СПОСОБ СТИМУЛЯЦИИ РОСТА И ПРОДУКТИВНОСТИ РАСТЕНИЙ, БИОСТИМУЛИРУЮЩАЯ КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ОБРАБОТКИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ КУЛЬТУР, ШТАММ STREPTOMYCES SP. - СТИМУЛЯТОР РОСТА И ПРОДУКТИВНОСТИ РАСТЕНИЙ Российский патент 1994 года по МПК C12N5/04 A01G7/00 A01H1/00 

Изобретение относится к микробиологии и сельскому хозяйству и касается микроорганизма разновидности Streptomyces, идентифицированного как "NCIMB 40227", и его использования в сельском хозяйстве для стимуляции роста и повышения продуктивности сельскохозяйственных растений.

Наиболее приспособленным для образования колоний на корнях растений и для стимуляции их роста являются в настоящее время некоторые штаммы Pseudomonas [1] .

Применение штаммов Streptomyces sp. пока ограничено предотвращением развития патогенных грибов.

Микроорганизмы разновидности Streptomyces sp. первоначально выращиваются и распространяются в почве, в которой вместе с другими микроорганизмами, такими как грибки и бактерии, они обычно проявляют метаболические функции разложения органических веществ, присутствующих в этой почве.

Найден новый штамм Streptomyces sp. , обладающий определенными морфологическими, биохимическими и физиологическими характеристиками, идентифицированный как "NCIMB 40277", который при вводе в почву, в которой выращиваются растения, или при использовании как протравливатель семян или каким-либо другим путем приводимый в контакт с корнями растений, совершенно непредвиденно повышает рост и производство растительных культур.

Следовательно, объектом данного изобретения является способ обработки сельскохозяйственных культур с целью стимулирования прорастания семян, роста и производительности растительных культур, который (способ) заключается в обработке семян, корней растений, или почвы, на которой выращиваются растения, микроорганизмы Streptomyces sp. NCIMB 40277 как спор или клеток растительного мицелия, либо как такового, либо в виде соответствующих композиций.

Следующим объектом данного изобретения являются Streptomyces sp. NCIMB 40277 как таковые или их биологически чистая культура.

Морфологические, биохимические и физиологические характеристики, определенные на Streptomyces sp. NCIMB 40277, позволяют отличить их от известных ранее штаммов Streptomyces.

Морфология и биохимические характеристики Streptomyces sp. "NCIMB 40277".

Streptomyces sp. NCIMB 40277 был выделен из корней камелии и зарегистрирован для внутреннего лабораторного использования под обычным кодом S 57. Это выделение осуществлялось на агаровой среде Вильямса и становилось избирательным за счет ввода 50 мг/л гистатина и циклогексимида.

Streptomyces sр. NCIMB 40277 может сохраняться на обычной среде, такой как например агаровая среда картофельной декстрозы, при температуре 25-28^оС, и может разводиться способами уже известными для специалистов в данной области.

Таксономические характеристики штамм NCIMB 40277 были определены на основе морфологических и биохимических характеристик. В табл. 1 представлены данные чувствительности Streptomyces sp. NCIMB 40277 к антибиотикам. Данные, приведенные в табл. 1, получены с использованием чувствительного диска BBL (Микробиологическая система Bechton Dickinson).

В табл. 2. представлены характеристики Streptomyces sp. NCIMB 40277, которые определялись согласно Williams S. T. , Goodfellow M. и Alderson G. (Справочник Bergey по систематической бактериологии, 1989 г. ). Эти характеристики сопоставлялись с процентными частотами положительных членов в двух близких таксомотических группах.

В табл. 3 представлены результаты обработки данных табл. 2 согласно программе NAIIDEN (Sneal P. H. A. Computer and Geoscience, 1979). В первом разделе табл. 3 представлены статистические коэффициенты, которые показывают корреляцию между Streptomyces sp. NCIMB 40277 и двумя таксономическими группами, которые наиболее близки к ним. Во втором разделе табл. 3 приводятся характеристики, которые не показывают связи между Streptomyces sp. NCIMB 40277 и указанными двумя группами.

