СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ МАСТИТА КОРОВ Российский патент 1994 года по МПК G01N33/50 

Изобретение относится к сельскому хозяйству, в частности к ветеринарии и может быть использовано при диагностике коров больных маститом в послеродовый период.

В настоящее время, одним из распространенных методов исследования является иммуноферментный анализ, преимущества которого заключаются в доступности и стабильности реагентов, экспрессности и возможности автоматизации для проведения массовых анализов, что обеспечило его прочное положение при диагностике заболеваний человека и животных.

Известен способ диагностики мастика коров в лактационный период при помощи иммуноферментного анализа по определению острофазного белка лактоферрина (В. М. Карташова, О. Г. Богатов).

Для диагностики мастита коров в послеродовый период С. П. Корякина (1989) разработала метод иммуноферментной диагностики по определению иммуноглобулинов класса М в молоке и молозиве.

Однако, вышеупомянутый метод длителен в постановке - более 5,5 ч.

Целью изобретения является повышение точности, упрощение и ускорение способа при диагностике мастита коров в послеродовый период.

Поставленная цель достигается за счет использования разработанного способа диагностики мастита коров путем определения общих иммуноглобулинов, отличающегося тем, что для повышения точности, упрощения и ускорения способа при диагностике мастита в послеродовый период, определяют общий уровень иммуноглобулинов на 2-3-й день после родов и при увеличении уровня иммуноглобулинов в 1,5-2,1 раза диагностируют мастит.

В мировой практике не известно использование аналогичного способа диагностики мастита коров.

Нами впервые определены, на основании проведенного комплексного исследования (бактериологического, цитологического, реакцией с быстрым маститным тестом и иммуноферментного), 216 проб молозива и молока из четвертей вымени коров, наиболее информативные и статистически достоверные показатели уровней общих иммуноглобулинов, которые использованы при разработке данного метода.

Этими показателями являются пороговые уровни общих иммуноглобулинов в сыворотке молозива коров на 2-й и 3-й дни после отела, которые составляют 20,0 и 10,0 (мг/мл) соответственно.

Поскольку в научно-патентной литературе не известно техническое решение аналогично предлагаемое, то предлагаемое техническое решение соответствует критерию "новизны" и "изобретательского уровня".

Также предлагаемое техническое решение соответствует критерию "промышленно применимого", поскольку промышленный выпуск иммуноферментных тест-систем для диагностики различных заболеваний человека и животных налажен во многих научно-исследовательских институтах и малых предприятиях биологического направления.

Предлагаемый метод диагностики основан на постановке конкурентного метода ИФА, принцип которого заключается на конкуренции меченых пероксидазой хрена кроличьих антител за связанный с полистеролом планшет антиген и антиген, находящийся в растворе.

Осуществление способа иллюстрируется на следующих примерах.

П р и м е р 1. Диагностика послеродового мастита коров согласно базовому методу (С. П. Корякина) по определению иммуноглобулинов класса М.

Базовый метод основан на неконкурентном "сэндвич" методе ИФА с использованием моноспецифической сыворотки к иммуноглобулинам М молозива, осуществление способа требует затрат времени более 5 ч. Результаты исследований представлены в табл. 1.

Как видно из вышеприведенной таблицы, в пораженных четвертях вымени коров при заболевании маститом, отмечается увеличение в молоке и молозиве количество иммуноглобулинов класса М в 1,9-3,6 раза по сравнению с секретом молочной железы от здоровых коров и из непораженных четвертей.

Результаты определения уровня общих иммуноглобулинов включающих классы: А, М и γ, в пробах молока и молозива коров представлены в табл. 2 (мг/мл).

Результаты определения уровня общих иммуноглобулинов в пробах молока и молозива от здоровых и больных маститом коров (мг/мл).

Как видно из таблицы, в пораженных четвертях вымени коров при мастите количество общих иммуноглобулинов повышается относительно секрета вымени здоровых коров в 1,5-2,1 раза.

Специфичность обеих методов проверяли путем исследования секрета вымени от этих коров бактериологическим и цитологическим методами, являющимися основными при диагностике мастита коров.

Учитывая данные литературы и наших исследований о том, что мастит коров в послеродовый период наиболее часто возникает в первые дни после отела и с целью профилактики заболеваний телят, достоверность обеих методов проверяли именно в эти важные для профилактики и лечения сроки (1-3 дни).

Результаты исследований представлены в табл. 3.

Результаты исследования проб молозива коров иммуноферметными к цито-бактериологическими методами.

