СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ МУКОВИСЦИДОЗА Российский патент 1994 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к медицине, в частности к лабораторному исследованию слюны для диагностики муковисцидоза у детей.

Широко известны способы диагностики муковисцидоза, основанные на определении содержания ионов Na и Cl в различных биологических средах организма (в поте, ногтевых пластинках).

Среди диагностических пробах при муковисцидозе наибольшее значение имеет нагрузочная "потовая проба", в основе которой лежит повышение выделения Na и Cl с потом после электрофореза пилокарпином.

Однако проба имеет ряд недостатков. Так установлено, что количество натрия и хлора зависит от соли в пище, физической активности ребенка, времени года, скорости потения (быстрое потение дает ложноположительные результаты, а медленное - ложноотрицательные). По известным данным установлено, что положительная потовая проба наблюдалась лишь у половины больных муковисцидозом. Кроме этого, постановка пробы требует не менее 100 мг пота, а также проведение процедуры требует около 2 ч, что тяжело переносится больными детьми.

Наиболее близким к предлагаемому способу являются методы исследования твердокристаллических структур в слюне, используемые как диагностические тесты в гастроэнтерологии и аллергологии.

Это связано с тем, что при муковисцидозе вовлекаются в процесс слюнные железы, в которых секретирует слизь, в основном - мукопротеины. Это дает возможность использовать слюну как биологическую жидкость, способную характеризовать патологический процесс.

Целесообразность использования слюны в качестве объекта исследования при муковисцидозе объясняется ее огромной физиологической ролью в организме: участие в процессе пищеварения, в обеспечении защиты органов пищеварительной системы, в регуляции постоянства внутренней среды организма. Правомочность оценки функционального состояния органов пищеварения по изменению биохимического состава слюны доказана наличием анатомо-функциональных связей между слизистой оболочкой полости рта и различными отделами желудочно-кишечного тракта, а также однотипностью изменений в них.

Однако, расшифровка твердокристаллических структур слюны носит только качественный характер, рисунок кристалограммы зависит от применения различных кристаллообразующих веществ, что часто трудно в трактовке, не учитываются особенности динамики структурирования биологической жидкости из состояния мицелярного раствора - жидкий кристалл-твердый кристалл из-за быстрой кристаллизации открытой капли. Выявленные изменения не являются специфическими, методика не точна, так как не дает количественных параметров.

Целью изобретения является повышение точности диагностики муковисцидоза путем поляризационно-оптической кристалограммы слюны.

Поставленная цель достигается тем, что в способе берут образцы слюны до и после воздействия мукосальвина, проводят поляризационно-оптическое их исследование жидкокристаллических структур в слюне с учетом интенсивности светопреломления двулучепреломляющих (анизотропных) структур и изменения размеров текстур путем их морфометрии. При лизировании текстур или уменьшении их толщины до 10 мк в сочетании с отсутствием нарастания оптического показателя их количества диагностируют муковисцидоз.

На фиг. 1 представлена кристаллографическая картина конгломерата центральной части текстур при муковисцидозе в нативной слюне (б-ная Б. ); на фиг. 2 - кристаллографическая картина текстур в слюне после добавления мукосальвина при муковисцидозе (б-ная Б. ); на фиг. 3 - кристаллографическая картина текстур в нативной слюне при пневмонии (б-ной М. ); на фиг. 4 - кристаллографическая картина текстур в слюне после добавления мукосальвина при пневмонии (б-ной М. ).

Существенным отличием предлагаемого способа является то, что впервые проведено исследование образующих кристаллов слюны между скрещенными поляризаторами на спектрофотометре и оптическом микроскопе с насадкой окуляр-микрометр в зависимости от характера патологического процесса у детей (наследственные или приобретенные заболевания).

Впервые разработан и проведен диагностический тест-проба с мукосальвином - специфическим муколитическим препаратом, применяющимся для лечения муковисцидоза. Препарат способен разжижать (лизировать) обильно выделяемый различными органами вязкий субстрат.

В качестве критериев оценки результатов пробы использован предлагаемый поляризационно-оптический метод кристаллографического исследования слюны, что является новым признаком, повышающим точность диагностики.

