ФЕРМЕНТНЫЙ ПРЕПАРАТ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ ДЛЯ ОФТАЛЬМОЛОГИИ Российский патент 1994 года по МПК A61K37/48 

Изобретение относится к созданию нового лекарственного препарата протеолитического действия, способного избирательно разрушать некротизированные ткани. Препарат может найти применение, в частности, в офтальмологии.

Цель изобретения - использование в офтальмологии препарата протолизин, который может быть получен из коммерческого препарата протосубтилин по следующей схеме:
- растворение протосубтилина в буферном растворе или дистиллированной воде при рН 6,2-7,5 с последующим добавлением в ферментный раствор 0,1-0,5% CaCl₂ для стабилизации металлопротеиназы и коагуляции балластных белков, отделение осадка центрифугированием;
- обессоливание раствора протосубтилина методом гель-фильтрации на любом подходящем сорбенте, например сефадексе G-25;
- ионообменная хроматография обессоленного ферментного раствора на карбоксиметилцеллюлозе с целью разделения ферментативного комплекса протосубтилина;
- концентрирование протеолитической фракции методом ультрафильтрации до содержания протеиназы в концентрате 8-11 ед/мл;
- осаждение ацетоном при рН 8,2-8,4, отделение осадка центрифугированием;
- растворение осадка в дистиллированной воде, взятой в количестве, необходимом для получения ферментного раствора с активностью 11-14 ед/мл;
- фильтрация через стерилизующий фильтр;
- лиофилизация.

Протолизин представляет собой белый или светло-бежевый порошок, растворимый в воде и изотоническом растворе хлорида натрия. Растворы протолизина наиболее устойчивы при рН 7,0-8,0 и температуре 5 - 10^оС. Оптимальные условия действия протолизина: температура 50^оС, рН 7,0-7,5. Ингибиторы - ионы тяжелых металлов, металлохелатные агенты. Изоэлектрическая точка - 8,3, молекулярная масса активного белка протолизина - 30,5-34,0 кДа.

Установлено, что протолизин катализирует гидролиз пептидных связей, образованных аминогруппами гидрофобных аминокислот и не действует на пептидные связи, образованные карбоксильными группами гидрофобных аминокислот. Препарат активно расщепляет белки, содержащие ароматические аминокислоты. Протеолитическая активность протолизина не ниже 1 ПЕ/мг, удельная активность при 37^оС составляет 3,5-4,2 ПЕ/мг белка. Протолизин расщепляет вязкие секреты, экссудаты, омертвевшие участки тканей, фибринозные образования. Препарат служит эффективным средством лечения больных с внутриглазными кровоизлияниями, помутнениями стекловидного тела травматической и увеальной этиологии.

Протолизин выпускают в герметически закрытых флаконах по 10 ПЕ. Раствор препарата готовится непосредственно перед использованием. Протолизин может быть введен субконъюнктивально, в виде инстилляций, с помощью электрофореза и фонофореза. Побочных действий у препарата не обнаружено.

Терапевтический эффект протолизина при лечении больных с гемофтальмом был изучен по сравнению с препаратами трипсин (из тканей животных) и фибринолизин (из крови человека). Известно, что указанные препараты используются в офтальмологической практике как тромболитическое средство при кровоизлияниях в переднюю камеру глаза, а также при заболеваниях роговой оболочки (Машковский М.Д. Лекарственные средства. Пособие по фармакотерапии для врачей. - Издание одиннадцатое стереотипное. - М.: Медицина, 1988. - ч. 2). Препараты применялись в виде субконъюнктивальных инъекций. Для этого использовали свежеприготовленные 0,25%-ные растворы препаратов. После анестезии конъюнктивальной полости 0,5%-ным раствором дикаина по конъюнктиву вводили 0,3 мл раствора препарата. Инъекции проводили через 24-48 ч. Результаты исследований представлены в табл. 1. Критерием оценки служили следующие показатели: появление рефлекса с глазного дна, степень повышения остроты зрения, сокращение сроков клинического выздоровления. Результаты клинического испытания протолизина у больных с гемофтальмом показали более высокую эффективность этого препарата по сравнению с трипсином и фибринолизином. Протолизин более устойчив в растворе. При температуре не выше 10^оС он сохраняет свою терапевтическую активность в течение 4-5 сут, а растворы трипсина и фибринолизина - лишь в течение 12 ч.