Сравнительные характеристики с S. Rachei см. табл. 4.

На основе анализа приведенных выше данных можно сделать заключение, что штамм NCIMB 40277 не может быть однозначно идентифицирован любым из стрептоминетов, описанных в последнем разделе Справочника по детерминативной бактериологии Bergey таксомомическая группа S. rochei является ближайшей к описанию NCIMB 40277, от которой она отличается одиннадцатью характеристиками, дающими при обработке согласно NAIIDEN незначительный коэффициент вероятности.

Таким образом, можно сделать вывод, что NCIMB 40277 должен рассматриваться как новый таксономический вид, ближайший к группе S. rochei. Под "таксономическими видами" имеется в виду один организм или группа организмов с чрезвычайно высоким взаимным сходством, т. е. с высоким показателем сходства согласно принципам цифровой таксономии. (U. Mazzuchi "Элементы физиопатологической бактериологии", т. I, с. 116).

Характеристики культуры и коллекция спор.

Споры NCIMB 40277 получаются путем инокуляции жидкой культуры микроорганизма в чашках Петри, содержащих подходящую среду с агаром.

Споры растительного мицелия изучаемого штамма используются для инокуляции жидкого питательного бульона, пригодного для роста актиномицетов.

После 3-дневного роста при 28^оС во вращающемся встряхиваемом сосуде, вращающемся со скоростью 180 об/мин, использовали 0,5 мл жидкой культуры для инокуляции среды культивации, содержащейся в чашках Петри диаметром 12 см, каждая из которых заключала в себе 50 мл среды с агаром, например агара картофельной декстрозы, или среды, называемой "РМ8", имеющей следующий состав, г/л: * Крахмал 20 * Глюкоза 10 * Карбонат кальция 3
* Профло (мука хлопковых семян) 2
* Гидролизирован- ный казеин 2
* Дрожжевой экстракт 2 * Мясной экстракт 2 * Агар 15
Перед стерилизацией указанной среды при 120^оС в течение 15 мин величину рН этой среды доводили до значения 7.

Чашки выдерживались при 28^оС в течение 5-10 дней до тех пор, пока споруляция не распространялась по всей поверхности чашки. Споры извлекались либо мокрым, либо сухим способом. В первом случае по всей среде распределялось 10 мл воды, содержащей 0,01% поверхностно-активного вещества (Твина 80 или аналогичного вещества), которая предварительно стерилизовалась. Эти споры суспендировались путем слабого захвата поверхностного слоя чашки Петри пипеткой с широким наконечником, и суспензия фильтровалась на стерилизованной марле. После полного извлечения спор они подсчитывались под микроскопом с камерой Бюркера или с помощью счетчика чашки Петри, и суспензия разбавлялась до тех пор, пока не получалась конечная суспензия, содержащая 10⁹ спор/мл.

Для осуществления процедуры сухого извлечения поверхность культуры осторожно захватывалась небольшим стальным шпателем. Собранный материал суспендировался стерилизованной водой, смешанной с Твином 80, и осуществляли подсчет спор так же, как и в случае их сбора мокрым способом. Данные суспензии замораживались при -30^оС, затем они выдерживались при -30^оС или -18^оС после ввода криопротектаита, например, такого как глицерин (конечная концентрация 10% ). Суспензия спор оставалась без потери своих функций после 1-годового хранения при т-ре -18^оС.

Биологическая активность.

Наблюдения, проведенные при росте растений из семян, обработанных спорами клеток мицелия Streptomyces NCIMB 40277, или при росте растений в среде, в которую были введены данные микроорганизмы, или при росте растений, корни которых контактировали с данным микроорганизмом, дали возможность обнаружить следующие достигаемые положительные эффекты: размер растений показал общее увеличение, корни были более развитыми, растение имело большее число листьев и цветов, цветение происходило раньше, и культура была больше.

Кроме того, семена, обработанные данным микроорганизмом, показали более высокую скорость прорастания; и побеги растений для садоводческих центров показали лучшее укоренение.