Вязкий секрет слюны (мукопротеины) при муковисцидозе по полученным данным через 24 ч в негерметичной микрокамере кристаллизуются в виде разветвленной системы из полос конфокальных доменов ("бороздки"недвулучепреломляющие дендриты).

Конгломерат центральной части этих жидкокристаллических текстур имеет толщину 20-50 мк и длину 60-120 мк, длина разветвленной части - 80-300 мк. Это является специфическим признаком выделяющегося секрета при муковисцидозе, так как в слюне при другой патологии (бронхолегочной, гастсроэнтерологической) могут встречаться только обрывки "бороздок", не превышающие толщину 10 мк и длину до 20-40 мк.

Существенное различие при этом и в количестве анизотропных структур. При муковисцидозе фотометрические показатели, характеризующие количество структур, находятся в пределах 0,07-0,18 условных оптических единиц, в то время, как при заболеваниях бронхолегочной системы (обструктивный бронхит, пневмония) 0,28-0,42 усл. опт. единиц.

Положительный результат для диагностики муковисцидоза - наличие разветвленных текстур "бороздок" с толщиной в центре более 15 мк и длиной более 50 мк при одновременном низком показателе количества анизотропных структур (показатель 0,07-0,18 усл. опт. ед. ).

После применения мукосальвина отмечается лизирование или уменьшение толщины морфоструктур до 1-8 мк, наличие жидкокристаллических линий. При этом содержание анизотропных структур остается на исходном низком уровне.

В группе сравнения (больные обструктивным бронхитом, пневмонией, с хроническим расстройством питания, больные подозрительные по муковисцидозу) проба с мукосальвином приводит к увеличению в слюне в 1,5-2,0 раза количества анизотропных структур.

Воздействие мукосальвина на слюну в способе может быть достигнуто двумя путями: через ингаляцию препарата или непосредственным введением в пробу слюны. Результат кристаллографического исследования после этих воздействий аналогичен.

Положительный эффект заключается в том, что предлагаемый способ позволил повысить выявление муковисцидоза до 90% .

Способ осуществляется следующим образом. Для поляризационно-оптического исследования слюны приготавливаются 3 препарата, которые помещаются в микрокамеры, образованные между твердотельной подложкой и покровным стеклом: 1) 0,20 мл слюны; 2) 0,02 мл слюны соединяется на подложке с 0,005 мл мукосальвина; 3) контроль (0,02 мл слюны соединяются с 0,005 мл дистиллированной воды). В качестве твердотельной подложки используются новые, обезжиренные в спирте предметные стекла. Покровные стекла обрабатываются также. Слюна собирается пипеткой натощак в пластиковые маленькие пробирки. Центрифугируется, надосадочная жидкость в количестве 0,02 мл наносится на предметные стекла и прикрывается покровным. Таким образом образуется негерметичная кристаллизационная ячейка с пробой слюны.

Препараты выдерживаются 24 ч при комнатной температуре в темноте для прохождения процесса структуpирования. Исследование препаратов производится в скрещенных поляризаторах фотометрией на спектрофотометре СФ-46 и оптическим методом.

Количество анизотропных структур определяется в условных оптических единицах при длине волны 520 нм, размеры морфотекстур измеряются окуляр-микрометром.

П р и м е р 1. Больной Б. 2-х лет (и/б N 14800, 1990 г. ). У ребенка с 1,5 мес отмечается постоянный кашель и повторные пневмонии. Состояние девочки при поступлении в отделение тяжелое. Пневмония была подтверждена лабораторно-рентгенологическим обследованием. На основании данных анамнеза, клинической картины заболевания, данных лабораторного и рентгенологического обследования был заподозрен хронический бронхолегочный процесс (муковисцидоз). Проведено кристаллографическое исследование слюны. Слюна собиралась натощак, приготовляли препараты: 1) 0,02 мл слюны наносили каплей на предметное стекло и закрывали покровным; 2) 0,02 мл слюны наносили на предметное стекло, туда же добавляли 0,05 мл мукосальвина, закрывали покровным стеклом, препараты выдерживали 24 ч в темноте при комнатной температуре. В 2-х препаратах затем проводили морфометрическое исследование на поляризационно-оптичесском микроскопе с применением окуляр-насадки и поляризационную фотометрию на спектрофотометре СФ-46 с вмонтированными поляризаторами.