Клинические испытания препарата протолизин при лечении больных с кровоизлияниями и помутнениями стекловидного тела показали эффективность применения этого препарата методом фонофореза. Использовались следующие виды обследования больных: определение остроты и поля зрения, исследования в проходящем свете, офтальмоскопия, определение порога электрической чувствительности по фосфену, эхография. Наблюдаемые больные были разделены на 3 группы. В первую группу входили больные (34 человека, 35 глаз), у которых фонофорез протолизина с активностью 0,5 ПЕ/мл применялся в виде самостоятельного метода лечения. Вторая группа в составе 23 больных (23 глаза) получала фонофорез протолизина в сочетании с другой комплексной терапией. Третью группу (контрольную) составили 21 больной (21 глаз), которым лечение проводилось в виде комплексной общепринятой терапии без применения фонофореза протолизина. Критерием оценки эффективности проводимого лечения служили сроки рассасывания кровоизлияния или помутнения стекловидного тела (в койко-днях), повышение остроты зрения, сокращение длительности пребывания больного в стационаре. Фонофорез протолизина проводили, используя ультразвук частотой 880 кГц, интенсивностью 0,2 Вт/см², длительностью 5 мин. Курс состоял из 6-12-ежедневных сеансов в зависимости от состояния глаза.

Комплексное общепринятое лечение включало применение антибиотиков, сульфаниламидных препаратов, осмо-, аутогемо-, тканевую и витаминную терапию, специфическую гипосенсибилизирующую терапию.

Сравнение результатов лечения в трех группах больных свидетельствует о том, что лучшие результаты наблюдались при использовании фонофореза протолизина в комплексе с другими видами общепринятой рассасывающей терапии (табл. 2).

Повышение остроты зрения на 0,2-0,9 после лечения больных этой группы достигнуто на 14 из 23 глаз, т.е. в 60,8% (табл. 3).

Применение фонофореза протолизина в комплексе с общепринятыми средствами консервативной терапии позволило проводить лечение в минимальные сроки - 10,9±0,8 дня у больных с кровоизлияниями в стекловидное тело и 17,2± 0,4 дня у больных с помутнениями стекловидного тела. Использование фонофореза протолизина в качестве самостоятельного метода лечения больных также приводит к сокращению сроков лечения больных в случае кровоизлияний в стекловидное тело с 18,1± 0,8 дня (для больных контрольной группы) до 14,4±0,9 дня, а в случае помутнения стекловидного тела с 22,7±0,6 до 20,9±0,3 дня.

Результаты проведенных клинических испытаний позволяют рекомендовать с целью повышения эффективности лечения включение фонофореза протолизина в комплексную терапию кровоизлияний и помутнений стекловидного тела больных, которым показано нехирургическое лечение.

Протолизин хорошо переносится больными, не обладает раздражающим действием, не разрушает тканей в месте введения, что свойственно протеиназам животного происхождения.

Протолизин обладает хорошим латальным действием, т.е. при введении в глаз действует лишь на девитализированные ткани (гемофтальм, спайки, гной). В отличие от протолизина трипсин и фибринолизин способны разрушать и здоровые ткани.

Протолизин хорошо совместим с антибиотиками и кортикостероидами.

Изобретение относится к области офтальмологии и может быть использовано в качестве средства лечения больных с внутриглазными кровоизлияниями и помутнениями стекловидного тела травматической и увеальной этиологии. Препарат представляет собой высокоочищенный препарат пептидил-пептид гидролазы (КФ 3.4.24.4), полученный из коммерческого препарата протосубтилин при использовании ионообменной хроматографии на карбоксиметилцеллюлозе. Протолизин - это белый порошок, растворимый в воде и изотоническом растворе натрия хлорида. Оптимальные условия действия: температура 50°С, pH 7,0 - 7,5. Ингибиторы: ионы тяжелых металлов, металлохелатные агенты. Растворы протолизина наиболее устойчивы при pH 7,0 - 8,0 и температуре 5 - 10°С. Протеолитическая активность препарата при 37°С составляет 3,5 - 4,2 ПЕ/мг белка. Препарат выпускают в герметически закрытых флаконах с дозировкой по 10 ПЕ, он может быть введен субконъюнктивально, в виде инстилляций, с помощью электрофореза и фонофореза, прошел клинические испытания и показал более высокую эффективность по сравнению с трипсином и фибринолизином. 3 табл.

ФЕРМЕНТНЫЙ ПРЕПАРАТ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ ДЛЯ ОФТАЛЬМОЛОГИИ, выделенный из культуры Bacilbis subtilis, характеризующийся тем, что он способен катализировать гидролиз пептидных связей, образованных аминогруппами гидрофобных аминокислот, проявляет специфическую активность при рН 7,0 - 7,5 и температуре 50^oС, наиболее стабилен при рН 7,0 - 8,0 и температуре не выше 20^oС, имеет молекулярную массу протеиназы 80,5 - 34,0 кДа и изоэлектрическую точку 8,3, ингибируется ионами тяжелых металлов и металлохелатными агентами.