферменты на основе их биологической специфичности, а потому достигать более высокой степени очистки по сравнению с видами хроматографической техники.

В настоящее время наиболее широко выделение ферментов биоспецифической хроматографией ведут с помощью биоспецифиче ских сорбентов, представляющих собой нерастворимые носители, производные агарозы, активированные бромцианом и ковалентно связанные с лигандами - специфическиМИ для данного класса ферментов веществами- аналогами субстрата 2, 3.

Известен способ очистки протеолитических ферментов путем биоспецифической сорбции 3.

Биоспецифический сорбент представляет собой нерастворимый носитель на основе агарозы, в частности активнроваиную бромцианом сефароз) 4В, ковалентно связанную с лигандом - антибиотиком грамицидином С.

Сорбцию ферментов осуществляют при рН 4,5 с помощью солевого буфера (1М раствор NaCl). При элюировании для полноты десорбции к солевому буферу добавляется органический растворитель. Выход ферментов по активности 78%, степень очистки 16 раз.

Данный способ обладает рядом недостатков, обусловленных использованием в качестве лиганда грамицидина С. Грамицидин С сравнительно малодоступен. Синтез сорбента на его основе сонрял ен с значительными трудностями, связанными с низкой растворимостью лиганда, из-за чего реакцию грамицидина С с активированной бромцианом сефарозой 4В приходится проводить в растворах с высоким содержанием диметилформамида, который частично разрушает структуру сефарозы. В ходе синтеза сорбента грамицидин С выпадает в осадок, что приводит к снижению выхода конечного продукта и затрудняет очистку полученного вещества. Кроме того, область применения грамицидина С-сефарозы 4В ограничена некоторыми классами протеиназ и не включает практически важные сериновые протеиназы.

С целью упрощения процесса и повышения выхода ферментов высокой степени чистоты и активности описывается способ очистки п-ротеолитических ферментов, заключающийся в биоспецифической сорбции растворенных ферментов на нерастворимом носителе:-производном агарозы, в частности сефарозе 4В, активированной бромцианом и ковалентно связанной с лигандом. Отличительным нризнаком данного способа является использование в качестве лиганда антибиотика бацитрацина. Таким образом.

-ОН

+ ШВГ

-ОН

где R-NH2 - антибиотик бацитрацин..

Описываемый способ позволяет очищать с выходом 75-95% различные протеолитические ферменты с увеличением активности в 2-500 раз в зависимости от чистоты исходного препарата.

Описываемый способ эффективен при извлечении ферментов непосредственно из культуральной жидкости, содержащей окрашенные примеси. С помощью бацитрацин-сефарозы 4В выделяется бесцветный фермент, причем вследствие избирательности сорбента значительный эффект достигается в одностадийном процессе очистки. Кроме того, описываемый биоспецифический сорбент может быть применен для работы с растворами в широком диапазоне рН (1,8-8,0), что дает возможность использовать его для выделения протеолитических ферментов различных классов, включая карбоксильные, сериновые, тиоловые, металлопротеиназы и экзопептидазы.

Способ осуществляется следующим образом.

Раствор неочищенного фермента вводят в конкакт с биоспецифическим сорбентом бапо изобретению, носителем ферментов служит биоспецифический сорбент «бацитрацин-сефароза 4В.

Антибиотик бацитрацин, используемый в качестве лиганда, представляет собой природный циклододекапептид, содержап ий три D-аминокислоты. Он является неконкурентным ингибитором ряда протеиназ. Этим обусловлено специфическое взаимодействие описываемого сорбента с протеолитическими ферментами различных классов. Бацитрацин легко растворяется в воде. Наличие в молекуле большого количества реакционноспособных групп дает возможность проводить синтез сорбента в мягких условиях с различными видами активированной сефарозы. В настоящее время антибиотик бацитрацин является дешевым и легко доступным препаратом, так как в

больших количествах выпускается промышленностью для иснользования в животноводстве.

В качестве нерастворимого носителя иснользуется агароза или ее производные, такие как различные виды сефарозы. Материал носителя нерастворим в условиях использования.

Сефарозу 4В активируют бромцианом, а затем активированная сефароза реагирует с антибиотиком бацитрацином по б-аминогруппе орнитина по следующей схеме

Л,

,- , 3

-0

цитрацин-сефарозой 4В, используя режим динамической или статической сорбции.. При этом происходит избирательное связывание протеиназ с нерастворимым носителем. Затем сорбент со связанным белком промывают соответствующим буферным раствором. При этом происходит отделение примесей, в том числе и окрашенных.

В качестве элюентов используют растворы солей различной концентрации. В тех случаях, когда фермент связывается с сорбентом настолько прочно, что его не удается элюировать, применяя растворы солей, к последним добавляют органические растворители, способствующие более эффективной десорбции.

Очищенный фермент используют в виде раствора или высушивают лиофильно после обессоливания гель-фильтрацией или диализа.