Streptomyces sp. NCIMB 40277 является естественным продуктом, который при использовании в качестве фитостимулянта безвреден для теплокровных животных и экологически безопасен, т. е. ни он, ни продукты его разложения не изменяют и не загрязняют окружающую среду.

Взаимодействие между Streptomyces sp. NCIMB 40277 и растением, которое приводит в результате к модификации состояния растений, по всей вероятности, происходит на уровне корней, на поверхности которых и внутри которых данный микроорганизм избирательно растет и спорулирует. Данный микроорганизм образует колонию и следовательно интенсивно воспроизводит сам себя на корнях растений, выращенных из семян, или выращенных в почве, в которые введены споры клеток мицелия данного микроорганизма.

Для примера даются оценки образования колоний Streptomyces sp. NCIMB 40277 на корнях кабачков, выращенных в почве, обработанной 2,5х10¹⁰ спор/л и на корнях сахарной свеклы, образованных от семян, обработанных суспензией в 1% -карбоксиметилцеллюлозы при дозе 3,5х10⁵спор/семя. Оценка микроорганизма на корнях осуществлялась согласно модифицированному методу Agate и Bhat (Basic Plant Pathology Methods O. D. Dhingra, I. B. Sinobair, CRC, Press, 1987).

Согласно этому методу корни растений собирали, промывали в стерилизованной воде и затем гомогенизировали в фосфатном буферном растворе при рН 7, содержащем 0,01% Твина 80 или какого-либо другого аналогичного поверхностно-активного вещества. 0,1 мг данного гомогената распределяли в чашке Петри диаметром 10 см, содержащей 35 мл питательного бульона на агаре, например на агате картофельной декстрозы, или еще лучше в среде, называемой "GAA", имеющей следующий состав, г/л: * Глицерин 20 * L -Аргинин 2,5 * Хлорид натрия 0,1 * Карбонат кальция 0,1 * Сульфат железа 0,1 * Сульфат магния 0,1 * Агар 20
Перед стерилизацией величину рН культуры доводили до нейтрального значения. Среду делили избирательной за счет ввода 100 мг/л циклогексимида. После ввода гомогената чашки Петри обрабатывали в течение 10 мин при 100^оС и затем инкубировали 28^оС в течение 7 дней. По окончании времени инкубирования подсчитывали выращенные колонии.

Показатели образования колоний, выраженные в "Единицах образования колоний" (CFU) на корень, приведены ниже: Культура CFU/корень Кабачок 8,7х10⁴
Сахарная свекла 5,0х10³
Эти данные показывают интенсивное образование колоний на корнях.

Способ обработки.

Streptomyces sp. NCIMB 40277 обычно используется для обработки при выращивании сельскохозяйственных культур как "элементов размножения", т. е. спор и/или клеток растительного мицелия, способных образовывать новые колонии.

Они могут быть приготовлены в виде водных суспензий, концентрированных жидкостей, смачиваемых порошков, гранул, с использованием инертных носителей, состоящих либо из жидких, либо из твердых веществ, или сопутствующих составляющих компонентов, таких как суспендирующие агенты, поверхностно-активные вещества, стабилизаторы, ускоряющие адгезию агенты.

При использовании указанных препаратов можно обрабатывать ими семена, почву, в которой выращиваются растения - как в месте высаживания семян, так и на открытом поле, почву для использования в цветоводстве и сельском хозяйстве, корни рассады и побеги или прививочные черенки растений для садоводческих центров.

Так например, для почвы для посева может использоваться водный раствор, имеющий желаемую концентрацию элементов размножения Streptomyces sp.

Семена могут быть обработаны (протравка семян), например, либо путем пропитки водной суспензией элементов размножения, содержащей карбоксиметилцеллюлозу, с последующей сушкой, либо путем смешивания этих семян с порошками, содержащими эти элементы размножения, которые (порошки) получаются, например, путем адсорбции водных суспензий элементов размножения на инертном носителе в порошковой форме, таком как тальк и горная мука.

Обработка на открытом поле может осуществляться с использованием водных суспензий микроорганизма как такового, или адсорбированного на гранулятах носителя, например высушенного и гранулированного торфа, бентонита и сепиолита.