В препарате нативной слюны (см. фиг. 1) отмечено наличие конгломератов-текстур размерами: толщина 95 мк, длина 100 мк, отсутствие жидкокристаллических линий (жк линий), показатель интенсивности светопропускания, отражающий количество анизотропных текстур, составил 0,12 усл. опт. ед. В препарате после соединения слюны и мукосальвина отмечено наличие жидкокристаллических линий, единичных конгломератов "бороздок" следующих размеров: толщина 2 мк, длина 85 мк, показатель количества анизотропных текстур снизился до 0,09 усл. опт. ед. На основании кристаллографического исследования была уточнена диагностика муковисцидоза. Этому же ребенку было проведено кристаллографическое исследование после ингаляции с мукосальвином (по общепринятой методике). На препаратах после ингаляции выявлено уменьшение конгломератов-текстур, до толщины 8 мк, появление жк линий, показатель количества анизотропных текстур снизился с 0,16 до 0,12 усл. опт. ед. Из этого следует, что характер изменения показателей идентичен как при непосредственном соединении слюны с мукосальвином, так и после его ингаляции физиотерапевтическим методом.

П р и м е р 2. Больной М. , 2,5 лет (и/б N 2552). У ребенка с 6-месячного возраста повторные пневмонии, бронхиты. Постоянный кашель с отхождением серозно-гнойной мокроты. Неоднократно находился в стационаре на обследовании и лечении с диагнозом: повторные пневмонии. Поступил в клинику в тяжелом состоянии. При обследовании был заподозрен муковисцидоз. На рентгенограмме грудной клетки: признаки обострения бронхолегочного процесса.

Проведено кристаллографическое исследование слюны со следующими результатами: в нативном препарате из слюны (см. фиг. 3) выявлено наличие единичных "бороздок" размером 10 х 20 мк жк линий, сфероциты, показатель интенсивности светопропускания 0,24 усл. опт. ед.

В препарате после соединения слюны 0,02 и 0,05 мл мукосальнона (см. фиг. 4) выявлено наличие жк линий единичных "бороздок", сфероциты, показатель количественного содержания анизотропных текстур повысился до 0,36 усл. опт. ед.

На основании данных кристаллографии в пробе с мукосальвином диагноз муковисцидоза был снят, что было затем подтверждено комплексным клинико-лабораторно-инструментальным исследованием.

Таким образом, предложенный способ позволил повысить точность диагностики муковисцидоза до 91% , при одновременной доступности выполнения методики в детских лечебно-профилактических учреждениях. (56) Б. Братанова. Клиническая педиатрия. София. 1983. Медицина и физкультура. т. 8, с. 368-373.

Использование: в медицине, в частности в педиатрии. Сущность изобретения: проводят исследование слюны больного до и после воздействия на нее мукосальвином при соотношении слюны и мукосальвина 4 : 1, полученный препарат выдерживают в темноте в течение 24 ч при температуре 18 - 25С, после чего морфометрически исследуют жидкокристаллические структуры и при уменьшении анизотропных текстур до 10 мк в сочетании с отсутствием нарастания их количества относительно исходного уровня диагностируют муковисцидоз. Способ позволяет повысить точность диагностики. 4 ил.

СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ МУКОВИСЦИДОЗА путем исследования биологической жидкости, отличающийся тем, что, с целью повышения точности способа, в качестве биологической жидкости исследуют слюну больного до и после воздействия на нее мукосальвином при соотношении слюна: мукосальвин 4 : 1 по объему, полученный препарат выдерживают в темноте в течение 24 ч при 18 - 25^oС, после чего проводят морфометрическое поляризационно-оптическое исследование жидкокристаллических структур и при уменьшении анизотропных текстур до 10 мк в сочетании с отсутствием нарастания их количества относительно исходного уровня диагностируют муковисцидоз.