В таблице приведены данные по очистке ряда протеиназ на колонке с бацитрацинсефарозой (22 мл); в экспериментах исцользованы коммерческий препарат пепсина свиньи, препараты пепсина лошади и

«карбоксильной протеиназы «аваморина Asp. awamori и неочищенная культуральная жидкость Вас. subtilis, содержащая мутантные формы субтилизина. Количество нанесенного и элюированного белка (графы 2, 3, 7, 8) измерено в мг, а также в условных онтических единицах, т. е. в единицах оптической нлотности при 280 им. Активность

Очистка ферментов на бацитрацин-сефарозе 4В

ферментов (графы 4, 9) -измерена по скорости гидролиза гемоглобина. Степень чистоты ферментных препаратов характеризуется удельной активностью (графы 5, 6, 10, 11, т. е. количеством единиц активности на количество белка, выраженное в мг (е. а./мг) или оптических единицах (е. а./о. е.).

В графах 12, 13 приведен выход по белку и по активности. Степень очистки (графа 14) определяется отношением удельной активности исходного раствора фермента.

Пример 1. Получение бацитрацин-сефарозы 4В.

Для синтеза использованы BrCN-активироваяная сефароза 4В («Фармация, Швеция) и антибиотик бацитрацин (Serva). К 1 г сухой BrCN-активированной сефарозы 4В добавляют дистиллированную воду для набухания, а затем промывают на стеклянном фильтре 200 мл Ю м раствора НС1 в течение 15 мин для удаления азида натрия. Затем сефарозу 4В промывают водой до отрицательной реакции на С1 и помещают в 0,1 М раствор МаНСОз в 0,5 М растворе NaCl, рН 10. К подготовленной таким образом BrCN-активированной сефарозе 4В добавляют раствор 100 мг (60 мкм) бацитрацина в 5 мл 0,1 М NaHCOs в 0,5 М растворе NaCl, рН 10. Реакцию проводят при комнатной температуре, поддерживая рН реакционной смеси в пределах 9,5-10,5. Через 3 ч гель отфильтровывают и промывают раствором 0,1 М NaHCOa в 0,5 М растворе NaCl,pH 10, 0,1 М раствором NaHCOa, дистиллированной водой, а перед опытом - всеми элюирующими растворами. Содержание бацитрацина 2 мкмоль/мл влажного сорбента.

Пример 2. Очистка карбоксильной протеиназы из Asp. awamori на бацитрацинсефарозе 4В.

0,1 М ацетатный буферный раствор с рН 5,0, содержащий неочищенную протеиназу С удельной активностью 3,9 е. а./мг, пропускают через хроматографическую колонку, заполненную бацитрацин-сефарозой 4В. Затем сорбент промывают исходным буфером, активный фермент элюируют 1 м NaCl в том же буфере. Удельная активность аваморина в элюате 30 е. м./мг, выход по активности составляет 73%.

Пример 3. Очистка пепсина лошади на бацитрацин-сефарозе 4В.

0,1 М ацетатный буферный раствор с рН 1,8-5,6, целесообразно 5,0, содержащий желудочный сок или .неочищенный пепсин лошади с удельной активностью 6,3 е. а./мг, пропускают через хроматографическую колонку, заполненную бацитрацин-сефарозой 4В. Затем сорбент промывают последовательно исходным буфером, 1 М NaCl в том же буфере и 25%-иым изопропанолом в 1 М NaCl, рП 5,0. Собирают изопропанольтом же буфере и 25%-ным изопропанольную фракцию элюата, содержащую активный белок. Удельная активность пепсина в указанной фракции, определенная по методу Ансона, составляет 46 е. а./о. е. После обессоливания на Сефадексе Г-25 раствор лиофнлизируют. Получают фермент с удельной активностью 60 ед/мг. Выход по активности составляет 72,6%Пример 4. Очистка субтилизина на бацитрацин-сефарозе 4В.

Культуральная жидкость Вас. subtilis А-50 с рН около 8,0 и удельной активностью 0,018 по синтетическому субстрату - л-нитроанилиду карбобензокси-Ь-аланил-Ьаланил-Ь-лейцина перемешивают в течение 30 мин с бацитрацин-сефарозой 4В, затем сорбент осторожно отфильтровывают н

стекляйном фильтре и промывают 0,1 М фосфатным буферным {заствором с рН 6,0- 8,0, Целесообразно 6,0-6,5, и 1 М NaCl в том же буфере. При этом отделяются окрашенные и другие примеси. Промытый сорбент переносят в хроматографическую колонку; Активный фермент элюируют 25%«ым изопропанолом в 1 М раствора NaCl, рН 7,0. Получают субтилизин с удельной активностью 2,5. Выход по активности 86%.

Формула изобретения

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

3.Степанов В. М., Лавренойа Г. И., Адли К., Гончар М. В., Баландина Г. Н., Славинская М. М., Стронгин А. Я. Биоспецйфическая хроматография химозина. «Биохимия, 1976, т. 41, вып. 2, 294 (прототип).