Дозы препарата не имеют критически важного значения; практически необходимо лишь, чтобы споры и/или растительный мицелий присутствовали в достаточно большом количестве для контактирования с корнями растений и следовательно для колонизации их.

Обычно могут быть использованы, к примеру, следующие дозы:
- при обработке семян - от 10⁶ до 10³ элементов размножения на каждое отдельное семя;
- при обработке почвы для выращивания семян (ложе для семян) - от 10⁷ до 10¹⁰ элементов размножения на 1 л почвы;
- при обработке открытого поля - от 10¹¹ до 10¹³ элементов размножения на 1 га.

П р и м е р ы 1-3. Проводились испытания для определения биостимулирующей активности действия Streptomyces sp. NCIMB 40277 на рост и скорость размножения различных видов сельскохозяйственных растений.

Во всех испытаниях использовался выпускаемый промышленностью носитель для садоводства, который состоял из нейтрального сфагнового торфяника, равномерно обработанного водной суспензией спор Streptomyces sp. NCIMB 40277, и затем он использовался для сосудов для посева емкостью 200 мл.

В обработанную таким образом почву вводили согласно испытаниям, приведенные в табл. 1, 2,5х10⁸ или 2,5х10¹⁰ спор на каждый 1 л обработанного торфяника.

Через семь дней после этого ввода высаживали семена томатов c. v. Marmande, семена баклажан Violetta lunga (Lоrg violet) и семена кабачков "Diamont" как в сосуды для посева, содержащие указанную обработанную почву, так и в сосуды, содержащие необработанную почву.

Затем сосуды для посева устанавливались для прорастания семян в нагреваемой теплице.

Саженцы томатов и баклажан удаляли из сосудов для посева через 30 дней после посадки, и саженцы кабачков удаляли через 14 дней после посева. Надземную часть аликвоты саженцев взвешивали с целью определения их вегетации, остальную часть саженцев пересаживали на открытое поле.

Данные вегетации и данные продуктивности роста указанных культур приведены в табл. 5.

Данные для культур, приведены в табл. 5, являются статистическими результатами для пяти повторных испытаний, проводимых на образцах каждого саженца, на полевых делянках, выбранных согласно схеме случайного расположения (рандомизированной схеме) (Leoleg Leonard Clark: Plot Field Technigue, Burgess Publishing Company).

Из данных, приведенных в табл. 5, следует, что когда для посева используется почва, обработанная спорами Streptomeces sp. NCIMB 40277, получаются саженцы, имеющие повышенную вегетативность по сравнению с саженцами, выращенными на почве без обработки, и эти саженцы при пересадке на открытое поле дают более высокое количество плодов по сравнению с саженцами, полученными на почве без обработки.

П р и м е р 4. Протравливание семян сахарной свеклы спорами или клетками мицелия NCIMB 40277 приводило к повышению образования сахарозы. Бурый торфяник, нейтрализованный карбонатом кальция, высушивали при 90^оС в печи с воздушной циркуляцией, измельчали и стерилизовали при 100^оС в течение 30 мин. В этот торфяник вводили водную суспензию спор Sterptomyces sp. NCIMB 40277, и получали препарат в порошковой форме с содержанием 2х10⁸ спор на 1 г. Семена однозародышевой незасахаренной сахарной свеклы обрабатывали 10% указанного порошкообразного препарата. , При такой обработке каждое семя получало 3,5х10⁵ спор.

Осуществляли три испытания на поле в различных местах: Bagnacavallo (PA), Ponteterra (PR) и Belfiore (VR). Испытания осуществляли согласно схеме рандомизированного повторения. Площадь поверхности делянок, использованных для каждого испытания, указывается в табл. 6.

В момент уборки урожая определяли выход продукта и количество сахарозы, которую можно было получить по сравнению с тем количеством, которое можно получить при выращивании необработанных семян: результаты даются в табл. 7.