Как видно из вышеприведенной таблице:
Наибольшей достоверностью обладает предложенный метод конкурентного МФА (по сравнению с базовым).

В первый день после отела иммуноферментная диагностика менее достоверна так как в молозиве отмечается физиологическое увеличение иммуноглобулинов.

Более достоверная диагностика предложенным методом объясняется тем, что она основана на определении общих иммуноглобулинов, включающих классы А, М и γ. 80% общих иммуноглобулинов молозива составляют иммуноглобулины класса γ . Это иммуноглобулины, поступающие из кровяного русла в молочную железу, а именно глобулины кл. М синтезируются плазмоцитами и секреторным эпителием тканей молочной железы. Согласно литературным данным и нашим исследованиям на раздражающее действие патогенного агента в молочной железе первично происходит повышение иммуноглобулинов кл. γ , которое в последствии сопровождается повышением уровня иммуногл. кл. М, а при стафилококковых инфекциях клеточная реакция, а следовательно и синтез иммуногл. кл. М замедлены.

Разработанная методика иммуноферментного анализа диагностики послеродового мастита коров заключается в определении общих имуноглобулинов молозива методом конкурентного иммуноферментного анализа (ИФА), основанного на конкуренции меченых пероксидазой хрена кроличьих антител против иммуноглобулинов молозива коров за связанный с полистеролом планшет и антиген, находящийся в растворе.

Методика проведения анализа:
- В лунки планшета вносят по 0,15 мл антигена (иммуноглоб. молозива) и сорбируют в течение 2-х ч в термостате при 37^оС;
- промывка планшет в течении 2-3 мин промывочным раствором;
- Внесение в лунки стандартов 1 и 2 (для 2-го и 3-го дней после отела) по 0,05 мл в двух повторах;
- Внесение по 0,04 мл разведенных в 100 раз фосфатно-буферной смесью образцов молозива в остальные лунки;
- Внесение во все лунки 0,05 мл рабочего раствора конъюгата;
- Шуттелировать 20-25 мл планшет;
- Отмывка планшета 2-3 мин;
- Внесение во все лунки 0,1 мл раствора субстрата;
- Шуттелировать - 15-20 мин.

Учет результатов: На фотометре типа Мультискан или Унискан при длине волны 540 нм.

У коров диагностируют мастит в следующих случаях:
1. Если средняя оптическая плотность образцов молока (молозива) из всех четвертей вымени коровы, взятых на второй день после отела, меньше или равняется оптической плотности стандарта второго дня;
2. Если оптическая плотность образца молозива, хотя бы в одной из четвертей вымени коровы меньше или приближается к оптической плотности стандарта второго дня, а в других четвертях вымени значительно больше;
3. Если среднее значение оптической плотности образцов молока (молозива) коровы, взятые на второй день после отела, превышает оптическую плотность стандарта второго дня, и среднее значение оптической плотности четырех образцов, взятых на третий день, превышает оптическую плотность стандарта третьего дня, то такая корова считается здоровой.

4. Больной считается корова, если среднее значение оптической плотности образцов молозива из всех четвертей вымени коровы, взятых на третий день после отела, меньше или равняется оптической плотности стандарта третьего дня.

Таким образом, предложенный метод диагностики, по сравнению с базовым более специфичен, на его постановку требуется на два часа меньше времени, т. к. базовый вариант осуществляется более чем за 5,5 ч; более прост в постановке, и при его постановке затрачивается меньше реактивов.

Кроме того, предлагаемый способ позволяет определить уровень общих иммуноглобулинов, включая и иммуноглобулины кл. М. (56) Карякина С. П. Методы диагностики мастита, биохимические показатели, биологическая ценность молозива и молока коров в послеродовом периоде. Автореферат на соискание ученой степени кандидата вет. наук. М. , 1988, с. 22.

Использование: в ветеринарии. Сущность изобретения: способ диагностики мастита коров путем определения иммуноглобулинов в молоке и молозиве на 2 - 3 день после родов и при увеличении уровня иммуноглобулинов в 1,5 - 2 раза диагностируют мастит. 3 табл.

СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ МАСТИТА КОРОВ путем определения иммуноглобулинов в молоке и молозиве, отличающийся тем, что, с целью повышения точности, упрощения и ускорения способа при диагностике мастита в послеродовой период, определяют общий уровень иммуноглобулинов на 2 - 3 день после родов и при увеличении уровня иммуноглобулинов в 1,5 - 2 раза диагностируют мастит.