Размер главных корней сельдерей увеличивается при обработке корней Streptomyces sp. NCIMB 40277. Испытание на открытом поле осуществлялось на почве, содержащей 52% песка и 5,2% органического вещества. До трансплантации корни саженцев сельдерей погружали в водную суспензию, содержащую 10⁶ спор/мл Streptomyces sp. NCIMB 40277.

Испытания осуществлялись согласно схеме рандомизированного повторения. Каждое испытание осуществлялось по пять раз. Каждый раз осуществлялась обработка делянок площадь поверхности 25 м². В первом обозрении за месяц до сбора урожая обнаружена более высокая равномерность развития вегетационной части и более глубокая зеленая пигментация в тех делянках, в которые пересаживались обработанные растения, чем в делянках, в которые пересаживались необработанные растения. Затем анализ размера главных корней в момент сбора урожая подтвердил, что указанные различия, наблюдаемые в надземной части растений, соответствуют еще более значительным различиям между главными корнями обработанных и необработанных растений с чистым привесом товарного продукта (табл. 8).

П р и м е р 6. Обработка картофельных клубней.

Испытание проводилось на открытом поле с обогащенной песком (содержащей 60% песка) и органическими веществами (4,5% органических веществ) почвой. Перед посадкой картофельные клубни погружали в водную суспензию, содержащую 10⁶ спор/мл Streptomyces sp. NCIMB 40277. Испытания проводились согласно схеме рандомизированных повторений. Испытания повторялись 5 раз. Каждое повторное испытание осуществлялось на делянке площадью поверхности 25 м².

В момент сбора урожая картофель классифицировали по классам размерности, которым соответствовали коммерческие показатели. Растения, полученные из необработанных клубней, давали более высокий процент клубней более ценного класса с коммерческой точки зрения, т. е. клубни, имеющие размеры в диапазоне 80-120 г (табл. 9).

П р и м е р 7. Почва, на которой выращивали цикорий, при обработке ее Streptomyces sp. NCIMB 40277, давала возможность лучшего развития саженцев, предназначенных для пересадки, вес всего куста в момент уборки урожая значительно увеличивался. Испытание проводили на песчаной почве (96% песка) в типичном районе "для цикория" Chioggia.

30 л коммерческой почвы равномерно обрабатывали 4 л водной суспензии, содержащей 10⁶ спор/мл Streptomyces sp. NCIMB 40277. Через четыре дня почва использовалась для заполнения сосудов для посева в форме куба, внутри которых высевали 1 семя на куб. Высаженные семена в сосудах для высевания затем прорастали в обогреваемой теплице в течение 25 дней параллельно с семенами, посаженными в сосудах для посева, наполненных необработанной почвой. Затем группы растений по 10 штук в каждой отрезались в основания и взвешивались (табл. 10).

Остальная часть растений пересаживалась на открытое поле путем переноса части почвы, содержащейся в сосудах для посева, в ямку, сделанную в почве. Подготавливали делянки каждая площадью поверхности 15 м². Каждая делянка заключала в себя 150 растений. Кусты, собранные в конце испытания, взвешивались каждый в отдельности после очистки для продажи (табл. 11).

П р и м е р 8. Если корни клубничных растений обрабатывались Streptomyces sp. NCIMB 40277 в момент пересадки, то получались растения с лучшей вегетацией. Испытания проводились в холодном туннельном укрытии. В момент пересадки корни растений погpужались на 10 мин в водную суспензию, содержащую 10⁵ спор/мл Streptomyces sp. NCIMB 40277. Испытания осуществлялись согласно схеме рандомизированного повторения. Испытания повторялись пять раз. Каждое повторное испытание осуществлялось в делянках площадью поверхности 25 м². Через 60 дней определяли вегетацию растений, и растения подразделялись на 8 классов в соответствии с их вегетацией. В классе с наилучшей вегетацией наилучшими были обработанные растения (табл. 12).

П р и м е р 9. Streptomyces sp. NCIMB 40277 благоприятствует укоренению побегов исследуемых растений в секторе садоводческого хозяйства.

100 побегов Chamaecyparis obtusa nana gracilis и 150 побегов Picea excelsa nidiformis погружали в суспензию, 10⁵ спор/мл в песке на подогретом подготовленном для посева почвенном слое в теплице с распылительной обработкой. По прошествии 6 мес определяли число корней на каждый побег вместе со средней длиной побегов и процентом укорененных побегов (табл. 13).

П р и м е р 10. Streptomyces sp. NCIMB 40277 при использовании для разведения декоративных растений увеличивает вегетацию этих растений, повышая таким образом их коммерческую ценность.

25 мл суспензии, содержащей 10 спор/мл Streptomyces sp. NCIMB 40277, использовались для равномерной обработки 2 кг коммерческой почвы De-Baat для цветоводства. Данную почву выдерживали в теплице в течение 30 дней, затем ее смешивали с 500 л другой почвы, в которую впоследствии пересаживали цикламен (200 растений пяти разновидностей). После 70-дневного выращивания в теплице подсчитывали несущие цветы растения (табл. 15).

В момент продажи, т. е. через 120 дней после пересадки, была проведена некоторая оценка, показывающая развитие растений (табл. 16-17).

Используя способ обработки почвы, принятый для цикламенов, осуществляли также испытание с рододендроном. В момент продажи растения подразделялись на классы, и после присвоения каждому классу коммерческой цены рассчитывали повышение этой цены (табл. 18).

П р и м е р 11. Наблюдали раннее цветение и увеличение вегетации при погружении укорененных побегов Pelargonium zonale в водную суспензию, содержащую 10⁵ спор/мл Streptomyces sp. NCIMB 40727. После такой обработки окунанием в суспензию побеги пересаживали в почву для культивации, состоящую из песка, компоста, стерилизованной восстановленной почвы, торфяника, карбоната кальция и "Нитрофоски" (растворимого удобрения, содержащего азот, фосфор и калий).

Для высадки растений использовались горшки диаметром 14 см. Регистрировали количество дней с момента пересадки до цветения, а также определяли средний диаметр основного стебля растений в момент продажи (табл. 19).

П р и м е р 12. Погружая семена бархатцев прямостоячих в водную суспензию, содержащую 10⁵ спор/мл NCIMB 40277, получали растения, которые имели более длительный период цветения, начиная со 120 дней после времени высевания (табл. 20).

П р и м е р 13. Протравка семян суспензией, содержащей 10⁵спор/мл Streptomyces sp. NCIMB 40277, увеличивают скорость прорастания этих семян. Семена петуньи погружали в суспензию на несколько секунд и затем их высушивали на воздухе в течение нескольких минут, после чего их высевали в товарной обогащенной торфяником почве. После 50-дневного роста в теплице подсчитывали взошедшие семена (табл. 21). (56) I. W. Kloepper et al. Atlas of Science-_ 1988, р. 60-64.

Использование: биотехнология, культивирование тканей и клеток растений, микробиология, сельское хозяйство, растениеводство. Сущность изобретения: стимуляцию роста и продуктивности растений производят путем обработки семян, корней или почвы, на которой выращивают растения, микробиологическим стимулирующим препаратом, разработана биостимулирующая композиция и создан штамм, продуцирующий стимулирующие рост и продуктивность вещества. 3 с. и 1 з. п. ф-лы, 21 табл.

1. Способ стимуляции роста и продуктивности растений, включающий обработку семян, корней или почвы, на которой выращивают растения, микробиологическим стимулирующим препаратом, отличающийся тем, что в качестве стимулирующего препарата используют штамм Streptomyces Sp. NC1MB - 40227 в виде спор, вегетативных мицелиальных клеток или композиции, содержащей суспензию клеток и носитель. 2. Биостимулирующая композиция для обработки сельскохозяйственных культур, включающая носитель и действующее вещество, отличающаяся тем, что в качестве носителя используют грануляты, а в качестве действующего вещества - штамм Streptomyces Sp. NC1MB - 40227. 3. Композиция по п. 2, отличающаяся тем, что в качестве носителя используют торф, бентонит, сепиолит. 4. Штамм микроорганизма Streptomyces Sp. NC1MB - 40227, используемый в качестве стимулятора роста и продуктивности растений.